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伤寒沙门菌野生型综述
以铜绿假单胞菌的野生型标准株 PA 01的 gyrA (GenB ank accession num 2ber L29417 ), parC ( GenB ank accession num berAB003428)基因序列为靶序列 ,以 DNA M AN 软件辅
【作者简介 】徐苏娟，J检验0706，,371113147
【摘要 】 目的 探讨环丙沙星 (C IP)耐药的铜绿假单胞菌临床分离株主动外排药物与 gyrA,parC 基因突变的关系. 方法 联合碳酰氰基 2对 2氯苯腙 (CCCP)和 C IP对 C IP耐药的铜绿假单胞菌株进行主动外排阳性株和阴性株的筛选 ,并对这些菌株的 gyrA,parC 基因进行聚合酶链式反应 2限制性片段长度多态性分析 (PCR 2RFLP).结果57% (55/97)的 C IP耐药菌株最小抑菌浓度 (M IC)可被逆转 ,gyrA 单基因突变率为 65% ,gyrA 和 parC 双基因突变率为 35% ,未发现 parC单基因突变的菌株.主动外排阳性组与阴性组 gyrA,parC基因突变情况差异无显着性. 结论 在本地区铜绿假单胞菌对 C IP的耐药机制中 ,主动外排系统表达上调与抗菌药物作用靶位的改变均占有重要的地位 ,两者可能是并存的两种相对独立的机制.
【关键词 】 环丙沙星耐药 ;铜绿假单胞菌 ;主动外排 ;基因突变

铜绿假单胞菌 (Pseudom onas aeruginosa,Pa)在自然界分布广泛 ,对人类而言 ,属于条件致病菌.随着抗菌药物,免疫抑制剂和各种侵袭性诊治方法的广泛应用 ,铜绿假单胞菌已成为医院感染的主要病原菌之一.由于该菌对多数抗生素不敏感 ,呈现明显的固有耐药 ,即使对原为敏感的抗生素也容易产生耐药性 ,因此该菌在临床抗感染治疗中有着特殊重要的地位.喹诺酮类 (quinolones)药物以环丙沙星 (ciprofloxacin,C IP)为代表 ,因其良好的药代动力学特点,强大的杀菌活性被广泛用于临床铜绿假单胞菌感染的治疗.但随着该类药物的大量使用 ,临床上对其耐药的铜绿假单胞菌逐渐增多 ,给治疗带来极大的困难.铜绿假单胞菌的耐药机制较为复杂 ,大量的研究表明 :细菌编码喹诺酮类药物作用靶位的 DNA 促旋酶和拓扑异构酶 IV 的基因突变是细菌对喹诺酮类药物的主要耐药机制之一
[1]
.近年来的研究发现 ,铜绿假单胞菌内存在着外排多种物质的主动外排系统 ,在多药耐药性 (m ultidrug resistance,M DR )中起着极其重要的作用
[2]
.同时也有研究显示 :调节主动外排系统的 m exR,nfxB 基因突变仅出现在 gyrA 或 parC
基因突变的基础上 ,进而导致铜绿假单胞菌的高度耐药
[3]
.碳 酰 氰 基 2对 2氯 苯 腙 (Carbonyl Cyarude232chlorophcnylhydrazone,CCCP)是最典型的质子泵抑制剂 ,是一种抑制质子运转的解偶联剂 ,它通过抑制主动外排系统能量来源的质子浓度梯度 ,从而破坏主动外排系统外排药物的作用 ,能显着降低耐药菌对药物的最 小 抑 菌 浓 度 (m inim al inhibitory concentration,M IC),是检测主动外排系统存在的重要试剂
[4]
本文利用 CCCP对 C IP耐药的铜绿假单胞菌M IC的这种逆转作用 ,将 97株 C IP耐药菌分为主动外排阳性组,阴性组 ,并对其 gyrA,parC 基因进行PCR 2RFLP分析 ,通过对比两组结果 ,了解主动外排系统表达上调,抗菌药物作用靶位的改变这两种耐药机制在临床分离耐药株中的地位以及两者的关系.
1 材料与方法
1.1 菌株来源及鉴定 97株 C IP耐药的铜绿假单胞菌均为广州医学院第一附属医院,中山大学附属第二医院,广州市第一人民医院住院及门诊临床分离的菌株 ,经法国 B ioM érieu公司 V ITEK22全自动细菌鉴定药敏分析系统鉴定 ,且环丙沙星 M IC ≥4μg/m l.质控菌株为铜绿假单胞菌 A TCC 27853.
1.2 主要试剂与仪器 M H 琼脂粉 (O xiod公司 ),C IP(广州南新制药厂 ),CCCP (Sigm a公司 ),基因组DNA 提取试剂盒 (北京赛百盛基因技术有限公司 ),引131中国微生态学杂志 2008年 4月第 20卷第 2期物 (上海英骏生物技术公司合成 ),Taq酶 (TaKaRa公司 ),SacⅡ酶 (TaKaRa公司 ),H infⅠ酶 (TaKaRa公司 ).主要仪器 :恒温摇床 (上海离心机械所 ),式高速离心机 (Sigm a公司 ),PCR扩增仪 (B iom etra公司 ).
1.3 主动外排阳性株和阴性株的筛选 参照 CLSI(C linicaland Laboratory Standards Institute 2005)方法 ,采用二倍琼脂稀释法测定各 C IP耐药临床分离菌株的 M IC.分别制备含不同度单纯 C IP和同时含有不同浓度 C IP,20 m g/m lCCCP的两组 M H 琼脂平
板.菌液以比浊仪调整浓度至 0.5麦氏浊度 ,再用生理盐水稀释 10倍 ,以接种量 104
CFU /m l接种于上述两组 M H 平板上 ,35 ℃孵育 18 h观察结果.结果判断按 CL IS 2005年标准 ,并以 A TCC 27853进行质量控制.两组 M IC差异有显着性者判定为主动外排阳性菌 ,差异无显着性者为主动外排阴性菌.
1.4 DNA 提取和聚合酶链式反应 (polym erase chainreaction,PCR )
1.4.1 基因组 DNA 的提取 挑取哥伦比亚琼脂上分离培养的单个菌落于 LB 培养基中 ,置 37 ℃恒温摇床中培养 18～20 h,取 1.5 m l菌液离心收集菌体 ,然后按细菌 DNA 提取试剂盒说明书的操作步骤提取铜绿假单胞菌染色体 DNA.DNA 储存于 TE缓冲液中 , -20℃保存备用.取 4μl经 1.5% 琼脂糖凝胶电泳检测 ,紫外灯下观察结果.
1.4.2 PCR 扩增目标基因片段 根据文献 [5 ]及GenB ank上提供的序列资料 ,分别以铜绿假单胞菌的野生型标准株 PA 01的 gyrA (GenB ank accession num 2ber L29417 ), parC ( GenB ank accession num berAB003428)基因序列为靶序列 ,以 DNA M AN 软件辅助设计扩增铜绿假单胞菌 Ⅱ类拓扑异构酶 gyrA,parC基因喹诺酮类耐药决定区 (quinolone resistantdeter2m ining region,QRDR )片段的 PCR 引物.引物 gyrA 2F: 5′2CCGTGTGCTTTA TGCCA TGA G23′, gyrA 2R: 5′2GA TACCGCTGGAACCGTTGAC23′, 片 段 大 小 为384 bp; parC 2F: 5′2TCGA TCTGA GCCTGGAA G23′,parC 2R:5′2CTCGGTA TAACGCA TGGC23′,片段大小为374 bp.PCR 反应条件 :94 ℃预变性 4 m in,94 ℃变性 30 s,52 ℃(gyrA )/55 ℃(parC )退火 30 s,72 ℃延伸 1 m in,72 ℃延 伸 10 m in,35 个 循 环.产 物 于-20 ℃保存.
1.4.3 PCR 产物的检测与鉴定 取 PCR 产物 5μl,加上样缓冲液 1μl,于 1.5% 琼脂糖 (含 EB )凝胶中电泳 ,100 V 30 m in,紫外灯下观察结果 ,证实扩增片段大小.
1.5 限制性片断长度多态性分析 (restriction frag2m entlength polym orphism ,RFLP)
1.5.1 gyrA 基因片段 SacⅡ酶切分析 PCR 产物10μl,加入 SacⅡ内切酶 0.5μl,10 ×S B uffer2μl,B SA 2μl,ddH2O 5.5μl置 37 ℃水浴箱反应过夜 ,取
产物 20μl经 3% 琼脂糖电泳 ,紫外灯下观察结果.
1.5.2 parC 基因片段 H infⅠ酶切分析 PCR 产物10μl,加入 H infⅠ内切酶 0.5μl,10 ×S B uffer2μl,ddH2O 7.5μl置 37 ℃水浴箱反应过夜 ,取产物 20μl经 3% 琼脂糖电泳 ,紫外灯下观察结果.
2 结果
2.1 C IP耐药 Pa的 M IC结果 (琼脂稀释法 ) 97株临床分离的 C IP耐药菌中 ,有 23% (22/97)的菌株为高水平耐药菌 (M IC 在 64～512μg/m l);有 34%(33/97)的 菌 株 为 中 水 平 耐 药 菌 (M IC 在 16 ～32μg/m l);有 43% (42/97)的菌株为低水平耐药菌(M IC在 4～8μg/m l).
2.2 主动外排阳性株和阴性株筛选结果 根据菌株M IC是否能被质子泵抑制剂 CCCP所逆转 ,对临床分离的 C IP耐药菌进行主动外排阳性株和阴性株的筛选.在 97株菌中 ,有 57% (55/97)的菌株受 CCCP作用时其 M IC 值有所下降 ,为主动外排阳性株 ;有43% (42/97)的菌株受 CCCP作用时 M IC 值无变化 ,为主动外排阴性株.见表 1.
2.3 C IP耐药 Pa的 gyrA 和 parC 基因突变情况
(PCR 2RFLP结果 ) gyrA 基因 83位密码子未发生突变时 ,其 PCR 产物经 SacⅡ酶切后出现 110 bp和274 bp两个片段 ,当该酶切位点发生突变时 ,则酶切后只出现 1个 384 bp的片段 ,见图 1. parC 基因 87位密码子未发生突变时 ,其 PCR 产物经 H infⅠ酶切后出现 66 bp,131 bp和 177 bp三个片段 ,当其中一个酶切位点发生突变时 ,则酶切后出现 177 bp和
197 bp两个片段 ,见图 2,图 3.
第 1泳道 M arker(DL2000),第 2～6泳道 SacⅡ酶切产物(其中第 2,4,5泳道为 83位密码子无点突变,可被酶切开的产物 ,第 3,6泳道为 83位密码子点突变,未被切开产物 )图 1 gyrA 基因 SacⅡ酶切产物的琼脂糖电泳图第 6泳道 H infⅠ酶切产物 ,第 5泳道 M arker(DL2000),第 1～4泳道 parC基因的 PCR 产物 [其中第 1,2泳道为 87位密码子点突变,未被酶切开的产物 (该电泳条带看似一条 ,实际由两条距离很近的条带组成 ,通过聚丙烯酰胺电泳可将其分开 ,见图 3),第 3,4泳道为 87位密码子无点突变,可被酶切开的产物 ]
图 2 parC基因 H infⅠ酶切产物的琼脂糖电泳图
231 Chinese JournalofM icroecology,April2008,Vol120 No12
第 1泳道 M arker(DL2000),第 2,3,4,5泳道 H infⅠ酶切产物[第 87位密码子点突变,酶切后仅出现 2个片段 (正常应出现3个片段 )],第 6泳道 parC基因的 PCR 产物
图 3 parC基因 H infⅠ酶切产物的聚丙烯酰胺电泳图 97株临床分离的 C IP耐药菌中 ,发生 gyrA 和(或 )parC 基因突变的共有 69株 ,占 71% (69/97),其中 发 生 gyrA 和 parC 双 基 因 突 变 的 占 35%(24/69);仅发生 gyrA 单基因突变的占 65% (45/69);
未发现 parC 单基因突变株.见表 1.
2.4 CCCP对 C IP耐药 Pa主动外排阳性株 M IC 的逆转情况 55株外排阳性菌株在加入 CCCP作用时 ,高,中,低耐药水平的菌株 M IC50,M IC90均下降 2
～4倍.见表 2.
2.5 主动外排阳性株,阴性株 gyrA,parC 基因突变
情况的比较 主动外排阳性组中 ,38株菌发生 gyrA和 (或 )parC 基因突变 ,占 69% .其中双基因突变的有 14株 ,占突变株的 25% ,gyrA 单基因突变的有 24株 ,占突变株的 44% .主动外排阴性组中 ,31株菌发生 gyrA 和 (或 )parC 基因突变 ,占 74% .其中双基因突变的有 10株 ,占突变株的 24% ,gyrA 单基因突变的有 21株 ,占突变株的 50% .采用 χ2
检验分析两组菌株高,中,低耐药水平突变数及总突变数 ,其 P值均大于 0.05,结果显示主动
外排阳性组与阴性组 gyrA,parC 基因突变情况差异
无显着性.见表 3.
表 1 97株临床分离菌株主动外排和基因突变情况耐药水平
3菌株数
主动外排
阳性 (% ) 阴性
基因突变情况
gyrA + parC
双突变
gyrA
单突变
parC
单突变
高 22 14(63.6) 8 17(77.3) 3 0
中 33 19(57.6) 14 6(18.2) 23 0
低 42 22(52.4) 20 1(2.4) 19 0
合计 97 55(57.0) 42 24(24.7) 45 0
注:3高水平耐药指 M IC在 64～512μg/m l,中水平耐药指 M IC在 16～32μg/m l,低水平耐药指 M IC在 4～8μg/m l.表中数字为菌株数.
表 2 主动外排阳性组与阴性组最小抑菌浓度比较及 CCCP对主动外排阳性菌株的逆转作用 (单位 :μg/m l)
耐药水平
3主动外排阳性组
C IP
M IC50 M IC90
C IP +CCCP
M IC50 M IC90
主动外排阴性组
M IC50 M IC90
高 128 512 64 128 64 256
中 32 32 8 16 32 32
低 8 8 4 4 8 8
合计 16 128 8 64 16 64
注 :3高水平耐药指 M IC在 64～512μg/m l,中水平耐药指 M IC在 16～32μg/m l,低水平耐药指 M IC在 4～8μg/m l.
表 3 主动外排阳性组与阴性组 gyrA,parC基因突变情况的比较 (单位 :株 )
耐药水平
3 主动外排阳性组
总株数 基因突变株数 (% )
主动外排阴性组
总株数 基因突变株数 (% ) P值
高 14 14(100) 8 6(75) >0.05
中 19 16(84) 14 13(93) >0.05
低 22 8(36) 20 12(60) >0.05
合计 55 38(69) 42 31(74) >0.05
注 :3高水平耐药指 M IC在 64～512μg/m l,中水平耐药指 M IC在 16～32μg/m l,低水平耐药指 M IC在 4～8μg/m l.
3 讨论
许多研究表明铜绿假单胞菌细胞膜上的许多蛋白具有将抗菌药物主动排出菌体外的作用 ,并与其细胞外膜的低通透性协同作用 ,导致铜绿假单胞菌固有多重耐药
[6]
.到目前为止共报道了七类铜绿假单胞菌的主动外排系统 ,已知有五类可以喹诺酮类药物为
转运底物 :M exAB 2OprM ,M exCD 2OprJ,M exEF2OprN,M exXY2OprM ,M exW V 2OprM
[7]
.一般认为 ,仅有 M ex2AB 2OprM 广泛存在于野生菌株中 ,与外膜低通透性一起决定了该菌天然的多重耐药性
[6]
.CCCP是典型的质子泵抑制剂 ,是一种抑制质子运转的解偶联剂 ,它通过抑制主动外排系统能量来源的质子浓度梯度 ,从而破坏主动外排系统外排药物的作用 ,能显着降低耐药菌对药物的 M IC,成为判断主动外排系统存在的重要标志
[4]
.从表 2可见 ,97株临床分离的 C IP耐药 Pa中 ,有55株菌的 M IC可被 CCCP逆转 ,占半数以上.在加入CCCP作用时 ,高,中,低耐药水平的菌株 M IC50,M IC90均有不同程度的下降 ,其中高,中水平耐药者 M IC 下降更为明显.说明本地区临床分离的 C IP耐药铜绿假单胞菌中有半数以上菌株的 M IC 可被 CCCP所逆转 ,提示在本地区临床分离的 C IP耐药铜绿假单胞菌中较普遍存在着主动外排耐药机制.从表 1的结果可以看出 ,随着菌株对 C IP耐药水平的增加 ,其主动外排的发生率也升高 ;而且从表 2可以发现 ,在主动外排阳性组和阴性组 ,两者 M IC50相同 ,但主动外排阳331中国微生态学杂志 2008年 4月第 20卷第 2期性组 M IC90高于阴性组一倍 ,提示主动外排系统外排药物是本地区临床分离的铜绿假单胞菌对 C IP耐药 ,尤其是中,高水平耐药的重要机制.这也提示临床医生 ,在进行 C IP耐药 Pa的抗感染治疗时 ,联合使用外排泵抑制剂可能提高抗生素的抗菌活性.大量的研究表明 :细菌编码喹诺酮类药物作用靶位的 DNA 促旋酶和拓扑异构酶 IV 的基因突变 ,改变
了酶的结构 ,使药物不能与酶 2DNA 复合物稳定结合是细菌对喹诺酮类药物的主要耐药机制之一
[1]
DNA 促旋酶是由 2个 A 亚基和 2个 B 亚基组成 ,分别由 gyrA 和 gyrB 基因编码 ;拓扑异构酶 Ⅳ由 2个C亚基和 2个 E亚基组成 ,分别由 parC 和 parE基因编码.DNA 促旋酶中 gyrA 基因突变 ,或 Ⅳ型拓扑异构酶中 parC 基因突变 ,使铜绿假单胞菌对喹诺酮类
药物耐药
[1]
.我们的实验显示 ,临床分离的 97株 C IP耐药 Pa中 ,69株发生了 gyrA 基因突变 (主要是 gyrA基因 83位密码子突变 ),突变率高达 71% ;其中 24株是 parC 基因突变株 (主要是 parC 基因 87位密码子突变 ),parC 基因突变株均合并有 gyrA 基因突变 ,未发
现 parC 基因单突变的菌株 ,而且从表 1可以看出 ,随着菌株对 C IP耐药水平的增加 ,双基因突变的发生率也显着增加.说明 C IP作用靶位的基因突变 ,尤其是编码 DNA 促旋酶的 gyrA 基因突变 ,是本地区铜绿假单胞菌对 C IP产生耐药的主要机制之一 ,而 parC 基
因突变是在 gyrA 基因突变的基础上发生的 ,其出现进一步加重了铜绿假单胞菌对 C IP耐药程度.有研究显示 :调节主动外排系统的 m exR,nfxB 基因突变仅出现在 gyrA 或 parC 基因突变的基础上 ,进而导致铜绿假单胞菌的高度耐药
[3]
.但从我们的实验结果看 (表 3),主动外排阳性和阴性两组菌株高,中,低耐药水平的 gyrA 或 parC 基因突变数及总突变数 ,其 P值均大于 0.05,差异无显着性.提示在本地区临床分离的 C IP耐药 Pa中 ,主动外排阳性组与阴性组 gyrA 和 (或 )parC 基因突变况差异无显着性 ,主动外排系统外排药物作用与抗菌药物作用靶位的改变两种机制 ,在引起铜绿假单胞菌对 C IP耐药方面的深入研究.

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