测定黄芩中黄芩苷的定性和定量方法.doc

测定黄芩中黄芩苷的定性和定量方法
1.薄层色谱法定性鉴别
薄层色谱法是将适宜的吸附剂或载体涂布于玻璃板、塑料或铝基片上,成一均匀薄层,待点样、
展开后,与适宜的对照物按同法在同板上所得的色谱图对比,用于中药制剂的鉴别。该法是黄芩苷常用的定性分析方法,一般采用吸附薄层鉴定,常用硅胶和聚酞胺作为吸附剂。
1.1样品处理
适当有效的样品处理可将被测成分黄芩苷从制剂中溶出,还可分离精制纯化样品,一定程度上避免共存成分的干扰,使定性鉴别过程中显色反应更加清楚明了。常用甲醇、乙醇进行提取或萃取。
1.2固定相
固定相通常用硅胶和聚酞胺。在硅胶薄层色谱中,硅胶除对黄芩苷产生物理吸附外,还与黄芩苷的游离酚轻基产生氢键吸附,故易出现拖尾现象,采用氢氧化钠或醋酸钠制备的硅胶G板可有效改善拖尾现象。聚酞胺薄层色谱法利用聚酞胺与黄答普的酚轻基产生氢键吸附的原理进行分离。
1.3展开剂
用硅胶薄层色谱鉴定时，根据黄芩苷的极性,展开剂常含酸或水。聚酞胺对黄芩苷的吸附能力较大，需用具有较强极性的展开剂，常用醋酸。
1.4显色剂
黄芩苷具有游离的邻二酚轻基，可与金属离子如铝离子、铁离子等发生络合反应而显色，故可用三氯化铝、三氯化铁或通用显色剂硫酸进行显色。显色反应可采用在紫外光下观察斑点和喷显色剂相配合的方法。

2.高效液相色谱法定量分析
高效液相色谱法与紫外分光光度法和薄层扫描法相比，具有高效的分离,灵敏的检测和快速的分析的特点，既能用于微量组分的分析测定，又能用于大量的制备分离，是中药成分研究中一种非常重要的分析手段，现在HPLC已成为测定黄芩及其制剂中黄芩苷的主要方法。
2.1样品处理
黄芩本身含有多种成分，含黄芩的复方制剂化学成分更加复杂，进行样品处理可以将黄答首从样品中释放出来，并制成便于分析测定的稳定试样，还可除去杂质、纯化样品,提高含量测定的重现性和准确度，也起到了保护色谱柱的作用。通常用甲醇或乙醇作提取或萃取液，经过一系列分离、纯化，最后用0.45um微孔滤膜滤过。如在小儿清肺口服液的质量标准研究，精密吸取样品溶液5.0ml，加甲醇稀释至50ml,混匀，过滤，续滤液作为供试品溶液。用HPLC法测定小儿感冒片中黄芩苷的含量。样品用70%乙醇超声提取,滤过,滤液置50ml容量瓶中，加70%乙醇至刻度作为供试品。
2,2固定相
黄芩苷具有羟基，在硅胶柱上直接进行高效液相色谱分离效果不太好，而用RP一HPLC法分离效果较好。现常用固定相是烷基键合相如C8,Cl8键合相,其中又以Cl8最常用。
2.3流动相
流动相通常以水为基础溶剂，加入一定量的能与水互溶的极性调整剂，常用甲醇、乙腈，因黄芩苷呈弱酸性,为抑制解离在流动相加入少量的酸如磷酸、醋酸等,能改善峰形更加尖锐利于分析。亦有将离子对试剂加入含水的流动相中,用反相离子对色谱法来分析。
2.4检测方法
黄芩苷有紫外吸收，常用紫外检测器，又以光电二极阵列检测器最常用。因黄芩苷在280nm处有最大吸收,通常在280nm左右进行检测。

3.药典方法
取黄芩苷粉末(通过三号筛)约0.5g,精密称定,置锥形瓶中,加乙醇85ml，加热回流1.5h，放冷，连同沉淀一并移至100ml量瓶中，加乙醇至刻度，摇匀。用干燥滤纸滤过，弃去初滤液，精密量取续滤液5ml，置50ml量瓶中，加乙醇至刻度，再精密吸取5ml，置25ml量瓶中，加乙醇至刻度，摇匀。照分光光度法(药典附录31页)，在275士1nm的波长处测定吸收度，按的吸收系数为673计算,即得。所含黄酮以黄芩苷计算。

4.微波提取法测定黄芩中黄芩苷的含量
4. 1 供试品溶液的制备 取黄芩饮片样品，粉碎( 过 40 目筛) ，精密称定约 0. 15 g，置微波提取罐中，精密加入 30% 乙醇 20 mL，称定质量，微波协助萃取，5 min 内升温至 120 ℃ ，保温 10 min，取出，冷却至室温，再精密称定，用 30% 乙醇补足减失的质量，过滤，取续滤液 1 mL 置 10 mL 量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，即得。
4. 2 对照品溶液的制备 取黄芩苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每 1 mL 含 60 μg 的溶液，摇匀，即得。
4. 3 色谱条件 Dikma Diamonsil C18色谱柱( 4. 6mm × 150 mm，5 μm) ，流动相甲醇-水-磷酸 ( 47 ∶ 53 ∶0. 2 ) ， 检 测 波 长 280 nm， 柱 温 30 ℃ ，流速 1 mL·min－ 1。
4. 4 样品测定 取黄芩样品，按 2. 1 供试品溶液的制备项下制备，按 2. 3 色谱条件进行测定，计算黄芩苷的含量。

体会和疑问：微波提取法比药典法大幅度缩短了提取时间，由加热3h缩短为微波提取15 min，微波法比药典法提取时间缩短了 94. 4% ，因此微波提取法可用于黄芩中黄芩苷的含量测定。为什么药典中不选用微波提取法进行推广？