灵芝属(Ganoderma)分类现状研究.doc

灵芝属（Ganoderma）的当代分类现状及研究技术
(07级微生物学 陈博 Y0721412)

摘要 灵芝( Ganoderma ) 有“仙草”之美誉,从灵芝中提取的多种物质如灵芝多糖、三萜类、蛋白质类等化合物有提高机体免疫力、肝脏解毒及排毒能力以及抑制恶性肿瘤生长等作用 ,因而受到了众多研究者的重视。目前,被人们利用的灵芝近缘种已达18 种,几乎都隶属于灵芝属;同时灵芝属真菌菌种(76 种) 又占灵芝科菌种(98 种)的绝大多数,作为灵芝科的一个大属。故对灵芝属真菌进行系统深入的研究,对我们全面了解与开发利用灵芝类物种具有重要的意义。分类学研究又是进行系统研究的一个重要方面。在生物学技术的迅猛发展与生物分类学研究的不断深入的情况下,生物分类系统已由过去的五界系统提升为八界系统,在这样的变化中,灵芝属分类情况也发生了一定的变化。为了全面了解灵芝属真菌的资源状况,合理利用灵芝资源,本文将对灵芝属资源的分类现状进行分析与研究。
关键词 灵芝属( Ganoderma )；分类学研究；近缘种；

灵芝属级特征：灵芝为灵芝科灵芝属植物Ganoderma lucidum(Leyss. exFr. ) Karst . 的子实体。菌盖为半圆形或肾形,边缘薄而平截。直径10～18cm ,厚1～2cm ,柄长3～7cm。表面为环状棱形。颜色为黄褐色或红褐色。有漆样光泽。菌柄侧生,少偏生。菌肉白色至淡棕色。孢子直径8. 5～11. 5 ×5～6. 5μm ,卵状椭圆形,顶端平截,孢壁双层,外壁光滑,透明无色,内壁褐色有小刺。气微香,味苦涩。紫芝为灵芝科灵芝属植物Gano2derma sinense Zhao ,Xu et Zhang 的子实体。菌盖为半圆形或肾形,边缘薄或钝厚,有时断截状,全缘或波状至浅裂,直径5～11cm ,厚1～2cm ,柄长0. 6～11～20cm ,表面为同心环沟。颜色为紫黑色。有漆样光泽。菌柄侧生,少偏生。菌肉锈褐色。孢子直径10～12. 5 ×7～8. 5um ,卵形至近椭圆形,孢壁双层,外壁无色,平滑,内壁褐色,有显著小刺。气微香,味苦涩。
1 灵芝属真菌分类学方法学研究
1．1 　传统分类方法
　传统分类各派别的分类见解及分类系统灵芝属传统分类上各分类学家都以灵芝形态学特征为主,但对灵芝各表型性状在分类上孰优孰重,各有主张。Haddow(1931) 第一个应用皮壳构造来鉴定灵芝属的若干种。而Steyaert (1980) 依据皮壳构造又把灵芝属分为4 个灵芝亚属。但赵继鼎(2000) 指出灵芝科同一种不同的标本上皮壳构造有可能变化,甚至在同一号标本中也有变化。过分强调这一特征在分类上的作用是不合适的 。Corner (1983) 也认为利用皮壳构造作为种以上单位的分类依据是比较合适的,而不适合种以下单位的分类。
在灵芝科担孢子方面,由于其担孢子具有特殊的构造,使其成为最可靠的分类依据,也是Donk(1948) 建立灵芝科的唯一基础 。而对于灵芝孢壁, Heim ( 1962) , Furtado ( 1962) , Pegler 与Young(1973) 及Corner (1983) 都认为灵芝属与假芝属的孢壁有5 层组成,但他们各自说的部分概念并不一致,但都应用两层壁的概念,即外(exosporium) 与内壁(endosporium)。
从Karsten (1881) 以Polyporus l ucidus 为模式种建立灵芝属以来, 各分类学家通过对灵芝外部形态、内部微观结构等方面的深入研究基础上,对灵芝的外观特征在灵芝分类上的作用都有独自的见解,形成了各自的分类系统。在Potouillard (1889) 分类系统中,灵芝属分成两组, 即灵芝组与假芝组。而Karsten ( 1889) 把Polyporus applant us 从灵芝属中分离出来建立树舌灵芝属( Elf vingia P. karst . ) 。在1939 年Imazeki又在灵芝属下设立3 个亚属,即灵芝亚属、树舌灵芝亚属、粗皮灵芝亚属。依据菌盖皮壳构造的不同,Steyaert (1980) 又在Imazeki 灵芝属的三个亚属基础上新增了2 个亚属:类交织皮壳亚属与密交织皮壳亚属。但不再把原粗皮灵芝亚属设为亚属,把它丛亚属的位置上删去了,即只包括4 个亚属。而赵继鼎(1989) 在灵芝属下设立三亚属两组,这是被许多分类学家所接受的的一个系统,这3 个亚属包括灵芝亚属、树舌灵芝亚属与粗皮灵芝亚属。综观这几个分类系统,只有Potouillard (1889) 、Steyaert (1980) 与赵继鼎(1989) 在灵芝亚属下设立组,且都为2 个组,都包括灵芝组,但另外1 个组都不同,分别为假芝组、等径孢组与紫芝组。灵芝属传统分类方法都以灵芝形态特征为主,依据形态学差异而建立的分类系统至今仍在分类研究中占据着主导地位,比如国内灵芝属分类研究工作者大多仍采用赵继鼎灵芝属(1989) 分类系统,即把灵芝科分为4 个属,3 亚属,2 亚组，见表1。
表1 灵芝科分属检索表
1.子实体有柄，中生、偏生或侧生…………………………………………………………2 1.子实体无柄，扇形至蹄形…………………………………………………………………3
  2.孢子卵形，顶端平截………………………………………………灵芝属Ganoderma
  2.孢子球形或近球形，顶端不平截…………………………………乌芝属Amauroderma 3.双系菌丝，角质菌丝暗色………………………………………………扁芝属Elfuingia 3.三系菌丝，角质菌丝淡色………………………………………………灵芝属Ganoderma
灵芝属(Ganoderma)又分为二个组，四个亚组，其分组的检索表：
1.菌肉白色、淡白色、材白色或者分二层；上层淡白色，近菌管层淡褐色至褐色………
…………………………………………………………………… 灵芝组Sect Ganoderma
（1）菌盖的皮壳由栅状细胞组成…………… ……………灵芝亚组Subsect Ganoderma
（2）菌盖的皮壳不是栅状细胞组成……………… 粗皮灵芝亚组Subsect Trachyderma
1.菌肉为均匀的褐色、深褐色至栗褐色……………………………紫芝组Sect Phaeonema
（1）菌盖的皮壳是由栅状细胞组成……………………… 紫芝亚组Subsect Phaeonema
（1）菌盖的皮壳不同栅状细胞组成…………………………树舌亚组Subsect Elfvingia

灵芝组(Sect Ganoderma)的分种检索表（常见种）

1.孢子内壁有显著的小刺或仅具细微小刺 ………………………………………………2
1.孢子内壁无小刺，或具有不明显…………………………………………………………3
2.子实体无柄，或具柄基……………………………………… ………………………11
2.子实体有柄…………………………………………………………… ……………………5
3.姿势体大,近圆形,直径达43cm,菌盖呈覆瓦状,孢子（6.9~8.7)μm×(5.2~6.5)μmμm………
………………………………………………………………大圆灵芝G. rotundatum
3.与上述特征不同………………………………………………………………………………4
4.菌盖半圆形或近扇形、孢子（7.8~10.4)μm×(5.2~6.9)μm……………………………
…………………………………………………………………… 无柄灵芝G. sessile
4.菌盖呈龟壳状，有柄基，孢子（7.8~8.7)μm×(5.7~7)μm ……………黄灵芝G. luteum
5.子实体生于针叶树干基部，柄粗壮，孢子（9~11)μm×(6~8)μm ………松杉树芝G. tsugae
5.子实体生于阔叶树干上或木桩、腐木上……………………………………………………6
6.孢子通常小于11 μm ……………………………………………………………………7
6.孢子通常大于11 μm ……………………………………………………………………8
  7.盖面乌黑色，柄长可达23cm，孢子（8~10)μm×(5.5~7.5)μm……………黑灵芝G. atrum
  7.盖面红褐色到黑褐色，柄长4~15cm ，孢子（8.7~10.4)μm×(5.2~6.9)μm………………
…………………………………………………………………海南灵芝G. hainanense
8.盖面无光泽，菌管易破碎，孢子（9~12)μm×(6.5~8) μm …………蒙古灵芝G. mongolicum
8.盖面有光泽，菌管不易破碎……………………………………………………………………9
  9.盖面光泽较弱，凸凹不平，有纵皱，孢子（8.7~11.3）μm×(5.2~6.9)μm…………………
……………………………………………………………………弱光泽灵芝G. curtisii
  9.盖面特征与上述不同…………………………………………………………………………10
  10.菌盖半圆形至近圆形，12×20cm，厚2cm，孢子[8.5~11.2（12.1)]μm×(5.2~6.9) μm…………………………………………………………………………………灵芝G. lucidum
  10.菌盖小，（2~2.7)×(2.4~4.5) cm，厚0.5~1.5cm，孢子[10~12（13）]μm×（6.2~8.7)μm…
      …………………………………………………………………喜热灵芝G. calidophilum
11.子实体无柄，盖面紫褐色到黑褐色，孢子（9.5~12.1)μm×(6.1~6.9)μm…………………
……………………………………………………………………紫光灵芝G. valesiacum
11.子实体有柄……………………………………………………………………………………12
  12.菌柄分枝呈鹿角状，子实层不孕，偶见成熟孢子，（8.7~10.4)μm×(5.2~6.9)μm…………
………………………………………………………………………鹿角芝G. amboinense
12.与上述特征不同…………………………………………………………………………13
13.子实体无柄或有短而粗之柄，菌肉有环纹，孢子（7.5~9.7）μm×(5.7~6.9)μm …………
     ……………………………………………………………………………薄树芝G. capense
13.子实体有细而长之柄，菌肉无环纹…………………………………………………………14
14.盖面紫褐 色或近黑褐色，有稠密的环纹，孢子（8.7~10.4）μm×(5.7~6.9) m栽培种…
……………………………………………………………………………密纹薄芝G. tenue
14.盖面红褐色,无环纹,孢子（8.7~10.4）μm×(5.2~6.2)μm……………………………………
…………………………………………………………………………弯柄灵芝G. flexipes

但外观特征是细胞内部基因与外界环境因素综合作用的结果,环境因素的差异常导致外部表型的变化,如仅依靠外观特征进行分类研究,会导致分类结果与系统进化的不一致性,因此开发利用新的、稳定的形态标记已成为传统分类的内容之一。
2　灵芝属现代生物技术分类方法
2.1　蛋白质水平
2.1.1　同工酶技术与等位酶技术
每一种生物体内催化同一生物化学反应的酶类种类数量及分子量有所差异,可以把其细胞的酶液提取后通过电泳分离及显色就可以得到同工酶谱,通过对不同灵芝真菌同工酶的分子量、数量及种类分析就可以用于分类鉴定依据之一。例如林兴生等通过对11种菌株用短段木熟料栽培法进行栽培之后,并经过PAGE分析,分析测定相关的酶谱相似度(T)与联合系数( S) ,结果发现:其中的1个与其余10个菌株间的差异最为明显,因此与其它菌株的亲缘关系最远。这种方法优点是操作简单,简便迅速,易于掌握,而且投资少。但是同工酶技术也易受到菌龄大小、采样部位等的影响而出现结果的不稳定性。
2.1.2　蛋白质立体结构测定
近年来测定蛋白质的立体结构成为获得分子系统学信息的新技术。由于蛋白质高级结构的进化比一级结构要保守,因此根据高级结构建立的系统发育关系更加可靠,但高级结构的研究必须在一级结构清楚的情况下进行,纯结晶蛋白样品获得的程序复杂,序列分析仪器精密昂贵,非一般生化或分子生物学实验室所能完成。然而生物大分子序列与空间立体结构最能准确反应系统演化关系,随着技术的不断进步,蛋白质立体结构分析在分子系统学上必将得到广泛的应用。
2.2　分子水平
2.2.1　核酸(G +C )摩尔百分含量分类技术在真菌中各个种属科纲都有特定的( G + C)摩尔百分含量。遗传关系相近的个体间有相似的( G+C)摩尔百分含量,如果两个菌株的( G + C)摩尔百分含量差异大就不是一个种。一般认为如果DNA (G +C)摩尔百分含量mol%差异在4% ～5%,则可认为是一个种;若差异在10% ～15% ,就认为不是一个种;若差异在20% ～30% ,就认为是不同的属或科。
2.2.2　限制性内切酶片断长度多态性技术(Re2s tric tio n F ra gm e n t Leng th Po lymo rp h ism , RFLP )多态性(RFLP)研究是在种、种内以及种群水平上进行分类研究的有效手段。RFLP是80 年代中期发展起来的一种DNA多态性分析技术,它将目标DNA 序列经一定数目与种类的限制性内切酶(RE)进行酶切,由于不同的目标DNA的序列结构(遗传信息)有差异, RE在其上的识别位点的数目与距离就发生了改变,因此产生相当多的大小不等的DNA片段。然后通过Southern杂交可以把与标记DNA相关的片段检测出来,从而构建出多态性图谱(较简单的靶序列,如mtDNA可以省却杂交直接用电泳方法检测) ,进行系统进化与亲缘关系的分析分析是DNA序列分析的一种简化,利用DNA限制性内切酶在特定位置上将DNA切割成不同的片断,经过电泳分析后对得到的电泳图谱进行分析比较。限制性内切酶有许多种,每一种能特异地识别某一种DNA序列,由于在DNA序列中酶切位点的数目与种类分别不同,所以酶切后获得的DNA 片断数目与大小不同,在通过电泳后就可以获得物种的特异DNA多态性谱带,为其亲缘关系及进化类别等分析提供数据支持。但是, RFLP技术DNA含量用量大、费时费事、投入资金多与重复性差等缺点极大的限制了其应用。
2.2.3 　随机扩增多态性DNA (Random Amp lifie dPo lymo rp h ic DNA, RAPD) 。RAPD技术是90年代发展起来的建立在PCR技术基础上的一种分子标记手段。用随机合成的寡核苷酸引物,通过PCR技术反应对物种DNA进行多次扩增,其扩增出的每一种DNA片断代表一个遗传位点。不同的种属科纲门界具有相同与不同的遗传位点,这些信息都可作为分类依据。具有鉴定迅速,用量少,可重复性等特点。如许瑞祥利用RAPD所得的多型性图谱鉴别灵芝复合种(Ganoderm a lu2cidum comp lex)间亲缘关系,进一步标记出个品种间的距离,辨认了灵芝同种不同品系的菌株。因此,以核糖体RNA基因核苷酸序列相似所归纳的同种菌株间,可以利用随机扩增全基因的多型性图谱进行个别品种的标示〔5, 11〕。但是RAPD的最大缺点是对反应条件非常敏感,而且重复性差。
2.2.4　核糖体RNA基因核苷酸序列分析。目前常用核糖体RNA 基因( ribosomal RNAgene)作为分子生物学分类的指标,这是由于复制数目很高,并且每一单位的rDNA基因均具有保留区( conserved region)与可变区( variable region)掺杂分布。在探讨高级分类关系时,保留区的核苷酸序列具有辨别科或属的专一功能,而可变区的核苷酸序列有助于种间的区别。许瑞祥等〔5, 13～15〕使用ITS序列分析技术,分析了来自各国的29个灵芝(G. luci2dum )菌株与标本,并将其核苷酸序列经分子系统软件( Phylogenetic Analysis Using Parsimony, PAUP)分析后,配合传统形态生理与交配试验的结果,结果显示29株样品可以明显区分为6组,在各组间的菌种。其ITS区域核苷酸序列的差异性在0% ～2% ,并具有相似的生理与形态特征,所以位于同组间的分类地位应可视为同种。
2.2.5　Mn - SOD基因核苷酸序列分析。由于灵芝属菌株培养液中超氧化物歧化酶( su2peroxide dismutase, SOD)的活性成分较一般真菌为高,因此为了研究灵芝属来源的超氧化物歧化酶基因组成的特性,王惠芳等〔5〕根据担子菌纲的Mn -SOD基因核苷酸序列设计引物并对灵芝属菌株Mn- SOD基因进行扩增反应。测序结果发现其中有2段内含子,虽然不同菌株间的内含子长度有差异,但是其插入的位置完全相同。分析各菌株Mn SOD基因中的表达序列部分时,显示在不同菌株间其表达序列的相似性高,但是比较表达序列的长度可见,Mn - SOD基因中的两段非表达的内含子在不同菌株间其差异极为显著。将此Mn - SOD基因核苷酸序列经PAUP ( Phylogenetic AnalysisUsing Parsi2mony)程序统计分析,结果显示,在Mn - SOD基因中包含区别灵芝属、种与品种的个别核苷酸序列,不但能区别种间的差异,而且亦能进一步区分同种菌株间彼此的亲疏关系。
2.2.6 DNA分子杂交技术。DNA分子杂交技术原理是变性的单链DNA在适当条件下可以靠碱基互补配对而复性成双链,一般认为,同种异株的真菌基因组DNA 序列差异较小,在35%以内,而对于属或属以上的分类鉴定宜采用DNA - rRNA杂交方法,因为rRNA在进化的过程中保守性强,用标记的rRNA分别与DNA杂交,易于获得被测DNA分子亲缘关系的资料。
2.2.7 扩增片断长度多态性技术(Amp lified F ra g2m en t Le ng th Po lymo rp h ism ,AFLP )。该方法是结合限制性片断长度多态性(RFLP)与随机引物扩增多态性DNA (RAPD)两项技术而形成的另一新的更有效的DNA指纹图谱技术,其工作原理是基因组DNA先经罕见切割酶与常用切割酶两种限制性酶消化后,然后在DNA片断末端接上接头,把接头序列与相邻的限制性位点序列作为引物结合位点,进行PCR扩增,而后再行DNA片断多态性分析,一般可使测试品种出现特定的DNA谱带。它的特点是多态性丰富,共显性表达,不受环境影响,无复等位效应,而且还具有带纹丰富,用样量少,灵敏度高,快速高效等特殊特点〔25～27〕。

3 两种分类方法比较:
由传统分类方法建立的分类系统目前在分类学界仍占据着举足轻重的作用,并为人类认识物种、了解与利用资源发挥了重要作用。但是,随着科学技术的发展与分子生物学的广泛应用,传统分类系统暴露出了一些缺陷与有待改进之处。如国内学者通过对从南美洲、北美洲、欧洲与亚洲地区采集的灵芝G. l ucidum 进行rRNA 基因的ITS 核苷酸序列分析,发现在传统分类上这些样本学名都为G. l ucidum , 但它们在rRNA 基因ITS 区域核苷酸序列存在差异,应分属于不同种。同样在松杉灵芝G. tsugae 菌株间也发现存在同名异株现象。这充分说明传统分类方法具有一定的局限性。表型只是基因型的表达结果,而基因型表达的启动与关闭可能会受到外界因素的影响,导致表型与基因型会存在一定差距。故基于基因型的以生物学技术手段建立的分类系统更能精确反映自然物种的本质联系与区别。

4 结束语
进一步完善与总与灵芝分析鉴定系统不仅可以逆向发现灵芝在各种不同疗效所用的灵芝种类,也可以提供检验单位辨别灵芝产品的优劣,所以灵芝的鉴定系统的完善与建立是有科学意义与市场前景的。同时建立统一以完善的鉴定系统应用于生产菌株的改良与筛选时,可作为确认菌种特性及其来源的稳定指标。也有助于改善灵芝产品的质量,促进灵芝产业的发展。

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