57双水相萃取解析.pptx

第七节第七节 双水相萃取双水相萃取萃取新技术之萃取新技术之一、概述一、概述 双双水水相相萃萃取取（Two-aqueous phase extraction）又又称称水水溶溶液液两两相相分分配配技技术术（Partion of two aqueous phase system）是是近近年年来来出出现现的的引引人人注注目目、极极有有前途的新型分离技术。前途的新型分离技术。其其特特点点是是能能够够保保留留产产物物的的活活性性，操操作作可可连续化，能耗低，处理容量大。连续化，能耗低，处理容量大。双双 水水 相相 萃萃 取取 现现 象象 最最 早早 是是 1896年年 由由Beijerinck在在琼琼脂脂与与可可溶溶性性淀淀粉粉或或明明胶胶混混合合时时发发现现的的，被被称称为为“聚聚合合物物的的不不相相溶溶性性”。20世世 纪纪 60年年 代代 瑞瑞 典典 Lund大大 学学 的的Albertsson P A及及其其同同事事们们最最先先提提出出双双水水相萃取技术并做了大量工作。相萃取技术并做了大量工作。1989年年Diamond等等推推导导出出生生物物分分子子在在双双水相体系中的分配模型，但尚有局限。水相体系中的分配模型，但尚有局限。由由于于成成本本方方面面的的原原因因，双双水水相相萃萃取取技技术术上上的优势被削弱，真正工业化的例子很少。的优势被削弱，真正工业化的例子很少。70年年代代中中期期西西德德的的Kula M R和和Kroner K H等等人人首首先先将将双双水水相相系系统统应应用用于于从从细细胞胞匀匀浆浆液液中中提提取取酶酶和和蛋蛋白白质质，大大大大改改善善了了胞胞内酶的提取效果。内酶的提取效果。二、双水相体系的形成二、双水相体系的形成 典典型型的的例例子子如如在在水水溶溶液液中中的的聚聚乙乙二二醇醇（PEG）和和葡葡聚聚糖糖（DEX），各各溶溶质质均均为为低低浓浓度度时时，可可得得到到单单相相匀匀质质液液体体；当当溶溶质质浓浓度度增增加加时时，溶溶液液变变得得浑浑浊浊，静静止止形形成成双双液层：上层富集液层：上层富集PEG，下层富集葡聚糖。，下层富集葡聚糖。葡葡聚聚糖糖本本质质上上是是一一种种几几乎乎不不能能形形成成偶偶极极现现象象的的球球形形分分子子，而而PEG是是一一种种具具有有共共享享电电子子对对的的高高密密度度直直链链聚聚合合物物。各各个个聚聚合合物物分分子子都都倾倾向向于于在在其其周周围围有有相相同同形形状状、大大小小和和极极性性的的分分子子，同同时时，由由于于不不同同类类型型分分子子间间的的斥斥力力大大于于同同它它们们的的亲亲水水性性有有关关的的相相互互吸吸引引力力，因因此此聚聚合合物物发发生生分分离离，形形成成二二个个不不同同的的相相，这这就就是是所所谓谓的的“聚聚合合物物不不相相溶性溶性”。三、双水相系统的重要特征三、双水相系统的重要特征两相的黏度：萃取相在两相的黏度：萃取相在210mPa.s范围范围内，而发酵液匀浆相在内，而发酵液匀浆相在10010000mPa.s 范围内。范围内。双水相系统呈现出低的界面张力。双水相系统呈现出低的界面张力。四、双水相体系的类型四、双水相体系的类型聚丙二醇聚丙二醇聚乙二醇、聚乙烯醇、葡聚糖、羟丙基葡聚糖聚乙二醇、聚乙烯醇、葡聚糖、羟丙基葡聚糖聚乙二醇聚乙二醇聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、葡聚糖、聚蔗糖聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、葡聚糖、聚蔗糖硫酸葡聚糖钠盐硫酸葡聚糖钠盐羧基甲基葡聚糖钠盐羧基甲基葡聚糖钠盐聚丙烯乙二醇聚丙烯乙二醇甲基纤维素甲基纤维素羧甲基葡聚糖钠盐羧甲基葡聚糖钠盐羧甲基纤维素钠盐羧甲基纤维素钠盐聚乙二醇聚乙二醇磷酸钾、硫酸铵、硫酸钠、硫酸镁、酒石酸钾钠磷酸钾、硫酸铵、硫酸钠、硫酸镁、酒石酸钾钠表表1 几种典型双水相体系几种典型双水相体系五、双水相萃取的理论基础五、双水相萃取的理论基础相平衡关系相平衡关系图图1 PEG/DEX体系相图体系相图生物大分子在两相中的分配仍服从分配定生物大分子在两相中的分配仍服从分配定律。律。物质在两相中的分配物质在两相中的分配六、双水相系统中物质分配的影响因素六、双水相系统中物质分配的影响因素系统聚合物组成系统聚合物组成系统物化性质系统物化性质盐及缓冲液盐及缓冲液温度温度 当两种不同聚合物的溶液混合时，可能存当两种不同聚合物的溶液混合时，可能存在三种情况：在三种情况：完全混溶性（匀相溶液）；完全混溶性（匀相溶液）；物理的不相溶性（相分离）；物理的不相溶性（相分离）；复杂的凝聚（相分离）。复杂的凝聚（相分离）。1、双水相中聚合物组成的影响、双水相中聚合物组成的影响eg.离子和非离子型聚合物都可使用在双水离子和非离子型聚合物都可使用在双水相系统的构成上，但当这两种聚合物是离相系统的构成上，但当这两种聚合物是离子化合物并带有相反电荷时，它们相互吸子化合物并带有相反电荷时，它们相互吸引并发生复杂的凝聚。引并发生复杂的凝聚。图图2 200C聚乙二醇聚乙二醇4000/葡聚糖系统双节点曲线，葡聚糖系统双节点曲线，比较三种不同类型的葡聚糖比较三种不同类型的葡聚糖 虽然葡聚糖虽然葡聚糖T500和水解过的葡聚糖和水解过的葡聚糖相对分子量在同一相对分子量在同一数量级，但二者的数量级，但二者的双节线离得远，这双节线离得远，这种差别是由于聚合种差别是由于聚合度分布性效应造成度分布性效应造成的。的。蛋白质蛋白质相对分子相对分子量量葡聚糖组成葡聚糖组成葡聚糖葡聚糖40葡聚糖葡聚糖70葡聚糖葡聚糖220葡聚糖葡聚糖500葡聚糖葡聚糖2000细胞色素细胞色素123840.18 0.140.150.170.21牛血清蛋白牛血清蛋白690000.180.230.310.340.41乳酸脱氢酶乳酸脱氢酶1400000.060.050.090.160.10过氧化氢酶过氧化氢酶2500000.110.230.400.791.15磷酸果糖磷酸果糖 激酶激酶8000000.010.010.010.020.03表表2 葡聚糖分子对不同相对分子量蛋白质分配系数的影响葡聚糖分子对不同相对分子量蛋白质分配系数的影响蛋白质蛋白质相对分相对分子量子量体系的组成体系的组成D-500（9%）/P-4000(7.1%)D-500（8%）/P-6000(6%)D-500（8%）/P-20000(6%)D-500（8%）/P-40000(6%)细胞色素细胞色素123840.170.170.130.12牛血清蛋白牛血清蛋白690000.520.340.140.11乳酸脱氢酶乳酸脱氢酶1400000.130.080.050.03过氧化氢酶过氧化氢酶2500000.820.380.160.10表表3 PEG分子对不同相对分子量蛋白质分配系数的影响分子对不同相对分子量蛋白质分配系数的影响 由由表表2、表表3可可见见，蛋蛋白白质质的的分分配配系系数数随随着着葡葡聚聚糖糖相相对对分分子子量量的的增增加加而而增增加加，随随着着PEG相对分子量的增加而降低。相对分子量的增加而降低。葡聚糖也可葡聚糖也可由其他多糖代替，由其他多糖代替，可得到类似的结可得到类似的结果，如右图所示。果，如右图所示。图图4 200C聚乙二醇聚乙二醇/羟丙基淀粉羟丙基淀粉和聚乙二醇和聚乙二醇/葡聚糖系统的相图葡聚糖系统的相图2、双水相系统物理化学性质的影响、双水相系统物理化学性质的影响 双双水水相相系系统统的的性性质质主主要要取取决决于于下下列列物物理理参参数数：密密度度（）和和两两相相间间密密度度差差、黏黏度度（）和两相间黏度差、表面张力（）和两相间黏度差、表面张力（）。）。PEG/质质量分数量分数%Dextran/质量分数质量分数%界面宽度界面宽度/质量分数质量分数%VT/VB/(Kg/m3)/(mPa.s)g/(mPa.s)/(mN/m)6.05.86.21.5184.1430.3*10-26.56.110.51.4323.61000.12*10-28.07.619.81.7644.33.32.0*10-29.08.524.81.9794.43644.1*10-2表表4 聚乙二醇聚乙二醇4000/葡聚糖葡聚糖PL500系统的物理化学常数系统的物理化学常数eg.PEG-(NH4)2SO4双水相系统萃取糖化酶双水相系统萃取糖化酶 (NH4)2SO4浓浓度度固固定定不不变变时时，增增加加PEG400的的浓浓度度有有利利于于酶酶在在上上相相的的分分配配，当当PEG400浓浓度度在在2527%时时，分分配配系系数数高高达达47.3，浓度过高则不利于酶的分配。，浓度过高则不利于酶的分配。PEG400浓浓 度度 固固 定定 为为 26%时时，增增 加加(NH4)2SO4浓度，糖化酶的分配系数也增大。浓度，糖化酶的分配系数也增大。(NH(NH4 4)2 2SOSO4 4的最适浓度为的最适浓度为16%16%。酵母菌存在下酵母菌存在下肺炎克雷氏菌存在下肺炎克雷氏菌存在下图图5 细胞物质浓度对酶分配的影响细胞物质浓度对酶分配的影响3、盐和缓冲液的影响、盐和缓冲液的影响 水水溶溶液液中中存存在在的的离离子子会会影影响响溶溶质质在在两两相相间间的的分分配配。因因为为阴阴阳阳离离子子的的不不均均匀匀分分配配会会产产生生相相界界面面电电位位，影影响响蛋蛋白白质质、核核酸酸等等荷荷电电大大分分子子的的分分配配。通通常常增增加加盐盐浓浓度度可可提提高高酶酶的的分配系数。分配系数。图图6 聚乙二醇聚乙二醇4000/硫酸铵系统中，支链淀硫酸铵系统中，支链淀粉酶的分配系数与硫酸铵总浓度的关系粉酶的分配系数与硫酸铵总浓度的关系 eg.在在PEG-DEX系系统统中中加加入入NaClO4或或KI，能能增增加加上上相相对对带带正正电电物物质质的的亲亲和和效效应应，并并迫迫使使带带负负电电物物质质进进入入下下相相；若若加加入入Li3PO4，则与上述效应刚好相反。，则与上述效应刚好相反。因因此此，只只要要设设法法改改变变界界面面电电位位，就就能控制蛋白质等荷电大分子转入某一相。能控制蛋白质等荷电大分子转入某一相。图图7 聚乙二醇葡聚糖系统中支链淀粉酶的分配与聚乙二醇葡聚糖系统中支链淀粉酶的分配与pH值的关系值的关系4、温度的影响、温度的影响 温温度度的的变变化化虽虽然然影影响响液液相相物物理理性性质质的的变变化化，从从而而影影响响溶溶质质在在两两相相间间的的分分配配，但但总总的的来来说，影响不敏感。说，影响不敏感。图图8 不同温度下葡聚糖不同温度下葡聚糖500/聚乙二醇聚乙二醇6000/水系统相图水系统相图七、双水相系统的应用七、双水相系统的应用食品工业食品工业生物行业生物行业表表5 双水相萃取在生物分离中的应用双水相萃取在生物分离中的应用酶的提取和纯化酶的提取和纯化 菌体菌体酶酶双水相组双水相组成成细胞浓度细胞浓度/%分配系分配系数数收率收率/%Candida Boidinii过氧化氢过氧化氢酶酶PEG-粗粗Dex202.9581Saccharomgces Cerevisine已糖激酶已糖激酶PEG/盐盐308.292Escherichia Coli天冬氨酸天冬氨酸酶酶PEG1550/磷酸钾盐磷酸钾盐255.796表表6 从破碎的细胞中萃取分离酶从破碎的细胞中萃取分离酶7细胞组织的分离细胞组织的分离 用用三三甲甲胺胺PEG/Dextran 体体系系可可分分离离含含胆胆碱受体的细胞；碱受体的细胞；病毒的纯化：病毒的纯化：用用PEG/NaDS 体体系系可可对对脊脊髓髓病病毒毒和和腺腺病病毒进行纯化毒进行纯化,回收率可达回收率可达90%生生长长激激素素的的纯纯化化：用用PEG/盐盐体体系系可可提提纯人的生长激素纯人的生长激素,回收率回收率Y=60%；干干扰扰素素的的分分离离：用用PEG-磷磷酸酸酯酯/盐盐体体系系分分离离-干干扰扰素素,Y=97%;从从重重组组大大肠肠杆杆菌菌匀匀浆浆中中提提取取-干干扰扰素素,Y=99.15%,纯度提高纯度提高25 倍倍生物小分子物质的分离：生物小分子物质的分离：双双水水相相体体系系萃萃取取分分离离技技术术对对青青霉霉素素G钠钠盐盐等等生生物物小小分分子子物物质质的的分分离离也也可可以以取取得得理理想想效效果；果；药物的分离和提纯：药物的分离和提纯：如如基基因因工工程程药药物物、抗抗菌菌素素、动动、植植物物药药物物的的提提取取，也也可可以以利利用用该该技技术术开开发发我我国国传传统统的中草药；的中草药；在分析检测中的应用：在分析检测中的应用：液液-液分配层析液分配层析(LL PC)将将一一种种聚聚合合物物连连接接在在固固体体颗颗粒粒(支支持持物物)上上，另另一一种种聚聚合合物物的的溶溶液液作作为为流流动动相相，这这种种柱柱层层析析技技术术可可分分离离蛋蛋白白质质、核核酸酸以以及及细细胞胞混混合物。合物。食品工业中用来从酸水解产物中提取风味食品工业中用来从酸水解产物中提取风味物质：物质：二肽、氨基酸、核苷酸等二肽、氨基酸、核苷酸等八、双水相萃取的工艺流程双水相萃取的工艺流程目的产物的萃取目的产物的萃取PEG的循环的循环无机盐的循环无机盐的循环连续错流萃取回收酶的流程图连续错流萃取回收酶的流程图九、成相聚合物的回收九、成相聚合物的回收u膜处理膜处理u沉淀沉淀u离子交换和吸附离子交换和吸附u电泳或亲和分配和双水相萃取相结合电泳或亲和分配和双水相萃取相结合蛋白质分配在盐相：盐可用错流操作方式蛋白质分配在盐相：盐可用错流操作方式下，用超滤或渗析等膜过滤回收；下，用超滤或渗析等膜过滤回收；蛋白质积聚在蛋白质积聚在PEG中：加入盐使蛋白质重中：加入盐使蛋白质重新分配到盐相中。新分配到盐相中。PEG的分离同样可用膜的分离同样可用膜分离来实现分离来实现。十、双水相萃取技术的进展十、双水相萃取技术的进展1、廉价双水相体系的开发、廉价双水相体系的开发体系体系优点优点缺点缺点PEG/DEX盐浓度低，活性盐浓度低，活性损失小损失小价格贵，黏度大，分价格贵，黏度大，分相困难相困难PEG/盐盐成本低，黏度小成本低，黏度小盐浓度高，活性损失盐浓度高，活性损失大，界面吸附多大，界面吸附多表表6 两种双水相体系的比较两种双水相体系的比较 可可见见，高高聚聚物物-高高聚聚物物体体系系对对活活性性物物质质变变性性作作用用小小，界界面面吸吸附附少少，但但价价格格高高。因因而而寻寻找找廉廉价价的的高高聚聚物物-高高聚聚物物体体系系是是双双水水相相萃取技术发展的一个重要方向。萃取技术发展的一个重要方向。目目前前比比较较成成功功的的是是用用变变性性淀淀粉粉PPT代代替替昂昂贵贵的的DEX。PPT-PEG体体系系已已被被用用于于从从发发酵酵液液中中分分离离过过氧氧化化氢氢酶酶、-半半乳乳糖苷酶等。糖苷酶等。该体系具有很多优点：该体系具有很多优点：比比PEG-盐盐体体系系稳稳定定，与与PEG-DEX体体系系相图相似；相图相似；蛋白质溶解度大；蛋白质溶解度大；黏度小；黏度小；价格便宜。价格便宜。2、双水相萃取技术同其他分离技术结合、双水相萃取技术同其他分离技术结合 .双水相体系同生物转化相结合双水相体系同生物转化相结合图图10 利用双水相体系将木质纤维素转化为乙醇流程利用双水相体系将木质纤维素转化为乙醇流程利用葡萄糖和淀粉生产乙醇；利用葡萄糖和淀粉生产乙醇；利用葡萄糖生产丙酮丁醇；利用葡萄糖生产丙酮丁醇；利用淀粉和纤维素水解生产葡萄糖；利用淀粉和纤维素水解生产葡萄糖；水解酪蛋白；水解酪蛋白；发酵生产乳酸；发酵生产乳酸；将青霉素将青霉素G转化为氨基青霉烷酸等转化为氨基青霉烷酸等.双水相萃取技术同膜分离技术相合双水相萃取技术同膜分离技术相合萃取物萃取物内侧流内侧流体体外侧外侧流体流体分配系分配系数数内侧流内侧流速速/cm.s外侧流外侧流速速/cm.s传质系数传质系数/cm/s细胞色素细胞色素C磷酸盐磷酸盐PEG0.1816.36.65.5*10-6肌红蛋白肌红蛋白 磷酸盐磷酸盐PEG0.0094.05.07.5*10-7尿激酶尿激酶磷酸盐磷酸盐PEG0.6516.35.02.0*10-4表表7 双水相萃取同膜分离结合的例子双水相萃取同膜分离结合的例子 .双水相萃取同亲和层析相结合双水相萃取同亲和层析相结合 在在PEG或或DEX上上接接上上一一定定的的亲亲和和配配基基，这这样样不不但但使使体体系系具具有有双双水水相相处处理理量量大大的的特特点，而且具有亲和层析专一性高的特点。点，而且具有亲和层析专一性高的特点。亲和配基亲和配基亲和双水相亲和双水相亲和层析亲和层析收率收率%处理量处理量u/ml染料浓染料浓度度umol.m收率收率%处理量处理量u/ml染料浓度染料浓度umol.mCibacron-Blue3GA90120202460202Procion-Rec HE-3B95100121585354表表10 亲和层析和亲和双水相比较亲和层析和亲和双水相比较 近近年年来来亲亲和和双双水水相相发发展展极极为为迅迅速速，仅仅在在PEG上上可可接接的的配配基基就就有有十十多多种种，分分离离产产物物达达到到几几十十种种，分分配配系系数数成成百百上上千千倍倍的的提提高。高。思考:1 1、双水相体系是如何形成的？、双水相体系是如何形成的？2 2、双水相萃取的基本原理是什么？、双水相萃取的基本原理是什么？3 3、影响双水相萃取得率的因素有哪些、影响双水相萃取得率的因素有哪些？4 4、试分析亲和双水相的分离机制。、试分析亲和双水相的分离机制。