离子交换色谱优秀PPT.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第 四节 离子交换色谱,Lujiang Yuan,School of Pharmaceutical Science,Southwest University,1,离子交换色谱的发展,1903,年，,泡沸石（天然硅铝酸盐,Na,2,A1,2,Si,4,O,12,nH,2,O),来软化硬水。,Na,2,Z +Ca,2+,CaZ +2Na,+,1933,年，合成了酚醛类型的阴阳离子树脂。,1945,年，美国人，,D.Alelio,聚苯乙烯型强酸性阳离子树脂，聚丙稀酸型阳离子交换树脂的合成。,此外，纤维素和多糖上引入交换基形成的离子交换剂。,2,离子交换层析,离子交换层析的基本原理,离子交换介质的基本性质,离子交换层析的基本操作,离子交换介质的选择原则,3,离子交换层析的基本原理,离子交换层析是以离子交换剂为固定相，以含特定离子的溶液为,流动相，利用离子交换剂上的可交换离子与溶液中离子发生交换作用，由于不同的离子交换能力不一样，待分离的各种离子在树脂柱中随流动相的移动速度也不一样，而将混合物中不同离子进行分离的技术。,4,离子交换介质的基本性质,离子交换剂亦称离子交换介质，通常是一种不溶性高分子化合物如树脂，纤维素，葡聚糖，醇脂糖等；,含可交换离子,洗脱的可能性取决于交换反应平衡常数,吸附的蛋白质可以通过改变,pH,值，使蛋白 质分子电性发生改变，而洗脱下来。,不同蛋白质形成离子键数目有差异的，及亲和力不同。,5,离子交换树脂的结构和性质,离子交换树脂是具有网状结构的复杂的有机高分子聚合物。网状结构的骨架部分一段很稳定，不溶于酸、碱和一般溶剂。在网状结构的骨架上有许多可被交换的活性基团。根据活性基团的不同、离子交换树脂可分为阳离子交换树脂和阴离子交换树脂两大类。,合成：高分子化学加聚反应，先合成骨架，然后在骨架上添加功能基团。如合成过程中加入致孔剂，可得大孔离子交换树脂，否为凝胶型。,6,在高分子离子交换树脂中，常用的为交联的聚苯乙烯骨架上连接不同得功能团（可交换基团）：,离子交换剂的分类,阳离子交换剂：强酸型和弱酸型,可电离的基团 磺酸基（,-SO,3,H,）,磷酸基（,-PO,3,H,2,）,羧酸基（,-COOH,）,酚羟基（,-OH,）,阴离子交换剂：强碱型和弱碱型,可电离的基团 伯胺基（,-NH,2,）,仲胺基（,-NHCH,3,）,叔胺基（,-N(CH,3,),2,）,季胺基（,-N,+,(CH,3,),3,）,7,一、阳离子交换树脂,1,强酸型阳离子交换树脂,阳离子交换树脂具有酸性基团，如应用最广泛的强酸性磺酸型聚苯乙烯树脂，它是以苯乙烯和二乙烯苯聚合，经浓硫酸磺化而制得的聚合物。,化学性质稳定，,5,10,年，耐强酸、强碱、氧化剂和还原剂,不溶于酸、碱及常见的有机溶剂。耐热超过,100,C,。,8,2,弱酸型子交换树脂,甲基丙烯酸,和,二乙烯苯基,聚合，功能基,羧基,(-COOH),。,9,根据活性基团离解出,H,+,能力的大小不同，阳离子交换树脂分为强酸性和弱酸性两种。,例如含,-SO,3,的为强酸性阳离子交换树脂，常用,R-SO,3,H,表示,(R,表示树脂的骨架,),，含,-COOH,和,-OH,的弱酸性阳离子交换树脂，分别用,R-COOH,和,R-OH,表示。,强酸性阳离子交换树脂应用较广泛，弱酸性阳离子交换树脂的,H,+,不易电离，所以在酸性溶液中不能应用，但它的选择性较高而且易于洗脱。,10,二、阴离子交换树脂,与阳离子交换树脂具有同样的有机骨架，只是所联的活性基团为,碱性基团,。,季胺,(-N(CH,3,),3,)H,+,不易电离，强碱性阴离子交换树脂；,伯胺基,(-NH,2,),、,仲胺基,(-NHCH,3,),和,叔胺基,(-N(CH,3,),2,),的树脂为弱碱性阴离子交换树脂。,水化,:R-NH,3,OH,、,R-NH,2,CH,3,OH,、,R-NH(CH,3,),2,OH,和,R-N(CH,3,),3,OH,OH,-,可被阴离子交换和洗脱。,阴离子交换树脂的化学稳定性及耐热性能都不如阳离子交换树脂稳定。,11,交联度,树脂中所合交联剂的百分率称为重量交联度。,例如强酸性阳离子交换树脂,:,苯乙烯聚合而成为长的链状分子,二乙烯苯,把各链状分子联成立体型的网状体。如果二乙烯苯在原料总量中占,10%,。则称该树脂的交联度为,10,。,12,交联度,树脂的交联度越大，则网眼越小，交换时体积大的离子进入树脂便受到限制。但提高了交换的选择性：另外，交联度大时，形成的树脂结构紧密，机械强度高。但是如果交联度过大则对水的膨胀性能差,(,一般要求,1,克干树脂在水中能膨胀至,1.5-2cm,3,为宜,),，交换反应的速度慢，因此要求树脂的交联度一般为,4-14,。,13,交换容量,每克干树脂所含活性基团的物质的量，而实际交换容量是指在实验条件下，每克干树脂能交换离子的物质的量。,称取干树脂,1,克，置于,250mL,锥形瓶中、准确加入,0.1mol/LNaOH,标准溶液,100mL,振荡后放置过夜，用移浓管吸取上层清液,25mL,，加酚酞指示剂,1,滴，用,0.1mol/L,标准,HCl,溶液滴定至红色消失，设用去标准,HCl,溶液,14mL,，树脂的交换容量可以计算为,5.6 mmol/g,。,14,离子交换亲和力,离子交换反应和其他化学反应一样，完全服从质量作用定律。,树脂对离子亲合力的大小用平衡常数来代表，它与离子的水合离子半径大小和带电荷的多少有关。,15,强离子交换剂,的电离率基本不受,pH,值影响，离子交换作用的,pH,范围宽,弱离子交换剂,的电离率受,pH,影响很大，离子交换作用的,pH,范围小,弱酸性阳离子交换剂在,pH,值降低时，其电离率逐渐降低，离子交换能力逐渐减弱,弱碱性阴离子交换剂在,pH,值升高时，其电离率逐渐降低，离子交换能力逐渐减弱,16,常用的离子交换剂,离子交换树脂：,离子交换纤维素：,离子交换纤维素,是携带功能基团,纤维素衍生物，具有松散的亲水性网状结构以及较大的表面积，大分子可以自由通过，因而对生物大分子（如蛋白质）的交换容量比离子交换树脂大。,阳离子型,离子交换纤维素包括,羟甲基纤维素,（,CM,纤维素）等,阴离子型,离子交换纤维素包括,二乙基氨基乙基纤维素,（,DEAE,纤维素）,17,离子交换纤维素,离子交换纤维素,离子交换纤维素,18,常用的离子交换剂,离子交换葡聚糖：,离子交换葡聚糖,是葡聚糖,经环氧氯丙烷交联后形成的具有多孔三,维空间网状结构和离子交换功能基团的多糖衍生物（,Sephadex G,）,Sephadex,的优点如下：,亲水性强、不会引起生物分子的变性和失活，母链对蛋白质、核,酸,及其它生物分子的非特异性吸附能力小,电离基团在母体上取代程度高，交换容量大，装柱方便，流速快,既有离子交换作用，又有分子筛效应,因而,Sephadex,是一类广泛应用的色谱分离介质,在,pH,7,时可耐,120,的高热,2105,的蛋白质,适用于,19,常用的离子交换剂,常用的离子交换葡聚糖包括：,阳离子交换剂,CM-Sephadex C-25,，,CM-Sephadex C-50,Sephadex C-25,，,Sephadex C-50,阴离子交换剂,DEAE-Sephadex A-25,，,DEAE-Sephadex A-50,QAE-Sephadex A-25,，,QAE-Sephadex A-50,20,常用的离子交换剂,离子交换琼脂糖：,离子交换琼脂糖,是携带,DEAE,或,CM,基团的,Sepharose CL-6B,DEAE-Sepharose,（,阴离子型,）和,CM-Sepharose,（阳离子型）,的离子交换介质具有硬度大、性质稳定，流速好，分离能力强等优点。,尤其是介质受,pH,和离子强度的影响所引起的膨胀和收缩效应较小，因此具有稳定的外形体积,对,pH,及温度的变化均较稳定，可在,pH3,10,和,0,70,范围内使用，改变离子强度或,pH,时，床体积变化不大。,21,二、离子交换树脂的选择,一般原则：,酸性,物质用,阴离子,交换剂分离,碱性,物质用,阳离子,交换剂分离,反离子,:,强酸、碱性用,H,+,，,OH,-,弱用,Na,+,Cl,-,氨基酸、核苷酸、蛋白质等,两性电解质,，可根据其,pI,值,及,离子化曲线,来选择。,活性分子：亲水性基质的交换树脂,具体：种类，离子形式、交换量、颜色、交联度、理化性质等。,被分离物质所带的电荷性质,22,离子交换介质的选择原则,1,2,3,4,6,7,8,9,10,5,pH,+,-,蛋,白,质,净,电,荷,等电点,吸附阴离子交换剂,吸附阳离子交换剂,pH,pI,（,-,）,对,pI=5,的某酸性蛋白质,在,pH5.5-9.0,的范围内，,当蛋白质为阴离子时，,应首选,DEAE,纤维素,；,在,pH3.5-4.5,的范围内，,当蛋白质为阳离子时，,应首选,CM,纤维素,23,1,种类选定,中性盐体系：,阴阳离子的脱除用强,酸强碱树脂,微量杂质的脱除也要,强型树脂,强碱树脂分有,I,和,II,型：,I,型碱型强于,II,I,型：易与硅酸等弱酸作用，再生差；,II,型：不与比乙酸更弱的酸作用；,24,交换能力强的离子：,用弱碱性或弱酸性离子交换树脂；,如一般有机碱交换能力都强，多价金属离子、生物碱、链霉素等都用弱酸性离子交换树脂，,既容易吸附又容易洗脱,。,25,中性或碱性体系中：,多价金属离子与弱酸阳离子交换强，易洗脱，与强酸阳离子交换弱；,弱酸通常不用弱碱树脂，但用强碱树脂；,弱碱体系中：,阳离子交换用弱酸阳离子树脂；,弱酸体系中：,弱酸中的阴离子用弱碱阴离子树脂；,26,2,树脂形式的选择,中性盐溶液，交换后生成盐：,盐型弱酸弱碱树脂；,当量相当的 游离、酸碱混合；,酸、碱条件下的离子：,游离碱或酸树脂；,盐中除酸、碱：,弱型树脂（强型会交换盐）；,27,3,、颗粒、交联度和稳定性,A,颜色：浅色便于看色带，使用后色深、杂质多色变深。,B,颗粒：,20,80,目，,200,400,目。,C,交联度：聚苯乙烯树脂交联度,1,20,，常用,8,，交联度高，选择性好，交换速度小。孔度与交联度关系密切。,D,密度：,0.4-0.8g/ml,E,稳定性：一般而言，聚苯乙烯树脂稳定,阳比阴稳定,盐比酸碱稳定,28,离子交换剂的分类,强离子交换剂的电离率基本不受,pH,值影响，离子交换作用的,pH,范围宽,弱离子交换剂的电离率受,pH,影响很大，离子交换作用的,pH,范围小,弱酸性阳离子交换剂在,pH,值降低时，其电离率逐渐降低，离子交换能力逐渐减弱,弱碱性阴离子交换剂在,pH,值升高时，其电离率逐渐降低，离子交换能力逐渐减弱,29,三、,离子交换柱的操作,以强酸性阳离子交换树脂分离,K,+,和,Na,+,为例,交换,R-H,+,+K,+,=R-K,+,+H,+,R-H,+,+Na,+,=R-Na,+,+H,+,洗脱,R-K,+,+,H,+,=R-H,+,+K,+,R-Na,+,+H,+,=R-H,+,+Na,+,30,1,树脂的处理,A,过筛分：得均一颗粒，也可溶胀后筛分；,商品树脂,20,80,目，可将其干燥、粉碎、过筛或沉降、浮选处理。,31,B,净化处理：乙醇水,4mol/L HCl or NaOH-,蒸馏水到（,pH4-5 or 7-8);,强酸阳离子树脂,其商品多为,Na,型。用,4,倍体积,5,6,盐酸搅拌,5h,水洗到中性。然后,4,倍体积,5,6,Na or NaCl,交换，水洗到无,Na,+,。必要时可重复,1,2,次。,如需使用,H,，接上步骤用,6,倍体积,5,6,HCl,交换，水洗到中性。,酸碱处理的次序决定了离子交换剂携带反离子的类型。,32,强碱型阴离子交换树脂,商品型一般为,Cl,型。,4,倍体积,5,6,NaOH,蒸馏水洗到中性。,4,倍体积,5,6,HCl,蒸馏水洗到中性。,6,倍体积,5,6,NaOH,蒸馏水洗到中性。,OH,型树脂最好现制现用，它吸附空气中,CO,2,。,33,弱酸型阳离子交换树脂,商品树脂一般为,Na,型。,处理可参照强酸型阳离子交换树脂。,弱碱型阴离子交换树脂处理参照强碱型阴离子交换树脂法。,34,2,柱的操作,装柱：,树脂高度一般约为柱高的,90%,。为防止加试液时树脂被冲起，在柱的上端亦应铺一层玻璃纤维（或隔板）。装好后，再用蒸馏水洗涤（不少于,2,倍柱体积），备用。,上样：阳离子树脂可达,交换容量,的,50,，阴离子一般为,10-20%,。小于,5,床体积（,1,分析）。,洗脱：用蒸馏水洗去多余的（没吸附的）样品，然后用洗脱液（缓冲液，,pH,离子强度）淋洗，方法有等度，梯度等。,35,平衡,柱子装好后，要用所需的缓冲液（有一定的,pH,和离子强度）平衡柱子。用恒流泵在恒定压力下走柱子（平衡与洗脱时的压力尽可能保持相同）。,离子强度和,pH,的选择首先要保证各个待分离物质如蛋白质的稳定。使各个待分离物质与离子交换剂有适当的结合。,有时柱子平衡好后，还要进行转型处理。,补充,36,离子交换层析的基本操作,层析柱平衡,平衡缓冲液的用量至少为柱体积的,2,倍,平衡缓冲液的流速可略,高于,正常操作流速,平衡终点以流出液的离子浓度、导电性、,pH,值与缓冲液一致为准，其中,pH,值最重要,补充,37,交换,将试液加到交换柱上，用活塞控制一定的流速进行交换。经过一段时间之后，上层树脂全部被交换、下层未被交换，中间则部分被交换，这一段称为“交界层”。随着交换的进行，交界层逐渐下移，至流出液中开始出现交换离子时，称为始漏点,(,亦称,泄漏点或突破点,),，此时交换柱上被交换离子的物质的量数称为始漏量。在到达始漏点时，交界层的下端刚到达交换柱的底部，而交换层中尚有未被交换的树脂存在，所以始漏量总是小于总交换量。,补充,38,洗脱,当交换完毕之后，一般用蒸馏水洗去残存溶液，然后用适当的洗脱液进行洗脱。在洗脱过程中、上层被交换的离子先被洗脱下来，经过下层未被交换的树脂时，又可以再度被交换。因此最初洗脱液中被交换离子的浓度等于零，随着洗脱的进行，洗出液离子浓度逐渐增大，达到最大值之后又逐渐减小，至完全洗脱之后，被洗出之离子浓度又等于零。,对于阳离子交换树脂常采用,HCl,溶液作为洗脱液，经过洗脱之后树脂转为氢型；阴离子交换树脂常采用,NaCl,或,NaOH,溶液作为洗脱液，经过洗脱之后，树脂转为氯型或氢氧型。因此洗脱之后的树脂已得到再生，用蒸馏水洗涤干净即可再次使用。,补充,39,离子交换层析的基本操作,样品洗脱,恒定洗脱,阶段洗脱,梯度洗脱,10,20,30,40,50,60,70,80,90,离子强度,pH,值,40,C,C2,（,C2,C1,）（,1,V,）,A2/A1,A,1,C1,V,为流出体积对总体积之比,A2,C2,当,A1,A2,时为线性梯度，当,A1,A2,时为凹形梯度，,A1,A2,时为凸形梯度。,41,洗脱速度,洗脱速度通常要保持恒定,洗脱速度慢比快的分辨率要好，但峰过宽,洗脱峰过宽，则可适当提高洗脱速度,42,产品的浓缩、脱盐,离子交换层析得到的样品往往盐浓度较高，而且体积较大，样品浓度较低。所以一般离子交换层析得到的样品要进行浓缩、脱盐处理。,43,3,再生,树 脂,要求离子型式,再生剂,强 酸,H,+,Na,+,HCl,NaCl,弱 酸,H,+,Na,+,HCl,NaCl,强 碱,OH,-,NaOH,弱 碱,OH,-,Cl,-,NaOH,HCl,44,若有脂溶性物质则可用非离子型去污剂洗柱后再生，也可用乙醇洗涤，其顺序为：,0.5mol/L NaOH-,水,-,乙醇,-,水,-20,NaOH-,水。,保存离子交换剂时要加防腐剂。,阴离子交换剂,:0.002,氯已定（洗必泰），,阳离子交换剂,:,乙基硫柳汞（,0.005,）。,有些产品用,0.02,叠氮钠。,45,影响离子交换的主要因素,流动相的酸度：离子交换树脂就是固体酸碱，对于强型而言,pH,影响不大，弱型则显著。,强酸型阳离子，,pH,2,弱酸型阳离子，,pH,6,强碱型阴离子，,pH,12,弱碱型阴离子，,pH,7,46,样品浓度：浓度高树脂的解离减小；,影响吸附顺序及选择性；,改变树脂表面结构，影响离子,进入。,温度：对稀溶液的交换影响不大,;,溶液浓度高时，温度升高，易水合,的离子易吸附；,对弱碱、弱酸，温度升高，吸附速,加快，但温度太高会破坏树脂；,47,溶剂,：一般情况在水溶液中进行，可加入某些有极性机溶剂来改变选择性，但必须特别注意，这可能会使某些离子的交换无法进行。,48,四 离子色谱的应用,1,纯水的制备,氢型强酸性阳离子交换树脂，除去各种阳离子,2R-SO,3,H+,Ca,2+,(R-SO,3,),2,Ca+2H,+,氢氧型强碱性阴离子交换树脂，除去各种阴离子。,RN(CH,3,),3,OH+,C1,-,RN(CH,3,),3,Cl+OH,-,49,去离子水装置示意,50,水质检测,化学法：,pH,值,离子（,Cl,Fe,Ca Mg,硫酸根等）,可溶性硅，氧化物,不挥发物,物理法：测定电阻率,超纯水,18,兆以上,51,再生,阳、阴离子柱再生：,混合床再生：,先对混合床进行碱洗，然后用水逆流冲洗，使树脂运动，由于比重不同分层，分出阳、阴树脂分别处理。,52,2,分析化学应用,干扰离子的分离,测定黄铁矿中硫，,Fe,3+,、,Ca,2+,的存在，造成,BaSO,4,沉淀的不纯。,Li,+,、,Na,+,、,K,+,混合液，通过阳离子树脂交换柱，稀,HCl,洗脱。会按,Li,+,、,Na,+,、,K,+,顺序出来。,微量组分的富集,53,例如,铂、钯在矿石中的含量：一般为,10,-5,-10,-6,g/100g,，,即使称取,10,克,试样进行分析，也只含铂、钯,0.1,微克,左右。,富集的方法是：称取,100-200,克，在,700,灼烧,王水溶解，加浓,HCl,蒸发，铂、钯形成,PtCl,6,2-,和,PdCl,4,2-,络阴离子。稀释，过强碱性阴离子交换，即可将铂富集在交换柱上。稀,HCl,将树脂洗净之，取出树脂移入瓷钳锅中，在,700,灰化，用王水溶解残渣，加盐酸蒸发。然后在,8mol/LHCl,介质中，钯,(II),与双十二烷基二硫代乙二酰胺,(DDO),生成黄色络合物，用石油醚,-,三氯甲烷混合溶剂萃取，用比色法测定钯。铂,(IV),用二氯化锡还原为铂,(II),，与,DDO,生成樱红色螯合物可进行比色法测定。,54,3,用于水溶性带电荷植物成分分离,氨基酸、肽类（蛋白质）、生物碱、有机酸、酚类等。,一般步骤：,用煎煮法或温浸法得到植物有效成分水溶液，然后过强酸型阳离子交换树脂柱、强碱型阴离子交换柱，分别洗脱，可得到一些单一成分。,55,植物成分离子交换分离,56,4,蛋白质或酶的分离,聚苯乙烯离子交换树脂：吸附牢，易变性,离子交换纤维素,:,最好的方法,离子交换凝胶：同时有离子交换和分子筛的功能，广泛应用。,选弱酸、碱型为好，强型容易使蛋白变性,树脂形式不用,H,OH,型：,57,58,