重组蛋白的分离纯化.ppt

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pombe,）,7,昆虫细胞,可以病毒感染的型式在成虫中生产，也可在体外培养细胞中生产蛋白,;,适合分泌型和膜蛋白的表达，有加糖修饰；,糖链有所区别，表达量有限；,作为药物宿主细胞未被,FDA,认可,8,CHO,细胞,可进行分泌表达，有天然立体结构，加糖方式与人体蛋白质完全一致；,表达量不够高，培养成本较高,9,动物乳腺组织,分泌生产有天然立体结构和活性的蛋白质至乳汁，产量高，分离纯化方便，特别适合药用蛋白的生产；,转基因动物制作花费巨大，实验周期长,10,鸟类输卵管组织,分泌生产有天然立体结构的蛋白质到蛋清，产量高，容易贮存和运输，分离纯化方便；,实验成本低，饲养费用低；,加糖方式可能与人有所不同,11,植物组织,植物可大面积种植，可以廉价大规模生产；,转基因植物制作费时，表达的组织特异性较难控制；,表达量较难提高，分离纯化不方便,12,体系选择,研究基因功能,:,大肠杆菌,裂殖酵母,昆虫细胞,CHO,细胞,多肽药物生产,:,大肠杆菌,毕氏酵母,CHO,细胞,乳腺组织,疫苗,:,大肠杆菌,酵母,大多数沿用细胞培养产物进行灭毒,单抗生产,:,杂交瘤细胞,工业酶生产,:,各种微生物,13,重组蛋白的分离纯化策略,重组蛋白分离纯化方法选择的基因原则,针对不同的产物表达形式采取不同的策略,针对不同性质的重组蛋白选择不同的层析类型,多种分离纯化技术的联合运用,合适分离纯化介质的选择,14,针对不同的产物表达形式采取不同的策略,采用,分泌型战略,表达重组蛋白，通常体积大、浓度低，因此应在纯化之前采用沉淀或超滤等方法先进行浓缩处理；,采用,包涵体型战略,表达重组蛋白，应先离心回收包涵体；,采用,融合型战略,表达重组蛋白，一般是胞内可溶性的，拟首先选用亲和层析进行纯化,表达在细胞膜和细胞壁之间,的间隙中的蛋白质，应用低浓度的溶菌酶处理，然后再用渗透压休克法释放重组蛋白。,15,针对不同性质的重组蛋白选择不同的层析类型,等电点,处于极端区域,（,pI,5,或,pI,8,）的重组蛋白应首选离子交换法进行分离，这样很容易除去几乎所有的杂蛋白；,重组蛋白特异性的,配体、底物、抗体、糖链,等都是首选亲和层析纯化方法的重要条件，原则是它们与目标蛋白之间的解离常数应在合适的范围内（,10,-8,-10,-4,mol/L,）；,疏水层析,和,反相层析,是根据蛋白质的,疏水性差异,进行分离的；,凝胶过滤层析,是根据蛋白的,分子量和体积差异,进行分离的；,径向层析,是近年来发展起来的集,层析分离,和,膜分离,于一体的一种复合技术，在流量、负荷量等参数方面显示出极大的优越性。,16,多种分离纯化技术的联合运用,在进行重组蛋白的纯化时，通常需要综合使用多种技术，一般来说，在选择分离纯化方法时应遵循下列原则：,应选择不同分离纯化机理的方法联合使用,应首先选择能除去含量最多杂质的方法,应尽量选择高效的分离方法,应将最费时、成本最高的分离纯化方法安排在最后阶段,17,合适分离纯化介质的选择,常用的蛋白质分离纯化介质有,Sephadex,和,Seperose,。,理想的分离纯化介质应具有下列性质：,对目标蛋白具有较高的分离效率,对目标蛋白不会造成变性,化学性能和机械性能稳定，重复性好,价格低廉,18,Protein purification,Preparation of the bacterial lysate,It is a critical step.Optimal conditions maximize cell lysis and the fraction of the recombinant protein that is extracted while minimizing protein oxidation,unwanted proteolysis and sample contamination with genomic DNA.,The lysis buffer should contain a strong buffer to overcome the contribution of the bacterial lysate,high ionic strength to enhance protein solubility,protease inhibitors and a reducing agent such as TECP to prevent oxidation of the protein.,19,About gel filtration,The choice of gel filtration as the next step after IMAC may be surprising,considering its lower resolving power compared with ion exchange or other adsorption chromatography methods,but this step is often sufficient after IMAC if the protein was abundant in the lysate.,Moreover,gel filtration is more generic,can be performed in any buffer condition,and can be used to resolve the oligomerization state of the target protein.,Superdex 75 and Superdex 200 prep grade,XK 16/60 columns are most useful for 1-30mg of protein in a sample volume of up to 7.5 ml.,20,21,分泌型战略表达重组蛋白的分离纯化策略,要分泌的多肽有一个疏水的氨基突出，它负责向内质网的转运,这个末端突出通常由大约,20,个氨基酸组成，并且在内质网中从成熟蛋白上剪切下来。,人们已经利用含有合适重组质粒的酵母细胞分泌了大量的非酵母多肽，而且绝大多数情况下都用到了,a-,因子信号序列。,22,外源基因的表达产物，通过运输或分泌的方式穿过细胞的外膜进入培养基中，即为,分泌型外源蛋白,。,外源蛋白以分泌型蛋白表达时，须在,N,端加入,15,30,个氨基酸组成的,信号肽（,signal peptides,）,序列。信号肽,N,端的最初几个氨基酸为极性氨基酸，中间和后部为疏水氨基酸，它们对蛋白质分泌到细胞膜外起决定性作用。当蛋白质分泌到位于大肠杆菌细胞内膜与外膜之间的外周质时，信号肽被信号肽酶所切割。,以分泌型蛋白的形式表达外源基因的优点：,分泌型可能使蛋白质按适当的方式折叠，有利于形成正确的空间构相，获得有较好生物学活性或免疫原性的蛋白质。甚至有些在细胞内表达时无活性的蛋白质分泌后则有活性。,23,分泌到细胞外周质的蛋白质产物较稳定，不易被细胞内蛋白酶所降解。,简化了发酵后处理的纯化工艺。,缺点：,外源蛋白分泌型表达通常产量不高，有时信号肽不被切割或在不适当的位置发生切割。,24,人肝再生增强因子在毕赤酵母中的表达、纯化和生物学活性的研究,1、重组载体的构建,特导引物设计，以,pBV220-ALR,质粒为模板扩增目的条带,构建酵母表达重组质粒，转化毕赤酵母,GS115,重组蛋白的表达及鉴定,rhALR,的纯化,25,rhALR,的纯化,菌液上清经低盐透析后，超过DEAE-Sepharose FF柱的饱和吸附量上样，洗脱组分脱盐后再上DEAE-Sepharose FF 柱，然后再用Sephades G-75 柱进一步纯化。,26,离子交换琼脂糖：,离子交换琼脂糖是携带,DEAE,或,CM,基团的,Sepharose CL-6B,DEAE-Sepharose,（,阴离子型）,和,CM-Sepharose,（,阳离子型）,的离子交换介质具有硬度大、性质稳定，流速好，分离能力强等优点尤其是介质受,pH,和离子强度的影响所引起的膨胀和收缩效应较小，因此具有稳定的外形体积。,27,离子交换介质的选择原则,对,pI,=5,的某酸性蛋白质,当蛋白质为阴离子时，,在,pH,5.5-9.0,的范围内，,应首选,DEAE,纤维素；,当蛋白质为阳离子时，,在,pH,3.5-4.5,的范围内，,应首选,CM,纤维素,1,2,3,4,6,7,8,9,10,5,pH,+,-,蛋,白,质,净,电,荷,等电点,吸附阴离子交换剂,吸附阳离子交换剂,pH pI（,-,）,28,What happens in ion exchange?,sample,application,and wash,elution,equilibration,regeneration,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,anion,exchanger,bead,29,+,equilibration,anion,exchanger,bead,30,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,+,+,+,+,+,+,-,-,-,-,sample,application,and wash,31,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,-,-,elution,32,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,+,+,+,+,+,+,regeneration,33,离子交换层析的基本操作,层析柱平衡,平衡缓冲液的用量至少为柱体积的 2 倍,平衡缓冲液的流速可略高于正常操作流速,平衡终点以流出液的离子浓度、导电性、,pH,值与缓冲液一致,为准，其中,pH,值最重要,34,离子交换层析的基本操作,样品进柱,为了达到满意的分离效果，进样量一般为介质交换容量的,10-20%,为了避免进样溶液中的离子强度过高，样品浓度不宜太高,交换容量：离子交换剂中全部可交换的离子或功能基团的总数,35,离子交换层析的基本操作,样品洗脱,恒定洗脱,阶段洗脱,梯度洗脱,10,20,30,40,50,60,70,80,90,分子浓度,离子强度,pH,值36,阴离子交换法,色谱条件：DEAE-Sepharose FF 阴离子交换填料；XK26/20色谱柱，体积89.32ml;8ml/min;0.2灵敏度,A液：5ommol/L Tris-Hcl(pH8.0),B液：50mmol/L Tris-Hcl+1 mol/NaCl(pH8.0),以A液为平衡液，B液为100%洗脱液，各洗脱浓度由Pharmacia FPLC系统自动将A液和B液混合产生。,37,阴离子交换层析：透析上清超过饱和吸附量上样后，目的蛋白主要集中在0.1mol/L NaCl洗脱峰，但还含有很多杂质；在1mol/L NaCl 洗脱峰中只存在少量目的蛋白,超饱和上样的0.1mol/L NaCl 洗脱峰脱盐后再上样，目的蛋白集中在0.2mol/L NaCl 洗脱峰，杂质含量已较少。,38,39,凝胶层析,凝胶层析的基本原理,凝胶介质的基本性质,凝胶介质的选用原则,凝胶层析的基本操作,40,凝胶层析的基本原理,凝胶层析是,利用有一定孔径范围的,多孔凝胶,作为固定相，对混合,物中各组份按分子大小进行分离的层析技术，又称为,分子筛,分子直径比凝胶最大孔隙直径大的，会被全部排阻在凝胶颗粒之,外，即,全排阻；,两种全排阻的分子即使大小不同，也不能分开；它们,下行速度快,分子直径比凝胶最小孔隙直径小的，能进入凝胶颗粒的全部孔隙,即使大小不同也不能分开；它们的下行速度慢,鉴于上述原理凝胶层析可用于重组蛋白溶液脱盐、分子量测定,以及,分离纯化,。,41,凝胶介质的基本性质,葡聚糖凝胶的种类有,G10,、,G15,、,G25,、,G50,、,G75,、,G100,、,G150,G200，G50,即表示每克,干凝胶的吸水量为,5.0,毫升,葡聚糖凝胶对碱比较稳定，在酸性环境中其糖苷键易水解,湿态的葡聚糖可加热到,110,，干的则能耐受,120,高温,葡聚糖凝胶（,Sephadex,）,Sephadex LH,是羟丙基化的,Sephadex，,这类层析介质的流动相既,可使用缓冲水溶液，也可使用极性有机溶剂，因此,适用于非水溶性溶,质的凝胶过滤,42,凝胶介质的选用原则,将样品中的大分子物质与小分子物质分开，称为组别分离，其分,离策略是,使高分子物质完全被排阻,，,小分子物质完全渗入凝胶内。,组别分离一般选用,Sephadex G-25,或,G-50,，,对于小肽和低分子量,的物质（分子量范围,1000-5000,）的脱盐可选用,Sephadex G-10,、,G-,组别分离,15,、,Bio-Gel P-2,或,P-,4,43,将样品中一些分子量比较接近的物质分开，这种分离叫分级分离,该策略是,使高分子物质完全被排阻,，,小分子物质完全渗入凝胶内。,分级分离一般选用,排阻限度略大于样品中最高分子量物质的凝胶,在层析过程中，样品中各组份均能不同程度地深入到凝胶内部，但由,分级分离,于深入凝胶空隙程度上的差异，最后得到分离。,44,凝胶层析的基本操作,平衡溶液的流速应低于层析时需要的流速,注意凝胶的断层和气泡,层析柱平衡,操作压控制,平衡和洗脱时应维持流速恒定,恒定的操作压是恒流的先决条件,45,上柱样品溶液的体积根据分离要求来确定：,进样体积,进行组别分离时，样品溶液最大可为柱体积的,10%,进行分级分离时，样品溶液的体积要小，使样品层尽可能,窄，这样洗脱出的峰形好,46,凝胶色谱层析,色谱条件：Sephadex G-75凝胶填料；XK16/80色谱柱，体积160.75ml;1ml/min;0.2灵敏度。,洗脱液：0.9%NaCl(pH5.5),47,洗脱第,1,峰主要为,rhALR,四聚体；洗脱第,2,峰为目的蛋白峰，,rhALR,二聚体，纯度大于,95%,，,rhALR,最后得率为,52%,。,48,包涵体型战略表达重组蛋白的分离纯化策略,包涵体,：在一定条件下，外源基因的表达产物在大肠杆菌中积累并致密地集中在一起形成无膜的裸露结构，这种结构称为包涵体。,包涵体存在部位,：细胞质、细胞周质,49,包涵体的组成,蛋白质,非蛋白质,外源基因的表达产物,：,占大部分，具有正确的氨基酸序列，但空间构相错误，因而包涵体蛋白一般,没有生物学活性,。,受体细胞本身的表达产物,：,如,RNA,聚合酶、核糖核蛋白、外膜蛋白以及表达载体编码的蛋白等。,：,包括,DNA,、,RNA,和脂多糖等,。,包涵体形成的本质,是细胞内蛋白质的不断聚集，主要包括三个方面：,折叠状态的蛋白质的聚集作用；,非折叠状态的蛋白质的聚集作用；,蛋白质折叠中间体的作用。,50,当重组蛋白以包涵体形式存在时，可获得高表达、高纯度的重组蛋白，避免蛋白酶对外源蛋白的降解，但不具有生物活性。,要对其进行分离纯化，就需要对包涵体进行变复性处理。然而不论以那种表达形式产生的重组蛋白。其纯化的方法都与传统的生物大分子分离方式相似。包涵体的分离纯化也是利用其物理和化学性质的差异。即以分子的大小、形状、溶解度、等电点、亲疏水性以及与其它分子的亲和性等性质建立起来的。,由于包涵体难溶，必须首先将其溶解后才能进行蛋白纯化，可以用变性剂,(,尿素或盐酸胍,),溶解包涵体，这样获得的重组蛋白产量虽高，却会破坏蛋白质的二级结构，需经蛋白复性才可能恢复它的生物活性。,包涵体的分离纯化,51,主要方法,金属亲和层析,凝胶过滤层析,离子交换层析,疏水层析,双水相萃取技术,反胶团相转移技术,52,Interaction between neighboring residues in the 6,His tag and Ni-NTA matrix,53,54,55,Purification mechanism,of recombinant,His-tagged,proteins,Advantages:,easy to identify and purify,56,人细胞周期蛋白,D1,在大肠杆菌,BL21,中的表达及纯化,1 原核表达载体的构建,pUC118-cycD,pET-28c(+),EcoR I,T4DNA,连接酶,pET-28c-cycD,DH5,鉴定克隆子阅读框架的正确性,57,58,2 融合基因在大肠杆菌中的诱导表达,pET-28c-cycD,提取质粒，转入,BL21,表达宿主,30,g/ml Kan,LB,37,过夜培养，之后按,1,：,100,转接,OD,600,=0.6 IPTG=0.1mmol/L,诱导表达，每隔,1,小时取样，确定最佳时间为,4,小时,59,pET-28c-cycD转化的菌株经IPTG诱导后在分子量约43 000处出现一条蛋白条带。,灰度扫描分析表明目的基因在IPTG诱导4h后表达量最大，约占菌体总蛋白的23。,分别对表达菌体的裂解上清和沉淀进行12 SDS-PAGE分析，发现目的蛋白主要分布在裂解沉淀中，说明表达的CyclinD1蛋白以包涵体形式存在。,60,3 包涵体的洗涤与变性,大量诱导表达后，离心收集菌体,0.1,倍培养物体积的溶液,A,悬浮,超声裂菌,4 000 g,于,4,离心,15 min,，回收的沉淀即为粗制包涵体,0.5,Triton X-100,和,2 mol,L,尿素的,磷酸缓冲液依次洗涤,悬于溶液,B,搅拌溶解1 h,12 500 g,，,30 min,离心，收集上清,61,溶液,A,：,20 mmol/L,磷酸钠，,500 mmol/L NaCl,，,10 mmol/L,咪唑，,0.1 mmol/L PMSF,，,1 mmol/L,巯基乙醇，,pH=7.4,磷酸缓冲液,:,20 mmol/L,磷酸钠,500 mmol/L NaCl,，,pH=7.4,溶液,B:8 mol/L,尿素，,20 mmol/L,磷酸钠,500 mmol/L NaCl,，,10 mmol/L,咪唑，,0.1 mmol/L PMSF,，,1 mmol/L,巯基乙醇，,pH=7.4,62,重组菌制备包涵体经洗涤后，用8 mol/L尿素变性，加到HisTrap HP Ni 螫合亲和层析柱上，利用咪唑置换，洗脱下特异结合的蛋白。,洗脱蛋白经12的SDSPAGE分析表明，纯化的表达产物在分子量43 0o0处显示出一条蛋白带，凝胶薄层扫描分析纯度达98 以上。,63,4 目的蛋白的亲和层析纯化和复性,变性上清,微孔滤膜过滤,预先用溶液,B,平衡过,HisTrap HP,柱,l0,倍柱体积的缓冲液,B,l0,倍柱体积的缓冲液,C,洗柱,5,倍柱体积缓冲液,D,特异性洗脱，分步收集，每管约,1 mL,64,缓冲液C：缓冲液B中含20 mmol/L咪唑,缓冲液D:缓冲液B中含500 mmol/L咪唑,65,收集液进行,12,的,SDS-PAGE,检测,合并含有目的蛋白的各管样品，适当稀释，装入透析袋复性,含,6 mol,L,尿素的磷酸缓冲液,4,透析过夜,分别用,4 mol/L,3 mol/L,2 mol/L,1 mol/L,0.5 mol/L,的梯度透析各,4 h,以上,PBS,缓冲液透析过夜,蛋白溶液在,44,下,12 500 g,离心,20 min,上清即为可溶性复性蛋白，冻干后备用,66,纯化的目的蛋白采取逐步降低尿素浓度的分段透析复性方法，除去蛋白溶液中的尿素，使变性的蛋白在此过程中自然复性，获得复性的重组CyclinD1蛋白的纯度达-98 以上,67,Western blot检测表达产物,BL21(DE3),菌裂解液,诱导,4 h,的转化菌裂解液,纯化的融合蛋白,SDS-PAGE,电转移至硝酸纤维素,(NC),膜上,封闭,抗,CyclinD1,单克隆抗体和辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠,IgG,进行孵育,二氨基联苯二胺,(DAB),显色,68,69,融合表达蛋白的分离纯化,与纯化包涵体相比，细胞质中以可溶性形式表达蛋白质的分离纯化过程比较复杂，一般要通过亲合层析才能达到比较高的纯度。,目标蛋白与有亲合配基的序列融合表达既可以提高分离纯化的效率，又能在融合蛋白切离的过程中得到没有附加甲硫氨酸目标蛋白。,金黄色葡萄球菌蛋白,G,、,A,和衍生物,Z,，日本血吸虫谷胱甘肽,-S-,转移酶，大肠杆菌麦芽糖结合蛋白，,His-tag,等是目前常用的与目标基因融合表达的序列。,70,71,72,表达融合蛋白的优点,(1)融合蛋白较稳定，不易被细菌蛋白酶水解。,(2)如果大肠杆菌的结构基因是一段信号肽，可产生分泌型产物。,(3)可利用针对原核部分的单抗进行亲和层析，便于纯化。,(4)原核蛋白部分可用蛋白酶切掉，释放出天然的真核蛋白质。,(5),目的蛋白溶解性好，由于受体蛋白的存在，融合蛋白往往能在,胞内形成良好的空间构象，且大多具有水溶性。,73,节杆菌乙内酰脲水解酶与,GST,蛋白融合表达及纯化,GST,结合位点,74,GST-,融合蛋白的表达和纯化流程,75,结核分枝杆菌,16kDa,与,GST,融合表达及纯化,1、16kDa基因的扩增与表达载体的构建,设计带有酶切位点的上下游引物,5-TCA,GAATTC,ATGAAGCTCACCACAATGA-3(EcoRI),5-TCA,CTCGAC,CTACGGCTCCCAAATCAGC-3(Sal I),扩增目的基因,双酶切产物及载体,pGEX-6P-1,连接,转化大肠杆菌,DH5a,及,JM109,感受态细胞,双酶切及测序验证,76,77,78,2、融合蛋白在大肠杆菌中的表达,挑取阳性克隆接种于,LA,培养基活化,37,，,200r/min,6h,分别取,50,L,转接于,5mL LA,37,OD,600,0.5-0.8,加入,IPTG 1mmol/L,每隔,1h,收集菌体,重悬菌体,SDS-PAGE,检测,取少量培养物，离心收集沉淀（作为空白对照）,37,，,230r/min,3h,79,80,3、融合蛋白的纯化,收集菌体,重悬于裂解液，超声裂菌，离心,取上清加入,4 mL,谷胱甘肽树脂颗粒,4,230r/min,结合,3h,离心去上清，加入,PBS,混匀，离心去上清洗涤,5,次,沉淀中加入,GST660 L,4,230r/min,10min,离心，上清即为纯化蛋白,裂解液,：,PBS,PMSF:5mg/mL,，,DTT:5mg/mL,Tween 20:10mg/mL,，溶菌酶,:10mg/mL,81,82,A strategy for high-level expression of soluble and functional human interferon a as a GST-fusion protein in E.coli,Construction of recombinant pGEX-hIFNa2b,expression vector,hINFa2b cDNA was cloned by an RTPCR approach using mRNA prepared from healthy individual leukocytes exposed in vitro to the Newcastle disease virus,The cDNA corresponding to the IFNa2b published sequence was amplified using a forward primer that introduced an EcoRI site at the 5 end of the gene(5-TGGAATTCTGTGATCTGCCTCAAACCCA-3)and a reverse primer containing the XhoI site at the 30 end of the gene(5-CGCTCGAGTCATTCCTTACTTCTTAAACTTTC-3),purified PCR product,digested with EcoRI and XhoI,restriction enzymes,inserted into the plasmid pGEX4T1,83,Screening of pGEX4T1/IFNa2b recombinant plasmids containing the cDNA sequence encoding hIFNa2b was performed by a restriction mapping analysis using Bgl II restriction,the nucleotide sequence of the selected clones was checked by automated DNA Sequencing Analysis using the ABI-PRISM377 DNA sequencer,84,Construction of recombinant pGEX-D-hIFNa2b expression vector,The pGEX-hIFNa2b expression vector was used as the DNA template for site-directed mutagenesis,F(TGT GAT CTG CCT CAA ACCCAC),R(GGA GCC ACG CGG AAC CAG),screening of pGEX-D-hIFNa2b mutant clonesby restriction analysis using EcoRI restriction enzyme,85,Analytical expression of recombinant GST-rhIFNa2b,The Origami B and BL21 E.coli cell lines were transformed with the wild-type pGEX-rhIFNa2b plasmid and the GSTIFN junction re-engineered pGEX-D-hIFNa2b plasmid,using the TSS method following standard protocols.,Starter cultures of 5 ml LuriaBertani(LB)medium containing 100 mg/ml ampicillin were inoculated,each with a single E.coli Origami B or BL21 recombinant clone,37,，,250r/min,overnight,One milliliter of the overnight culture was added to 100 ml LB medium supplemented with 100 mg/ml ampicillin 37,OD,600,0.5,86,Monitoring of growth conditions(temperature and IPTG concentration)using E.coli BL21 and Origami B strains,each host strain culture was induced with three IPTG concentrations(0.1,0.5 and 1 mM)at anOD600 of 0.5,25,and,37,OD,600,=2,To check the effects of the inducer(IPTG)concentration and culture growth temperature on the expression of soluble GST-hIFNa2b wild-type and GST-D-hIFNa2b mutantrecombinant proteins,87,Analysis of the recombinant GST-rhIFNa2b expressed in the E.coli BL21 strain grown 37,Both intracellular soluble(A)and insoluble(B)protein fractions were loaded on SDSPAGE gels,and proteins were stained with Coomassie Brilliant Blue R250.Lane M shows the molecular weight standards(RPN756 MW)indicated in kilo Daltons.Lanes 1 and 3 correspond to the protein samples collected from an un-induced culture of E.coli BL21 transformed with pGEX4T-1 and E.coli BL21 transformed with the pGEX4T1/IFNa2b recombinant plasmid,respectively.Those lines serve as a control of protein expression in non-induced condition.Lane 2 corresponds to the protein sample collected from a 1 mM IPTG-induced culture of E.coli BL21 transformed with,pGEX4T-1.This lane serves as a control of GST parental protein expression.Lanes 46 correspond to the proteins collected from cultures of E.coli BL21 transformed with the pGEX4T1/IFNa2b recombinant plasmid induced,respectively,with 1,0.5 and 0.1 mM IPTG.,soluble,inclusion bodies fractions,88,The presence of GST-hIFNa2b fusion protein in both the soluble and inclusion body fractions was confirmed by western blot analysis using the anti-GST antibody(Fig.3A).,However,the signal from the soluble fraction was much weaker as assessed by analysis of the western blot film using the ImageJ software.We observed an expression ratio of 67.39%insoluble(present in inclusion bodies)and over 32.61%soluble(present in the soluble fraction),GST-hIFNa2b fusion protein(Fig.3B).,89,Enhancement of the level of soluble GST-hIFNa2b,expressed in BL21 strain at reduced temperature,90,Extraction of GST-hIFNa2b recombinant protein,Induced and un-induced cell were harvested by centrifugation,4000g,30 min,4,Washed with buffer A,4000g,30 min,Protein extraction was performed by resuspending the cell pellet in one fifth of the original culture volume of buffer B,The cells were disturbed by six 30-s sonication steps,4,for 30 min at 13 500 rpm,91,cell pellets corresponding to insoluble protein fractions(such as inclusion bodies)were washed separately with the same volume of buffer B.,Buffer A:10 mM Na,2,HPO,4,1.8 mM,KH,2,PO,4,140 mM NaCl,2.7 mM KCl,pH 7.3,Buffer B:10 mM,Na,2