手性固定相法与柱前衍生化法分离分析奥美拉唑对映体.doc

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本科毕业论文

题 目：手性固定相法和柱前衍生化法
分离分析奥美拉唑对映体
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****大学学士学位论文 摘要

摘 要

含手性因素的化学药物的对映体在人体内的药理活性、代谢过程及毒性存在显著的差异。手性药物的生物活性与其立体构型密切相关。由于手性药物的不同对映体对生物体的生理活性不同，所以合成和分离出纯净的对映体就是人类梦昧以求的事业。本文采用手性固定相法和柱前衍生化法对质子泵抑制剂奥美拉唑对映体进行了分离，并比较了两种方法的各自最优分离条件。
1. 手性固定相法分离奥美拉唑对映体
手性固定相高效液相色谱法对质子泵抑制剂（奥美拉唑）对映异构体进行分离分析方法的研究，以CHIRALCEL OD-RH为色谱柱，考察了流动相组成、比例、流速和柱温等因素对拉唑类手性药物对映体分离分析的影响，确定了各药物的最佳分离条件，为此类药物的研究开发及质量控制提供技术支撑。结果：在磷酸氢二钠(20 mmol/L, pH5.5)-乙腈(40:60, v/v)；流速为0.4 mL/min；柱温为15℃；检测波长为290 nm的色谱条件下，奥美拉唑对映体得到部分分离(Rs: 1.0)。
2. 柱前衍生化法分离奥美拉唑对映体
同时本文还采用了柱前衍生化法考察了奥美拉唑对映体最优分离条件。以(S)-(+)-樟脑磺酰氯作柱前手性衍生化试剂，对奥美拉唑对映体进行了手性分离研究。实验考察了衍生化时间、试剂用量、流动相组成及其pH等因素对分离的影响。在Dikma Diamonsil C18色谱柱上，流动相为醋酸铵溶液（10 mmol/L, pH7.5）-异丙醇（75∶25, v/v），流速为0.5 mL/min的色谱条件下，奥美拉唑衍生物达到基线分离，分离度为1.72。

关键词：高效液相色谱法；奥美拉唑；手性固定相法；柱前衍生化法

****大学学士学位论文 Abstract

Abstract

As we know, Chemical drug enantiomers, which contain chiral factors, have shown significant differences among the pharmacological activity, metabolic processes and toxicity in human body. Bioactivity of chiral drugs is closely related to the stereo structures. Because of the different pharmacological activity among the different chiral drug enantiomers in human body, it has become human’s dream that synthesizing and separating pure enantiomers. In this thesis, both Chiral Stationary Phase (CSP) method and Chiral Derivative of Reagent (CDR) method were developed for the chiral separation of omeprazole enantiomers. At the same times, the respective optimum separation condition of the above two methods as well as a contrast about them were founded.
1. Chiral separation of omeprazole enantiomers by high performace liquid chromatography with chiral stationary phase
In this thesis, separations of the proton pump inhibitors (PPIs) (omeprazole) was studied by high-performance liquid chromatography (HPLC) using chiral stationary phase .To CHIRALCEL OD-RH for chromatographic column, the factors affecting the resolution such as the mobile phase composition, scale, velocity, and the oven temperature were investigated. The study provided a theoretical guidance for the development of new optical purity PPIs and a method to identify various drug best separation conditions. Rult: Under the optimized conditions, 20 mmol/L, pH6.5, Na2HPO4-acetonitrile(40:60, v/v); at flow rate of 0.4 mL/min; the column temperature is 15℃; detected wavelength is 290 nm; omeprazole enantiomers got partial separated with 1.0 of the resolution.
2. Chiral separation of four PPIs by high performance liquid chromatograph with precolumn derivatization
The chiral separation of omeprazole was studied with high performance liquid chromatograph (HPLC). The (S)-(+)-camphorsulfonyl chloride as the precolumn derivating agent, the effects of the derivatizing time, the amount of (S)-(+)-camphorsulfonyl chloride, the composition and pH of the mobile phase on the enantioseparation were investigated. The result showed that the Dikma Diamonsil C18 column and ammonium acetate (10mmol/L, pH7.5)-isopropyl alcohol (75∶25, v/v) as eluent at a flow rate of 0.5 mL/min are suitable for the separation. The resolution was 1.72.

Keywords: high performance liquid chromatography; omeprazole; Chiral Stationary Phase (CSP); Chiral Derivative of Reagent (CDR)

****大学学士学位论文 目录

目 录

引 言 1
第一章 前言 3
1.1 手性和手性分子 3
1.1.1 手性中心及其种类 3
1.1.2 手性化合物 3
1.2 手性药物 4
1.2.1 质子泵抑制剂（PPIs） 5
1.3 手性药物的药理作用及特点 6
1.4研究手性药物的必要性 6
1.5 手性药物研究的现状和进展 8
1.6手性化合物的分离分析方法 9
1.6.1高效液相色谱法 9
1.7本课题研究的意义和内容 13
第二章手性固定相法分离分析奥美拉唑对映体 14
2.1实验方法 14
2.1.1仪器、试剂和样品 14
2.1.2溶液的配置 15
2.1.3 色谱条件 15
2.2实验结果与讨论 16
2.2.1 柱温对分离分析的影响 16
2.2.2 流速对分离分析的影响 16
2.2.3有机改性剂的种类和浓度对分离分析的影响 17
2.2.4 缓冲溶液的种类对分离分析的影响 17
2.2.5 缓冲溶液的pH对分离分析的影响 17
2.3 手性分离机理的探讨 18
2.4 小结 19
第三章 柱前衍生化高效液相色谱法分离奥美拉唑 20
3.1 实验方法 20
3.1.1 仪器、试剂和样品 20
3.1.2 溶液的配置 21
3.1.3 衍生化反应 21
3.1.4 色谱条件 21
3.2 实验结果与讨论 22
3.2.1 有机改性剂种类和浓度的选择 22
3.2.2 缓冲溶液种类和浓度的选择 22
3.2.3 缓冲溶液pH的选择 22
3.2.4 柱温的选择 23
3.3 小结 24
第四章 结论 25
4.1主要研究工作结论 25
4.2手性固定相法及柱前衍生化法的比较 25
4.2.1手性固定相法的特点 25
4.2.2柱前衍生化法的特点 26
致谢 27
附录 31

****大学学士学位论文 引言

引 言
人的左、右手互为实物与镜像，但彼此不能重合，手的这种特征在其他物质中也广泛存在，因此人们将一种物质不能与其镜像重合的特征称为手性或手征性。具有这种特征的分子称为手性分子，手性分子都具有旋光性。
手性是自然界的基本属性，也是生命系统中最重要的属性之一。手性药物，是指药物的分子结构中存在手性因素，而且由具有药理活性的手性化合物组成的药物，其中只含有有效对映体或以有效对映体为主。许多对映体之间的药理毒理活性及体内过程存在差异。手性药物对映体的药物动力学参数是有差异的，手性药物对映体代谢途径具有立体选择性。绝大多数的药物由手性分子构成，两种手性分子可能具有明显不同的生物活性。药物分子必须与受体（起反应的物质）分子几何结构匹配，才能起到应有的药效，就如右手只能带右手套一样。因此，往往两种异构体中仅有一种是有效的，另一种无效甚至有害。
当一个手性药物进入生命体时，它的两个对映异构体通常会表现出不同的药物活性。对于手性药物，一个异构体可能是有效的，而另一个异构体可能是无效甚至是有害的。手性制药就是利用化合物的这种原理，开发出药效高、副作用小的药物。在临床治疗方面，服用对映体纯的手性药物不仅可以排除由于无效(不良)对映体所引起的毒副作用，还能减少药剂量和人体对无效对映体的代谢负担，对药物动力学及剂量有更好的控制，提高药物的专一性。因而具有十分广阔的市场前景和巨大的经济价值。
自从1992年美国FDA开始要求手性药物以来，手性药物在研发的新药中所占比例逐年增加。据统计，目前世界上正在开发的1200种药物中，有820种属于手性药物，其中612种以单一对映体在开发，占51%，204种以消旋体在开发，占17%，可见正在开发中的药物有三分之二是手性的。手性和手性技术已成为目前的重大课题和关注的热点，手性药物已成为国际新药研究与开发的新方向之一。因此，在西方发达国家，无论是学术界还是工业部门均投入大量的人力和物力，从事手性科学和技术，以及手性药物和农药的基础研究和开发。
目前国内外手性化合物的生产一般通过手性合成和手性拆分两大途径。虽然，手性合成可以直接得到纯度较高的光学纯物质，但其产率普遍较低。相反，若采用恰当的手性拆分技术，就可以得到较高产量的对映异构体。近几十年来，人们对高效液相色谱分离对映体的兴趣与日俱增，解决不同类型手性化合物的分离已成为色谱发展的前沿领域。本文采用手性固定相法和柱前衍生化法对质子泵抑制剂奥美拉唑对映体进行了分离，并比较了两种方法的各自最优分离条件。

2

****大学学士学位论文 第一章 前言
第一章 前言
1.1 手性和手性分子
人的左、右手互为实物与镜像，但彼此不能重合，手的这种特征在其他物质中也广泛存在因此人们将一种物质不能与其镜像重合的特征称为手性(chirality)或手征性。具有这种特征的分子称为手性分子，手性分子都具有旋光性。
1.1.1 手性中心及其种类
如果分子中的手性是由于原子和基团围绕某一点的非对称排列而产生的，这个点就是手性中心(chiral center)。将与四个不同基团相连的碳原子称为不对称碳原子(asymmetric carbon)或手性碳原子(chiral carbon)，常用*标记。手性碳原子就是一个手性中心。其他原子当它与四个不同的原子或基团相连时也可以成为手性中心。其它原子如S, P, N, As等，当它们和四个不同的基团相连时也应有光活性异构体存在。拉唑类药物的手性中心为S，其中一对孤对电子相当于第四个基团。
决定一个分子是否有手性，主要是看分子实体和其镜像是否重合，有些分子虽然不含不对称原子，但在分子中存在一个轴，通过轴的两个平面在轴的两侧有不同的基团时，也会产生实体与镜像不能重合的对映体。称这类旋光异构体为含手性轴(chiral axle)的旋光异构体。
有些分子虽然不含有手性原子，但分子内存在一个扭曲的面，从而使分子呈现一种螺旋状的结构，由于螺旋有左手螺旋和右手螺旋，互为对映体，所以该类分子也会表现出旋光性。这种因分子内存在扭曲的面而产生的旋光异构体称为含手性面(chiral plane)的旋光异构体。
1.1.2 手性化合物
分子结构中引入手性中心后，得到的一对互为实物镜像的对映体。这些对映异构体的理化性质基本相似，仅仅是旋光性有所差别。构成手性关系的分子之间，把一方叫做另一方的“对映异构体”，它们互为“镜像”，是不能完全叠合在一起的。对映体的镜像关系如下图1所示：

图1-1 手性结构图
Figure 1-1 The structures of chirality

手性物质具有一特殊性质——旋光性。将纯净的手性物质的晶体，或是将纯净的手性物质配成一定浓度的溶液，用平面偏振光照射，通过手性物质的偏振光平面会发生一定角度的旋转，这称为旋光性。因此，利用旋光性可以检验物质的手性，但要注意物质的纯度。手性是自然界的本质属性之一。作为生命活动重要基础的生物大分子，如蛋白质、多糖、核酸和酶等，几乎全是手性的，这些大分子在体内往往具有重要生理功能。目前所用的药物多为低于50个原子组成的有机小分子[1]，很大一部分也具有手性。含手性因素的化学药物的对映体在人体内的药理活性、代谢过程及毒性存在显著的差异。当前手性药物的研究已成为国际新药研究的主要方向之一[2]。
1.2 手性药物
手性药物（chiral drug），是指药物的分子结构中存在手性因素，而且由具有药理活性的手性化合物组成的药物，其中只含有有效对映体或以有效对映体为主。
在许多情况下，手性药物的一对对映体在生物体内的药理活性、毒理、吸收、分布、代谢等方面存在显著的差异。手性药物对映体之间的活性差异可以分为三类：
1）对映体之间有相同或相近的某一活性；
2）对映体之间有不同性质的药理活性；
3）一个对映体有显著活性但另一对映体活性很低或无此活性，甚至具有毒副作用。
1.2.1 质子泵抑制剂（PPIs）
质子泵抑制剂(proton pump inhibitor，PPIs)即H+/K+-ATP酶抑制剂，主要用于治疗十二指肠溃疡，胃溃疡等与胃酸分泌有关的疾病，具有起效快、疗效强和作用持久等特点。质子泵抑制剂有相似的分子结构，分子中存在一个手性硫原子中心，此类药物的药效学和药动学表现出对映体差异。
质子泵抑制剂为苯并咪唑类衍生物，特异性和非竞争性的作用于H+/K+-ATP酶，能抑制组胺、进食等多种刺激引起的酸分泌，具有起效快、作用强和持续时间长的特点，是治疗酸相关性疾病的首选药物，在根除幽门螺杆菌(Helicobacter pylori，Hp)感染联合治疗中发挥重要作用。目前对质子泵抑制剂的手性分离报道主要为分离泮托拉唑，奥美拉唑，兰索拉唑和雷贝拉唑对映体的手性固定相HPLC法[3-5]，手性固定相SFC[6]，鲜有关于泰妥拉唑的手性分离方法的研究报道。
奥美拉唑，化学名称：5-甲氧基-2-{[（4-甲氧基-3,5-二甲基-2-吡啶基）-甲基]-亚磺酰基}-1H-苯并咪唑，别名：安胃哌唑;奥美拉唑;奥咪拉唑;甲氧磺唑;沃必唑;渥米哌唑;亚枫咪唑 ,洛赛克。它是一种新的H+/K+-ATP酶抑制剂，直接作用于胃壁内质子泵，用于治疗胃及十二指肠溃疡和反流性食管炎，与传统的抗酸剂和H2受体阻断剂相比，具有疗效好、起效迅速等优点。
作用与用途：①消化性溃疡出血、吻合口溃疡出血。②应激状态时并发的急性胃黏膜损害，和非甾体类抗炎药引起的急性胃黏膜损伤；③亦常用于预防重症疾病（如 脑出血、严重创伤等）胃手术后预防再出血等；④全身麻醉或大手术后以及衰弱昏迷患者防止胃酸反流合并吸入性肺炎。
药理毒理：选择性地作用于胃粘膜壁细胞，抑制处于胃壁细胞顶端膜构成的分泌性微管和胞浆内的管状泡上的H+-K+-ATP酶的活性，从而有效地抑制胃酸的分泌，起效迅速，适用于胃及十二指肠溃疡，返流性食管炎和胃泌素瘤。由于H+、K+-ATP酶是壁细胞泌酸的最后一个过程，故本品抑酸能力强大，有强而持久的抑制基础胃酸及食物、五肽胃酸泌素所致的胃酸分泌的作用。 它不仅能非竞争性抑制促胃液素、组胺、胆碱及食物、刺激迷走神经等引起的胃酸分泌，而且能抑制不受胆碱或H2受体阻断剂影响的部分基础胃酸分泌，对H2受体拮抗剂不能抑制的由二丁基环腺苷酸（DcAMP）刺激引起的胃酸分泌也有强而持久的抑制作用。显效快，可逆，且无H2受体拮抗剂诱发精神方面的副作用。本品对胃蛋白酶分泌也有抑制作用，对胃黏膜血流量改变不明显，也不影响体温、胃腔温度、动脉血压、静脉血红蛋白、动脉氧分压、二氧化碳分压及动脉血pH。有强而持久的抑制基础胃酸及食物、五肽胃酸泌素所致的胃酸分泌的作用。显效快，可逆，且无H2受体拮抗剂诱发精神方面的副作用。用于胃及十二指肠溃疡、反流性或糜烂性食管炎、佐-埃二氏综合征等，对用H2受体拮抗剂无效的胃和十二指肠溃疡也有效。 用于胃及十二指肠溃疡、反流性或糜烂性食管炎、佐-埃二氏综合征等，对用H2受体拮抗剂无效的胃和十二指肠溃疡也有效。
1.3 手性药物的药理作用及特点
手性是自然界的基本属性，也是生命系统中最重要的属性之一。许多对映体之间的药理毒理活性及体内过程存在差异。手性药物对映体的药物动力学参数[7]是有差异的，手性药物对映体代谢途径液具有立体选择性[8]。
手性分析分离是进行手性药物研究的前提，手性拆分是极具挑战性的课题。高效液相色谱手性固定相法拆分手性化合物，在近20年来得到了迅速的发展，其中多糖类手性固定相是应用最为广泛、手性拆分能力最强的一类。本实验室建立的高效液相色谱法，采用商品化CHIRALCEL OD-RH手性色谱柱以水、甲醇、乙腈为流动相，在反相模式下实现了拉唑类对映体的手性拆分。
1.4研究手性药物的必要性
当一个手性药物进入生命体时，它的两个对映异构体通常会表现出不同的药物活性。对于手性药物，一个异构体可能是有效的，而另一个异构体可能是无效甚至是有害的。手性制药就是利用化合物的这种原理，开发出药效高、副作用小的药物。在临床治疗方面，服用对映体纯的手性药物不仅可以排除由于无效(不良)对映体所引起的毒副作用，还能减少药剂量和人体对无效对映体的代谢负担，对药物动力学及剂量有更好的控制，提高药物的专一性。因而具有十分广阔的市场前景和巨大的经济价值。
由于手性药物的不同对映体对生物体的生理活性不同，所以分离和合成出纯净的对映体就是人类梦昧以求的事业。但是大自然并没有给予我们现成的恩赐，只给我们人类一些提示,纯净的手性物质在大自然中含量有限，甚至极其稀有，人类知道了它们的用途，大量需要时，就得由人工合成，而工业合成的对映体，得到的是两种对映体的1:1混合物，即是外消旋体，目前对我们人类来说还有不少的合成和分离上的难题需要解决。
在天然和合成的药物中有许多手性化合物，其对映体的药理活性和毒性往往有很大差异，有时甚至相反。因此手性药物的分离测定，对研究手性药物的体内药动力学过程、确定药动力学参数、药理和毒理作用机制以及手性药物质量控制等都具有重要的意义[9]。
首先，手性药物两对映体间的药效差异可能存在以下六种不同的情况：(1)一个对映体具有显著的活性，而另一个对映体无活性或活性很低。如抗生素氧氟沙星(Ofloxacin)的活性主要由S-(-)型异构体产生，而R-(+)型异构体几乎无药理活性。b-受体阻滞剂普萘洛尔(Propranolol)，其S-型异构体的活性是R-型异构体的100多倍。(2)对映体之间具有相同或相近的活性。抗凝血药华法林(Warfarin)以外消旋体供药，研究发现其S-型异构体的抗凝血作用与R-型异构体相差不大，所以实际抗凝血效力相似。目前，已报道属于此类的手性药物有：抗组织胺药异丙嗪(Promethazine)、平喘药丙羟茶碱(Proxyphylline)、降眼压药噻吗洛(Timolo1)等。(3)两个对映体有着不同的药理作用。如丙氧芬(Propoxyphene)的(2S,3R)异构体是镇痛药，但其(2R,3S)异构体具有镇咳作用，现在两者已被成功拆分，分别作为右丙氧芬和左丙氧芬应用于临床；此类中有些药物的两个对映体虽然有不同的活性，但可起到互补作用。如镇痛新(Pentazocin)的左旋异构体产生镇痛及呼吸抑制作用，而右旋体却有镇静及增加出汗等副作用。此外，左旋体可使病人轻松愉快。右旋体却能使病人产生主观紧张意识，故临床上以外消旋体供药。(4)两个对映体的药理活性相反。扎考必利(Zacopride)的R-异构体为5-HT3受体拮抗剂，而S-异构体则为5-HT3受体激动剂。现已在临床上使用的高效利尿药依托唑林(Etozoline)，其左旋体有利尿作用，而右旋体却有抗利尿作用。(5)一个对映体有严重的不良反应。反应停(Thalidomide)曾作为妊娠反应的治疗药物在上世纪五、六十年代风行西方。但后来带来了灾难性后果，造成了服用此药的数千例妊妇的畸胎而震惊世界，有报道称[10]，虽然R-(+)异构体和S-(-)异构体都具有镇静止吐作用，但S-(-)异构体在体内代谢成(S)-N-邻苯二甲酰谷酰胺和(S)-N-邻苯二甲酰谷氨酸而有强致畸作用，但R-(+)异构体则是安全有效的。(6)以外消旋体给药有利的光学异构体。氨磺洛尔(Amosulalo1)是降压药，R-异构体为b受体阻滞剂，S-异构体为H2受体阻滞剂，这两个对映体分别从不同的途径降低血压，故以外消旋体给药更为有利[11]。
其次，手性物质在毒理方面也有多种形式。①毒性存在差异，如：D-青霉胺没有毒性，而L-青霉胺有毒性；②代谢造成毒理作用发生变化，如：S-与R-布洛芬在体内代谢后多转化为抑制肾环氧化酶，可加剧肾局部缺血，而发生毒副反应的是S-布洛芬。
再者，手性物质在吸收、分布、代谢以及排泄方面也存在选择性。(Ⅰ)手性物质分布时在转运方面有差异，如阿替洛尔(Atenolol)、索他洛尔(Stalol)、美托洛尔(Metoprolol)在细胞转运时不存在立体选择性，而艾司洛尔(Esmolol)、塞利洛尔(Celiprolol)和卡维地洛(Carvedilol)则存在明显的立体选择性；除转运外，与蛋白结合也存在速率、程度与种族的差异。(Ⅱ)代谢方面同样存在立体选择性。代谢一般都是由亚甲基氧化、叔胺氧化、硫化物氧化、酮基还原、双键还原等反应组成。可能是由于手性物质对代谢酶存在作用，结果在代谢速度、产物等方面都将存在显著差异。(Ⅲ)机体对各种手性物质的排泄也会因三维结构的差别而显著不同。这些一般都采用蛋白质、DNA电泳、HPLC等成熟的方法进行分析、鉴别[12]。
1.5 手性药物研究的现状和进展
由于诸多差异的存在，对手性药物的应用，应该注意不同异构体的药理作用，并最好以单一异构体的形式应用。事实表明，手性药物的研制和生产在临床上起着十分重要的作用。
在药理学上，服用手性药物可减少剂量和代谢负担，对药物动力学及剂量能进行更好的控制。在剂量设定时幅度更宽，反应较小；在剂量选择时，更有信心减少与其他药物的相互作用，提高活性并减少剂量，提高专一性，并降低有某对映体可能引起的副作用。对制药企业而言，生产手性药物可以节省资源，减少废料排放，降低对环境的污染。因此，近年来许多国家的药政部门对手性药物的开发、专利申请及注册开始作出相应的规定。1992年美国食品与药物监管局(FDA)的药物评价与研发中心(CDER)公布了光学活性药物的发展纲要[13]。此项政策要求药物发展商在新药的使用说明中必须明确量化每种对映异构体的药效作用和毒理作用，并且当两种异构体有明显的药效和毒理作用差异时，必须以光学纯的药品形式上市。FDA的决定大大促进了手性药物的研制和开发，使得世界药物市场中的药物销售类型发生了巨大的变化，手性药物的销售额正以迅猛的势头不断增长。在这一趋势下，出现了许多中小型企业纷纷提供手性中间体、手性技术服务、消旋体转化，即把已经上市的消旋体药物转换为单一异构体形式并提出新药申请，兴起了手性技术的潮流[14-15]。
手性药物对映体的分离测定已成为当今药学领域最热门的研究课题之一。建立快速、灵敏的药物对映体的分离测定方法，对研究手性药物的体内动力学过程、确定药动学参数、阐明药理毒理机制以及在手性药物的合成和质量控制方面具有重要的意义。
1.6手性化合物的分离分析方法
现代色谱分离技术在手性化合物对映体的分离与测定方面显示出巨大的优越[16]。常用的手性分离技术有：高效液相色谱法（HPLC）[17-19]、气相色谱法（GC）[20]、薄层色谱法（TLC）[21]、毛细管电泳法（CE）[22,23]、超临界流体色谱法（SFC）[24]等。这些手性色谱技术集分离测定于一体，可实现对映体的快速定性、定量分离甚至少量制备，并且可以实现在复杂基质中对映体的含量的测定。
1.6.1高效液相色谱法
高效液相色谱法（High Performance Liquid Chromatography \ HPLC）又称“高压液相色谱”、“高速液相色谱”、“高分离度液相色谱”、“近代柱色谱”等。高效液相色谱是色谱法的一个重要分支，以液体为流动相，采用高压输液系统，将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，在柱内各成分被分离后，进入检测器进行检测，从而实现对试样的分析。该方法已成为化学、医学、工业、农学、商检和法检等学科领域中重要的分离分析技术。高效液相色谱仪可分为“高压输液泵”、“色谱柱”、“进样器”、“检测器”、“馏分收集器”以及“数据获取与处理系统”等部分。
（一）高效液相色谱法的特点
高效液相色谱法有“三高一广一快”的特点：
①高压：流动相为液体，流经色谱柱时，受到的阻力较大，为了能迅速通过色谱柱，必须对载液加高压。
②高效：分离效能高。可选择固定相和流动相以达到最佳分离效果，比工业精馏塔和气相色谱的分离效能高出许多倍。
③高灵敏度：紫外检测器可达0.01 ng，进样量在μL数量级。
④应用范围广：百分之七十以上的有机化合物可用高效液相色谱分析，特别是高沸点、大分子、强极性、热稳定性差化合物的分离分析，显示出优势。
⑤分析速度快、载液流速快：较经典液体色谱法速度快得多，通常分析一个样品在15～30分钟，有些样品甚至在5分钟内即可完成，一般小于1小时。
此外高效液相色谱还有色谱柱可反复使用、样品不被破坏、易回收等优点，但也有缺点，与气相色谱相比各有所长，相互补充。高效液相色谱的缺点是有“柱外效应”。在从进样到检测器之间，除了柱子以外的任何死空间（进样器、柱接头、连接管和检测池等）中，如果流动相的流型有变化，被分离物质的任何扩散和滞留都会显著地导致色谱峰的加宽，柱效率降低。高效液相色谱检测器的灵敏度不及气相色谱。
（二）高效液相色谱法的分类
高效液相色谱法分离对映体可分为直接法和间接法[25]，前者可分为手性固定相法（CSP）[26]和手性流动相添加剂法（CMPA）[27]，后者又称手性试剂衍生化法（CDR）[28]。无论哪一种方法，都是以现代色谱分离技术为基础，引入不对称中心（或光学活性分子）。不同的是CSP和CMPA将其引入分子间，而CDR法则是将其引入分子内。引入手性环境使手性药物对映体间呈现理化特性的差异是手性分离的基础。直接法是对映体之一与手性固定相或手性流动相添加剂间发生分子间的三点作用（较稳定），另一对映体发生两点作用；形成暂时的非对映异构体的结合物质，通过洗脱分离。间接法又称为非对映体拆分法或柱前手性衍生化法对映体混合物在预处理中进行柱前衍生组成一对非对映体，依其理化性质的差异，在非手性柱上得以分离。
1、直接法
直接法能广泛适用于各类化合物，适于常见及生物样品的分析测定除非必须衍生化，否则无需高光学纯度试剂而且样品处理步骤简单，制备分离方便，定量分析的可靠性较高。样品有时也须作柱前衍生（但不一定是手性衍生化试剂），对样品结构有一定限制，其适用性不及普通高效液相色谱固定相那样广泛。
手性固定相法（chiral stationary phase, CSP）也就是所谓的手性柱法，是指将化合物键合到固定相表面，使对映体与键合的手性分子形成非对映体络合物，由于两者的结合能力不同而达到拆分[29]的目的。手性固定相法的工作原理主要是由Dalgleish[30]提出的“三点相互作用认别模型”。其特点是：使用方便，一般不需要高光学纯的手性衍生化试剂，制备分离便利，但通用性差，且手性柱价格昂贵。
手性固定相可分为两大类：一类是由小分子固定在硅胶载体上构成（刷型或Pirkle）；另一类是用光学聚合物固定在载体上制成，多孔硅胶的聚合物也可直接用作CSP，其中包括Okamoto[31]。多糖衍生物主要包括纤维素衍生物[32]、淀粉类、纤维索及糖贰键在1,4位相形成的线性聚合物[33]。纤维素及其衍生物用作CSP有三种方式：①做成凝胶颗粒直接装柱；②涂布在大孔载体如硅胶上，涂布量在20%～23%之间；③化学键合于硅胶表面。其中最为常用的是第二种方法，得到手性固定相柱效和稳定性较高，分离效果较好，由纤维素衍生物制备手性柱，许多已有商品出售。新的取代基因的引入，新的合成方法的确立，新的手性固定相的制备方法以及进一步的机理研究将会是纤维素及其衍生物手性固定相研究的新热点所在。
纤维素手性固定相是用不同方法将纤维素衍生物涂覆于大孔硅胶上而制得的。纤维素手性固定相的手性识别取决于聚合物螺旋型空穴“立体配合”包结作用，手性固定相的通道对芳环有较高的亲和力，进入空穴的正是溶质分子的芳环部分。此类固定相上得到成功分离的化合物大都含有苯基、羰基、羟基、磺酰基等。目前在这类固定相中，纤维素-三（3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯）即Chiracel OD应用较多，手性拆分能力高[34]。

图1-2 Chiral OD-RH手性固定相的结构
Fig1-2 the structure of chiral OD-RH
手性流动相添加剂法(Chiral Mobile Phase Additive, CMP)拆分法或手性洗脱法。它不必事先将样品制备成衍生物，而只须将手性剂加入流动相中。手性添加剂与样品所形成的各种手性络合物虽然不及CDR法所形成的衍生物那样牢固，但它所依据的手性识别作用和络合物的非对映异构体性质却基本相同。常用的CMPA有：环糊精(Cyclodextrins)类（主要是α-、β-和γ-环糊精及其衍生物）；手性离子对配合剂(Chiral Ion Pair Complex,CIPC)，如（+）-10-樟脑磺酸、奎宁和奎尼丁等；以及配位体交换型手性流动相添加剂(Chiral Ligand-exchange Complexes, CLEC)，其中手性配位体多为光活性氨基酸或其衍生物，再与二价金属离子形成螯合的配位化合物，以适当的浓度分布于流动相中，遇有药物消旋体时即可形成相应的非对映体配位化合物对，然后在正相柱或反相柱上完成拆分。
2、间接法
间接法可采用通用的非手性柱分离、通过衍生化可提高检测灵敏度、分离条件简单并且分离效果好。但是间接法要有可被衍生化的基团，高光学纯度的手性试剂，对映体衍生化的速率和平衡常数应一致，并且在衍生化和色谱过程不能发生消旋化。
手性衍生化试剂法（chiral derivative reagents, CDR），它是指对映体在分离前先与高纯度的衍生化试剂反应形成非对映体，再进行色谱分离测定。此种方法分离的是衍生物而不是原对映体。非对映体对在色谱系统中的差速迁移与下述因素有关：非对映体分子的手性结构；手性中心所连接的基团；色谱系统的分离效率包括溶质分子与固定相和溶剂之间的结合力，如氢键、偶极-偶极、电荷转移和疏水性等。反应产物间的构型差异越大，拆分就越容易。通常认为：两个手性中心间的最佳距离是2-4个原子，具有能形成氢键的极性基团，发生能稳定构型的分子内反应，手性中心区域有环系统或刚性结构，这些均可增加非对映体对衍生物的分离度。
此法要求：1.手性试剂及反应物在化学上和手性上都很稳定，其光学性在贮存中不发生改变；2.在衍生化反应和色谱条件下，试剂、手性化合物和反应产物不发生消旋化反应；3.衍生化反应生成的非对映体在色谱分离时应能显示高柱效；4.手性试剂应具有UV或荧光等敏感性结构，能使生成物具有良好的可检测性；5.手性化合物对映体的化学结构中应具有易于衍生化的基团，如氨基、羰基和疏基等[35,36]。
采用手性试剂衍生化法具有以下优点：①使用普通的色谱柱方法成本低，分离方法灵活（可以选择正相、反相以及梯度洗脱等技术），且易于优化；②由于手性衍生化试剂（CDR）分子中一般含有紫外、荧光等可检测集团，故方法灵敏度较