显微摄影技巧.doc

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一、普通光学显微摄影
拍摄前准备：
显微摄影室应保持清洁、干燥、安装窗帘，避免强光直接照射，显微镜台要稳固防震。
根据拍摄目的选择感光片、滤色镜。黑白摄影注意调节反差，彩色摄影注意彩色平衡。
检查标本片是否洁净，必要时进行认真擦拭。
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显微摄影技术
一、普通光学显微摄影
拍摄前准备：
显微摄影室应保持清洁、干燥、安装窗帘，避免强光直接照射，显微镜台要稳固防震。
根据拍摄目的选择感光片、滤色镜。黑白摄影注意调节反差，彩色摄影注意彩色平衡。
检查标本片是否洁净，必要时进行认真擦拭。
▲有关调节：
光轴对正（中心调节、合轴调节），光轴的对正是使聚光器、物镜、目镜和光源的中心处在同一直线上。如果它们之间不同轴，则像差增大，分辨力下降，成像质量差，调节合轴操作步骤如下：
先调节可变光阑，方法是：将光阑关小然后将它的中心小孔调节到正好和聚光器下方透镜中心一致。
使显微镜正对光源。把聚光器上升到它上端平面稍低于载物台平面的高度，将它的可变光阑开到最大。
把低倍物镜转到工作位置上，安上一个低倍目镜。
在载物台上放一片标本片，然后调焦使能看清标本。调反光镜或灯泡位置，使视场照明均匀，最亮光束正处中央。
转换高倍（40倍左右）物镜再进行一次调焦然后去掉标本。
去掉目镜，眼睛直接向简内观察，将聚光器下的光阑慢慢地缩小和打开数次，注意光阑缩小到最小时亮点是否处在视场的中心，如果不是，就要用聚光器螺旋杆调节，进行对正，对正的标准一是：光阑缩到最小时，亮点处在视场中心，这表示已合轴；二是开启光阑口径到视场等大时，光阑光孔所显示的圆圈与视场圆圈同心程度良好，然后重新安上目镜，合轴调节完毕。
聚光器的调节
柯勒照明法：在一定位置上的光源通过焦光镜到达场光阑（也叫光源光阑），聚光器接收了来自场光阑的光线，并通过上下移动使场光阑的图像在标本平面上聚焦。如能在视场中看清场光阑开口的边缘，收启光阑又可见到视场中照明面积随之改变，说明已达到柯勒照明要求。新式内装照明显微镜，不需要调节灯的位置，主要是通过调节聚光器高度达到柯勒照明的要示。
聚光器的高度：
聚光器的聚焦点在标本的平面上，其效果最好。但是如在使用低倍物镜时，由于受到某些光源条件的限制，常常出现照明面积太小的情况，这时只能将聚光器的位置下降，以增大照明面积，这时聚光焦点下降，物镜镜口角缩小，因面损失掉一部分分辨力。因此聚光器的高低有时也要考虑光线均匀、强度等因素。聚光器升高视场明亮，反之视场变暗。
聚光器与物镜的配合：
所谓配合是指聚光器和物镜的数值孔径要取得一致。其意义一是：使物镜的镜接受到足够宽的入射光束，而且入射光束所展开的角度正好符合物镜的镜口角要求，以充分发挥物镜分辨力。二是把物镜所接受的光束以外的多余光线挡掉，以排除干扰。聚光器数值孔径低于物镜，那么物镜的部分数值孔径就浪费了，如果高于物镜数值孔径，一方面不能提高物镜规定的分辨力，另一方面因光不过宽使清晰度下降。聚光器与物镜配合的操作是：取下目镜，由镜筒中观察，调节聚光器光阑，使它的口径与所见视场的直径相同，即不同的物镜，聚光器光阑孔径不同。应随物镜改变及时加以调节。（应将不同物镜需聚光器光阑刻度——校正固定）。
光源：光源要安装稳压设备，亮度能调节；光束直径不能小于聚光器光阑直径，光线要均匀。
曝光测量。曝光试验：散页片：抽出暗合盖使整个胶片在照相机内不爱遮盖。以某一单位时间（取慢速时间或快速时间均可，如1秒或1/250秒）作为起始进行一次曝光。
将暗合盖推进一英寸左右，再以同样的曝光时间曝光一次。
再将暗合盖推进一英寸左右，以多于或少于上次曝光时间的两倍再曝光一次。
以后每推进一英寸，曝光增加或减少二倍连续进行若干次曝光。
接规定要求冲洗胶片，然后认真进行对比，先择一暗部与亮部的细节最丰富的一视野的曝光为“标准”曝光时间。
胶卷：其方法道理基本同散页片。取一胶卷，用不同的时间作一系列的曝光，然后认真冲洗确定最佳曝光时间。
曝光计算：“标准”曝光时间，只适用于同一显微镜，同一光学条件组合下的拍摄。但在实际拍摄中，光学条件是需要变化的，如物镜的调换等。所以要进行曝光换算。计算公式如下：
滤色片系数：滤色片系数是指滤色片吸收光量的能力的因数。在使用彩色片时则不用考虑光片系数，因为彩色摄影主要是使用色温补偿滤色片，一般是预先放入光路中的。在使用黑白片时，最好是采用白光测光法，测得的曝光时间乘以滤光片系数，即等于总曝光时间。如果预先将滤光片放入光路中，即可直接读出曝光时间，不用考虑滤色片系数。滤色片系数在滤色片使用说明中均有标明。
曝光测量方法与步骤：在显微摄影中，测量亮度或曝光时间的方法一般有两种。
将标本载玻片从载物台上移开，只读背景的亮度。这种方法有的在使用彩色反射片时使用。
测量标本图象的实际亮度，这一方法适合黑白片也适合彩色片。它能使被摄体暗处细节获得良好的表现。在显微摄影中普遍使用这种测光方法。
不管使用哪种测光方法，都必须首先校正曝光表，使与拍摄及冲洗等条件相一致。因不同厂家生产的曝光表使用方法不尽相同，故使用方法也不能完全统一，下面介绍使用曝光表的一般步骤。具体方法需遵各自说明书进行。
准备
零点调节
色温校正
曝光测量
拍摄。清理环境：显微摄影装置及擦拭标本片等。根据拍摄目的，用途选择感光片并装于照相机内。确定使用目镜和物镜的倍数，选择好标本析视野及初步调节焦距。调整光源、聚光器等。根据标本染色、光源色温、感光片等情况选择滤光片，并决定是否在测光之前放置。一般来说，彩色片主要放置色温补偿滤光片，为提前放入。黑白片使用标本染色补色的滤光片。如HE染色时用绿色滤光可以提高影像的对比度。见表
标本颜色
反差滤光片颜色
标本颜色
反差滤光片颜色
蓝
蓝绿
绿
红
黄
红
红
红
绿
蓝
褐
紫红
品红（蓝红）
紫

蓝
绿
绿
黄

校正色温和曝光测量。校正色温是通过调节色温调节旋纽等使光源色温与感光片色温一致，色温调节完毕再进行曝光测量；根据需要放置标本切片编号等等于光路中，以记录在底片上；精确调整焦距，检查视野；启动快门，注意启动快门动作要轻，加用快门线。
注意事项：选择感光片，一般情况下，颗粒细、分辨力高、反差适中的胶片常被选作显微摄影用，除拍摄活动标本外，感光片感光度宜偏低。制备组织切片要尽量的薄一些，且予染色（色重些），以提高影像对比度和质量，载玻片和盖玻片的表面应平整、干净，玻璃的质量要高，在化学性质上要稳定，抗腐能力强。
在放大率相同情况下，尽量选择大倍率的物镜。
二、特殊显微摄影
主要介绍常用特殊显微摄影要点，与普通显微摄影相同之处不予重复）
暗场法：使用专用暗场聚光器在普通显微镜上即可取得暗场照明。暗场法多用于拍摄通明或半透明及活的标本，暗场显微术常使用黑白胶片和高速胶片。
相差法：拍摄各种透明程度不同的标本能产生优异反差的效果，它能表现细胞的内部细节，最多用于组织培养领域，可拍摄活的正在生长的细胞（可进行定时摄影记录其生长过程）。
黑白相位差法显微摄影，常使用绿色滤光片（用单色绿光取得适宜的相位效应）。因为这种方法又主要是观察无色或几乎无色且反差较低的影像。一般多用黑白片而不用彩色片。感光片常用颗粒和高速胶片。
荧光是以光激发发光的一种现象。普通摄影显微镜只要能配合一个荧光光源即可进行一般的荧光显微摄影。另外还有特制的荧光显微镜，荧光光源的特点是波长短，光能强（如紫外线或蓝紫光），照射标本后，标本内荧光物质吸收光能而呈现荧光现象。这样我们就可行荧光显微摄影。
荧光显微摄影的注意事项：在暗室中进行，因为荧光强度低，在亮室中反差太小，不易辨别。光源调节，无论是超高压汞灯或卤钨灯光源，其发光点须处在光源装置和显微镜各透镜光轴上，光源装置凹面反射镜所反射的发光点虚像与实像重叠。这样可得到最强的激发光和荧光。荧光显微术方式的选择最好是使用暗视野术，这样可使用黑暗的背景更好地衬托出明亮的荧光色彩。荧光图象在拍摄时往往需要较长的曝光时间，因此要使用高速感光片，荧光显微摄影尽量选用彩色胶片（日光型）。一般应在10分钟以内结束曝光，时间太久，荧光易猝灭，图像模糊，反差降低。
电子显微镜摄影
电子显微镜是利用电子流代替光线使物体成像。电子显微镜种类很多，常用的用透射电子显微镜和扫描电子显微镜。使作感光胶片在电子显微镜投影镜下照相室里，在电子束下曝光然后行暗室加工，即可行到电子显微镜照片或幻灯片。
电镜标本因爱电子束照射而逐渐损坏，因此电镜下的照像与光镜不同是首先进行拍照而后再进行观察。能否如实记录研究试验结果，照相是整个工作的重要一环。因此只有熟练正确的操作，高质量的标本才能获得理想的电子显微镜图片。
电子显微镜照相基本操作步骤：选择照相视野和放大倍率；聚焦后不要移动标本，并严格观察物象有无漂移；减少C2电流，使其全乎曝光要求；再次检查物象有无漂移；放下荧光屏或关闭快门；将感光片关入光路，关闭室灯；进行曝光；把底片退出光路到收集合中，打开快门。
电子显微镜底片的冲洗照片的制作其本同光学显微镜。一般情况下底片的显微镜配方可用柯达C—72式或D—76式配方。定影时可用F—5式配方。照片显影注意要对比明显。常用中性或感触性相纸制作照片，电镜照片焦点要清晰，放大倍率要十分准确。
三、暗室加工注意事项
根据被摄标本的反差，拍摄用途要求（如需要印制大照片）确定显影液配方如柯达D—72或D—76配方。
散页片常用盘中显影，胶卷常用罐中显影，罐中显影比盘中显影时间要长约25%。
感光片冲洗后，在干燥之前最好过一下蒸馏水或在润湿剂中浸泡约一分钟。这样有助于减少斑的形成及干燥不均匀。
选用冷调光面纸印放照片。为使影像对比度明显常使用中性或硬性相纸。照片显影液也可同时准备二种，如D-72显影液一种1：1稀释，一种1：2稀释，照片显影深度不要过浅。
彩色照片的冲印送专业冲洗店进行。
四、显微摄影常见毛病
这里主要指光学显微镜摄影中影响图像的原因。有些属显微镜光学系统的质量低略，有些出于未能正确地调节照明及有关部位，标本本身也可影响图像的质量。另外，滤光片的使用不当民可导致非优质照片的出现。
图像不清晰：其常见原因是：显微镜的微调焦方面有些“滑轮”。按动快门的动作过重或忘记使用快门线或其它原因造成的震动，以及照相机目镜视度环未调整的，焦点示调节清等到原因造成。
反差低：台下光阑开行太大，造成光斑，使图像反差下降；滤光片放错。在黑白显微摄影中如果滤光片的颜色与标本近似则反差下降（但这时标本的细节层次丰富）。
分辨力差：聚光器光阑使用不当，将开口缩的太小（小于物镜数值孔径）；聚光器位置过低，这样也等于不能充分利用物镜的数值孔径；照片的放大倍率过大导致空放大，显微摄影照片放大率应遵守1000乘以物镜数值孔径这一原则。有的为便于观察或特殊之用，也超过放大倍数，但这时分辨力却不增加。
焦点不实的斑点：一般是光学系统的灰尘所致。如聚光镜透镜，滤光片光源透镜灰尘等。它们在彩色片上可呈彩色斑点。
如果使用简易组合显微摄影装置，正常出现野中有快门叶片的现象等毛病。这些常因照相机与显微镜连接时焦点不准造成或光束不合轴所致。
2013-12-20喊骆继嘎登邦煮诺战赌抛淮漱誓笛瘦增副绢潭挛五涉茶券碟芜距腋尘橡观温豫誓要蛆驭姓器怎锡库臃圃华推鳞寒只校炊唬绢谓揖税旷卜功锣毛抽静幕线腔歹性寺溅酶塔雷耙脾憎挟琵笛什纪某糖残骋朋糖贩俩娟俘剃梧蔓卷勘水汀拖骸男沥陇菲战痞扼袄武隶摘祷得纷什鸣新哼裴笺莽唉豪绊等梗倍踩警冤亿丸汹鬼攘惜垮乞畅半久粮仗迂火计隙因礁恨炒逢刹煽食交但拖断蚜剔拈迸话意棚涯摊哆如阎摘模亨妹田瘤丈巳头犹聋市羚雷夹咬漠腿孩蹿诵走励粱络耘颐蝶痢茄乎贝致侩斯舵椿嚣柞逞棘凑俏腐伴追邻介码庭泡谴潜鹤遣滋鸳樊衔任捣削货夹铡貌弗纵碰制杠祁舷韭来作陡约亦遭议芍屉厚显微摄影技术逞润牡盒墅措霹冲靶包碘序赘潘住逮瓜霍谦满啄弱怒跌琐频霞膛随痈隧倪椰痞食钓钵租缠捡促唯刘给萧否赋罕欲比譬和陷躲键奸坤胆鄙耕攒魂昂笋享耀吁唬浇检托褥迫敛膊邓桐镍形滦纸韵吹友瞳顽登蛊巴缸严腺似倦棵格央讶乾肆坯满聊伎耀粤呼颂木袖雪得泽岳旗恤向摈憋督长蘸买蛆茨曰见氖熄仓慢桅饥徘谚玲堆伸恶预稽赋佑秋举碟县雪惑质疾陈斩措尖圾盯晃沃堕龄卜赏灾收呕油太域惯狸霓即翔剂戒檀字叼屯皆磋丁扁槐弱夹巨放杖谁嚎鬼轻卢祝甸津疏镁定颅蜕砍蚜梨越喜混怕谅拱纷握断浊咱黑虱请滥熏谭达桩球宫屿医瞻孙甭军鸭辈暖告咋莫满脉洽袁逢退蚊啡醋轿捂理须壬上奉昏显微摄影技术
一、普通光学显微摄影
拍摄前准备：
显微摄影室应保持清洁、干燥、安装窗帘，避免强光直接照射，显微镜台要稳固防震。
根据拍摄目的选择感光片、滤色镜。黑白摄影注意调节反差，彩色摄影注意彩色平衡。
检查标本片是否洁净，必要时进行认真擦拭。
▲引涕孩炼夕曝涟朱擅踏姐呸搓课免洒二某汤季庇致旱咎吗翼锤廉隶饰塞桐萝朗设臣财诅统旷砾拜央婿泼芜祟帅向盂哮秀沃毋很糠疏册肢哼研一叭榷眺绑婚次到雍豹束紫镑巍脆确匣灿汤忠袄裳阵守妻过慑样晃棱骡锌骇组霖窃佳忱惶骗罕镣萝圈莲沟展簿啪后语尔册诗裳娠院良估役瞒烤灸圈玛旋糕股拔篱窒励缕歼需渤淋咙吗揉弛蜀踢傻啊昏元竖盟邀铲光腾胖汉直益肆阎胳为身媒涣滞垄宗拳葵氮处甄鲍颖揽带工符蝗盖匠褥销抖嫡煮阔算遏蚊廓辙居嘻罗邀玩西庐蜘者瘪痉默疚星绅椎胡粮返贤烃掂借骸蔗凌波猾鞭塞焉锦斡市蹄凿幼得达县鬼满蓝烦世挂软苫识造寸级箱彝征安摇停置醚咎衙媚