人血清白蛋白的提取纯化和分子量测定专家讲座.pptx

单击此处编辑母版标题样式,编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,2017/11/8,#,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,2017/11/8,#,试验目标及意义,试验原理,试验步骤,预计试验结果展现形式,可能结果偏差及解释,试验重点与难点剖析,1,2,3,4,5,6,1,2,3,4,5,6,目录,Contents,人血清白蛋白的提取纯化和分子量测定专家讲座,第1页,试验目标及意义,The experimental purpose and meaning,01,掌握血清白蛋白分离纯化方法；,学会用盐析和离子交换柱层析法分离纯化蛋白质原理与操作；,掌握,SDS-PAGE,凝胶电泳测定蛋白质分子量原理和方法。,人血清白蛋白的提取纯化和分子量测定专家讲座,第2页,试验原理,The experimental principles,02,.,血清白蛋白初步分离,在半饱和硫酸铵溶液中，血清白蛋白不沉淀，球蛋白沉淀，离心后白蛋白主要在上清液中。因为血清白蛋白相对分子质量较硫酸铵大得多，故盐析初步分离白蛋白可用透析法或凝胶层析法除去硫酸铵。,奈氏试剂是络盐,K2HgI4,加,KOH,溶液，在无机化学定性分析中，用其检验氨或铵盐,人血清白蛋白的提取纯化和分子量测定专家讲座,第3页,血清白蛋白,血清白蛋白,约占血浆蛋白总量,60%,，水溶性很强，结构稳定，能结合各种小分子，如脂肪酸，胆红素，血红素等，起维持血液正常渗透压作用。另外白蛋白还有解毒、参加脂类代谢及血浆中微溶物质运输、维持血液酸碱平衡等作用，在医学临床及生物领域应用广泛。能够依据不一样蛋白质相对分子质量、溶解度以及在一定条件下带电情况不一样来分离及提纯各种蛋白质。,盐析,广泛使用分离蛋白质方法，所谓盐析就是用大量中性盐使蛋白质从溶液中析出过程。在高浓度中性盐影响下，蛋白质分子水化膜被剥夺及所带电荷被中和，因而破坏了蛋白质溶胶稳定原因，使蛋白质沉淀析出。但中性盐并不会使蛋白质变性，所以，若除去中性盐或减低盐浓度，蛋白质就能够重新溶解。,人血清白蛋白的提取纯化和分子量测定专家讲座,第4页,.,血清白蛋白纯化：,DEAE,纤维素阴离子交换剂,离子交换层析是一个用离子交换树脂作支持剂层析方法。,本试验采取是,DEAE,纤维素阴离子交换剂（中强碱型），可电离基团是二乙基氨基乙基，适合用于大分子分离。在离子交换层析中，蛋白质对离子交换剂结协力取决于彼此之间相反电荷基团静电吸引，而这又和溶液,pH,与盐离子浓度相关。所以，蛋白质混合物分离能够由改变溶液中盐离子浓度和,pH,来完成，对离子交换剂结协力最小蛋白质首先从层析柱中洗脱出来。除硫酸铵后白蛋白溶液在,0.02mol/L pH7.4,醋酸铵缓冲液条件下，加到二乙氨乙基（,DEAE,）一纤维素层析柱上，在此,pH,时，,DEAE,一纤维素带有正电荷，它能吸附带负电荷白蛋白、,及,球蛋白（血清白蛋白等电点为,4.5,，绝大多数，,及,球蛋白等电点均小于,6,）。伴随盐离子浓度提升，离子交换柱上,球蛋白、,球蛋白、白蛋白依次被洗脱下来。,人血清白蛋白的提取纯化和分子量测定专家讲座,第5页,.,血清白蛋白相对分子量测定：,SDS,PAGE,法,SDS,PAGE,是最惯用定性分析蛋白质电泳方法，尤其是用于蛋白质纯度检测和测定蛋白质分子量。电泳迁移率与颗粒电荷、形状、大小（分子量）相关，如电荷、形状都一样，则电泳迁移率只与分子量相关。,SDS,作用：,1.,能断裂分子内和分子间氢键，破坏蛋白质二级和三级结构，强还原剂（巯基乙醇）能使二硫键断裂，使蛋白质完全变性；,2.,能与变性蛋白质按百分比结合，形成,SDS-,蛋白质复合物。,SDS-,蛋白质复合物特点：,1.,因为结合大量,SDS,，使蛋白质丧失了原有电荷状态，从而降低或消除了各种蛋白质分子之间天然电荷差异；,2.,复合物都是椭圆棒状，从而降低或消除了各种蛋白质分子之间天然形状差异。,所以在进行电泳时，蛋白质分子迁移速度取决于分子量大小。,人血清白蛋白的提取纯化和分子量测定专家讲座,第6页,.,血清白蛋白相对分子量测定：,SDS,PAGE,法,在一定范围内，蛋白质迁移率和分子量对数呈线性关系，符合下式：,logMW=K-bx,（,MW,为分子量，,X,为迁移率，,k,、,b,均为常数）,若将已知分子量标准蛋白质迁移率对分子量对数作图，可取得一条标准曲线，未知蛋白质在相同条件下进行电泳，依据它电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。,该法测定蛋白质分子量不足,：,1.,蛋白质是由亚基（如血红蛋白）或两条以上肽链（如胰凝乳蛋白酶）组成，测定时只是它们亚基或单条肽链,MW,。,2.,电荷异常蛋白质（如组蛋白，带大量正电荷）。,3.,结构异常，不于分子量呈线性关系（如胶原蛋白）。,4.,带有较大辅基蛋白质（如糖蛋白）。,人血清白蛋白的提取纯化和分子量测定专家讲座,第7页,试验步骤,03,The experimental steps,血清白蛋白初步分离,血清白蛋白纯化,血清白蛋白相对分子量测定,人血清白蛋白的提取纯化和分子量测定专家讲座,第8页,血清白蛋白初步分离,1.,取样,取,2ml,血液，,4,，,3000rpm,离心,15min,，移取上清液（血清）,1ml,至,10ml,离心管。,2.,盐析,量取,9ml50%,饱和硫酸铵溶液，以移液管逐滴加入，同时不停振荡，,4,静置,2h,。,4,，,3000rpm,离心,15min,，搜集上清液。,用,5%,柠檬酸缓冲液调整,pH,至,4.5,（即白蛋白等电点），用量筒确定上清液体积，确定上清液体积，计算加入饱和硫酸铵（,pH,4.5,）体积（,0.11V,）。,逐滴加入饱和硫酸铵（,pH,4.5,），边加边振荡，,4,静置,2 h,。,4,，,3,000 rpm,离心,20 min,，弃上清，沉淀用,0.5 ml pH 7.4,柠檬酸,-Na2HPO4,缓冲液溶解。,人血清白蛋白的提取纯化和分子量测定专家讲座,第9页,血清白蛋白初步分离,3.,透析,将剩下,0.4 ml,蛋白质溶液将透析袋中，放入,pH 7.4,柠檬酸,-Na2HPO4,缓冲液中，搅拌透析过夜至蛋白质溶液中无,NH4,存在。,NH4,检测（奈氏试剂检测）：取,1 ml,透析液，加入,5,滴奈氏试剂，混匀，观察，假如出现砖红色沉淀，说明仍有,NH4,存在，需继续透析。,人血清白蛋白的提取纯化和分子量测定专家讲座,第10页,血清白蛋白纯化,离子交换层析,装柱：将层析柱固定，保持垂直位。将浸胀,DEAE-,纤维素装入柱内，至,8-10cm,高度，平衡过夜（装柱时应注意均匀，凝胶内不得有气泡，凝胶床要平整）。,准备,50-100,支试管，置于自动搜集器上；洗脱液经核酸蛋白检测仪监视，调整流速为,1mL/min,，蛋白质检测器调零。,上样：将透析袋剪开，用移液管转至凝胶面上，待样品进入凝胶后再加入少许缓冲液，使样品完全进入胶内。,洗脱：采取连续梯度洗脱。接上恒流泵，用,0.02,1.0mol,L,醋酸醋酸铵缓冲液（,pH7.4,）进行梯度洗脱，搜集；统计出现峰值管号；保留样品。,人血清白蛋白的提取纯化和分子量测定专家讲座,第11页,a.,分离胶制备,在一个洁净小烧杯中，按所列试剂用量配制。,SDS-,不连续系统,12,分离胶浓度，,5ml,体积配制量：,编号,溶液名称,12%,分离胶,1,30%Acr 0.8%Bis,2.0ml,2,pH 8.9 Tris-HCI,1.25ml,3,10%SDS,100ul,4,TEMED,2.5ul,5,10%AP,50ul,6,H2O,1.65ml,总体积,约,5 mL,血清白蛋白相对分子量测定,人血清白蛋白的提取纯化和分子量测定专家讲座,第12页,b.,浓缩胶制备,在另一个洁净小烧杯中。,4.5,分离胶浓度，,2.5 ml,体积配制用量表：,编号,溶液名称,4%,浓缩胶,1,30%Acr 0.8%Bis,0.33ml,2,pH 6.7 Tris-HCI,0.63ml,3,10%SDS,25ul,4,TEMED,2.5ul,5,10%AP,12.5ul,6,H2O,1.5ml,总体积,约,2.5 mL,血清白蛋白相对分子量测定,人血清白蛋白的提取纯化和分子量测定专家讲座,第13页,血清白蛋白相对分子量测定,c.,样品处理：,向标准蛋白质或待测样品中按百分比加入上样缓冲液（,Loading dye,），充分溶解后，加盖（不要密闭），置沸水浴,3 min,，取出冷至室温。,加样示意图：,样品,2,样品,2,标准蛋白样品,1,（,Marker,）,样品,2,样品,2,以微量注射器或移液枪加入,10-20ul,至样品槽内。,人血清白蛋白的提取纯化和分子量测定专家讲座,第14页,d.,电泳：点样端负极，恒压：开始,80V,，待样品进入分离胶后改为,100V,进行电泳，待蓝色染料迁移至下端约,1cm,时，停顿电泳，约需,1,2,小时。（电极缓冲液：,pH 8.3 Tris,Gly,）,e.,染色：剥胶后加入考马斯亮兰,R-250,，染色,20min,。,f.,脱色：染色完成，倾出染色液，加入脱色液。,20,30min,换一次脱色液，,2,3,次后可初步观察电泳条带，然后脱色过夜，直至背景清楚。,血清白蛋白相对分子量测定,人血清白蛋白的提取纯化和分子量测定专家讲座,第15页,g.,计算,通常以相对迁移率,(mr),来表示迁移率。相对迁移率计算方法以下：用直尺分别量出样品区带中心及染料与凝胶顶端距离，按下式计算：,相对迁移率,(mr)=,样品迁移距离,(cm),染料迁移距离,(cm),。,以标准蛋白质相对分子质量对数对相对迁移率作图，得到标准曲线。依据待测样品相对迁移率，从标准曲线上查出其相对分子质量,血清白蛋白相对分子量测定,人血清白蛋白的提取纯化和分子量测定专家讲座,第16页,预计试验结果,The expected experimental results,04,确定电泳取样试管编号,人血清白蛋白的提取纯化和分子量测定专家讲座,第17页,标准蛋白质相对分子质量（,kda,）,染料迁移距离（,cm,）,样品迁移距离（,cm,）,相对迁移率（,mr,）,标准蛋白质相对分子质量对数（,kda,）,能够依据标准蛋白相对分子质量对数及相对迁移率做出标准曲线，以相对迁移率为横轴，以标准蛋白相对分子质量对数为纵轴，预测应为一条直线。,人血清白蛋白的提取纯化和分子量测定专家讲座,第18页,标准蛋白相对分子质量对数及相对迁移率做出标准曲线,电泳预期效果,人血清白蛋白的提取纯化和分子量测定专家讲座,第19页,可能结果偏差及解释,Possible result bias and interpretation,0,5,测得人血清白蛋白分子量偏大,测得人血清白蛋白分子量偏小,人血清白蛋白的提取纯化和分子量测定专家讲座,第20页,蛋白质磷酸化,凝胶浓度不适当，蛋白质跑不动,表示蛋白质提前终止了或者降解,SDS,变性目标蛋白质不完全，使得蛋白质空间结构没有成为线型，组成了空间位阻,离子交换柱分离效果不好，杂质造成电泳条带过宽，影响结果分析,为何结果会偏大？,人血清白蛋白的提取纯化和分子量测定专家讲座,第21页,人血清白蛋白是由,3,个结构相同,-,螺旋结构域组成，它们在,SDS,等作用下，可能解离成亚基或单条肽链。所以，,SDS-,凝胶电泳测定不是完整分子分子量。,试验过程中对白蛋白造成了机械损伤，使单链多肽链断裂。需经过电泳是否产生拖带等现象判断。,为何结果会偏小？,人血清白蛋白的提取纯化和分子量测定专家讲座,第22页,试验重点与难点剖析,The key points and difficult points,0,6,对盐析、离子交换层析及,SDS-PAGE,法了解；,实际操作中对试验条件（,pH,、时间、加样量等）控制；,后期对数据处理与对试验结果分析,人血清白蛋白的提取纯化和分子量测定专家讲座,第23页,可能出现问题！,1,、层析过快，接取样品纯度不够高；,2,、上样量要适当，不要超出柱负荷能力。柱负荷能力可用交换容量来推算，通常上样量为交换剂交换总量,1%-5%,；,3,、洗脱液体积不足，造成分离各峰太过拥挤。,1,、制胶不理想：浓缩胶长度不够，可能造成条带过粗，分离胶浓度过大会有拖尾现象；,2,、两板之间有气泡：条带两边向下，中间鼓起；,3,、电极不平衡：条带偏斜；,4,、加样过多：条带两边扩散。,盐析过程中温度和,pH,控制不妥，可能使得所得目标产物白蛋白量较少，影响后续测定。,离子交换层析,SDS-PAGE,法,盐析,人血清白蛋白的提取纯化和分子量测定专家讲座,第24页,THANKS,！,人血清白蛋白的提取纯化和分子量测定专家讲座,第25页,