大鼠脊髓星形胶质细胞原代培养及腺病毒感染细胞.pptx

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,#,（一）大鼠脊髓星形胶质细胞的原代培养,（二）腺病毒感染细胞,（一）大鼠脊髓星形胶质细胞的原代培养,1,、实验前期准备,2,、脊髓星形胶质细胞的分离,3,、脊髓星形胶质细胞的培养,实验前期准备,：,实验器械的高压灭菌,新生鼠的购买,培养瓶的包被,（细胞培养前,1-2 h,，培养瓶用,0.1,多聚赖氨酸,包被，置,5,C02,培养箱中，使用前用,DMEM/F12,培养基冲洗干净，吸尽所有多余的,DMEM/F12,培养基后备用于种板）,脊髓星形胶质细胞的分离,1,、取新生乳鼠,6,只，,75,乙醇皮肤消毒。无菌条件下剪刀断头，打开脊椎后取出脊髓组织并置于盛有,DMEM/F12,培养基,的培养皿中反复冲洗，尽可能洗掉可能附着的表面血细胞。,2,、使用眼科镊细致的剥离皮层表面蛛网膜，并取出脊髓，在该过程中可适当撕开软脊膜组织一并去掉脊髓组织深面的血管，随后使用,冰预冷,DMEM/F12,反复冲洗。,3,在玻璃培养皿中用眼科剪将脊髓组织剪碎致直径,0.3 mm,左右小块，在剪碎过程中,避免挤压脊髓组织,，加入无菌,3 ml 0.25,胰酶，置,37,细胞培养箱中消化,30 min,至浑浊状。,4,加入,2-3 ml,含,10,胎牛血清的,DMEM/F12,培养基终止消化，静置,3 min,后先用吸管吸去多余液体，再用吸管轻轻地吹打,3,次，收集细胞悬液，经,200,目的不锈钢网滤过除去杂质,，过滤后的细胞悬液移入,10 ml,无菌离心管中，然后,800 rpm,离心,7 min,。,5,弃去上清液，然后每管加入,2-3 ml,含,10,胎牛血清的,DMEM/F12,培养基，接种于培养瓶中，,37,、,5,CO2,培养箱内孵育,60 min,，进行,差速粘附贴壁,处理，以去除成纤维细胞。,6,轻轻翻转培养瓶，吸出细胞悬液，种于预先涂有多聚赖氨酸的培养瓶；继续在,CO2,培养箱内培养，接种,2-3 d,后更换新的无菌培养基，隔,2-3 d,换新培养液,1,次。生长,8-10 d,待细胞融和后，置于,37,恒温摇床机中，,180 rpm,，,14-16 h,。,7,丢弃上清液，收集经过摇床震荡后的贴壁细胞，加新鲜培养液继续培养，即可得纯度较高的星形胶质细胞。,脊髓星形胶质细胞的培养,细胞换液,对于贴壁细胞，首先应先吸除培养瓶中旧培养基，用,PBS,洗,23,次，补加入新培养基后继续培养或实验。,细胞传代,对于贴壁细胞，首先应先吸除培养瓶中旧培养基，用,PBS,洗,23,次，,50ml,培养瓶加入胰酶消化液约,1ml,，晃动使消化液铺均匀，置,37,度培养箱约,2-5,分钟，,镜下见细胞收缩变圆或少数脱落后,，轻轻振动瓶底使细胞全部脱落，加入,2-3ml,完全培养基后，轻轻吹打，收集细胞至离心管，,1000,转,/min,离心,5min,，弃上清，加培养液，轻轻吹打成细胞悬液，按照,1,：,2,或,1,：,3,的比例传代至无菌培养瓶内，加入培养基后继续培养或实验。,（二）腺病毒感染细胞,确定腺病毒的最佳感染滴度,腺病毒感染细胞,确定腺病毒的最佳病毒滴度（,96,孔板）,准备细胞：,8000,10000,个细胞,/,孔接种于,96,孔板,病毒稀释：在离心管中用维持液将病毒液作连续,10,倍的稀 释，从,10-1,到,10-7,病毒感染：将稀释好的病毒接种到,96,孔培养板中，每一稀释度接种一纵排共,8,孔，每孔接种,100ul,；设正常细胞对照,(,两纵排,),只加维持液,100ul,。,细胞培养：将培养板放置于,CO2,培养箱（,375%CO2,），培养,5-7,天,测定结果：取出培养板，显微镜下观察细胞病变，并用,Reed-Muench,法 计算病毒的最佳滴度,腺病毒感染细胞,准备细胞,准备病毒,感染细胞,谢 谢,！,