酶工程2微生物发酵产酶.ppt

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第二章 微生物发酵产酶,1,本章内容,酶的发酵生产的概念,优良菌种的筛选,发酵的基本类型,发酵工艺过程及条件控制,*酶的生物合成模式,2,在酶制剂发展的早期，酶多是从动植物原料中提取的。但是由于它们的生长周期长，酶在动植物组织中的含量低，又受地理、气候和季节等因素的影响，来源受到限制，不适于大规模的工业生产，因此除了部分用于医疗、疾病诊断及食品工业的酶外，目前基本都是以微生物作为生产酶的酶源，产酶微生物的发酵技术在酶生产中是极为重要的。,3,发展微生物作为酶生产的来源主要有以下原因：,微生物,生长繁殖快，生活周期短，产量高,。,微生物,培养方法简单,。,微生物,菌株种类繁多，酶的品种齐全,。,微生物,有较强的适应性和应变能力,。,4,经过预先设计，通过人工操作控制，利用细胞（包括微生物细胞、植物细胞和动物细胞）的生命活动，产生人们所需的酶的过程，称为酶的发酵生产。,5,首先必须选择合适的产酶菌株,然后采用适当的培养基和培养方式进行发酵，使微生物生长繁殖并合成大量所需的酶,最后将酶分离纯化，制成一定的酶制剂。,6,7,第一节,优良产酶菌种的筛选,酶的发酵生产的前提之一，是根据产酶的需要，选育到性能优良的产酶细胞。,优良的产酶菌种是提高酶产量的关键，筛选符合生产需要的菌种是发酵生产酶的首要环节，一个优良的产酶菌种应具备以下几点：,8,a,繁殖快,产酶量高，有利于缩短生产周期。,b,容易培养和管理，能在便宜的底物上良好生长。,c,产酶性能稳定，菌株不易退化，不易受噬菌体侵袭。,d,产生的酶容易分离纯化。,e,安全可靠、无毒性。不是致病菌及产生有毒物质或其他生理活性物质的微生物，才能确保酶生产和应用的安全。,9,产酶菌种的筛选方法与发酵工程中微生物的筛选方法一致,主要包括以下几个步骤,:,含菌样品的采集,菌种分离,产酶性能测定及复筛,等。,10,1,、含菌样品的采集：,要获得产生某酶的菌种可从富含该酶作用底物的场所去采集含菌样品。,2,、富集培养：一般的菌样含所要分离的微生物量很少时，富集培养有利于某种产酶菌种的筛选。,3,、菌种纯化：生产菌在自然条件下通常是与各种菌混在一起的，所以要进行分离、纯化，这样才能获得纯种。纯化时一般采用稀释法和划线法。,11,4,、产酶性能测定：将酶的底物和培养基混合倒入培养皿中制成平板，然后涂布含菌的样品，如果长出的菌落周围底物发生变化，即证明它产酶。如果是胞内酶，则可采用固体培养法或液体培养法来确定。固体培养法是把菌种接入固体培养基中，保温数天，用水或缓冲液将酶抽提，测定酶活力，这种方法主要适用于霉菌；液体培养法是将菌种接入液体培养基后，静置或在摇床上振荡培养一段时间（视菌种而异），再测定培养物中酶的活力，通过比较，筛选出产酶性能较高的菌种供复筛使用。,12,5,、高产菌株的选育,目前，优良菌种的获得一般有,三条途径,：一是从自然界分离筛选；二是用物理或化学方法处理、诱变；三是用基因重组或细胞融合技术。,13,5,、常用的产酶微生物,（,1,）细菌,大肠杆菌,：应用最广泛的产酶菌因为其遗传背景清楚而广泛应用于遗传工程改造微生物的宿主，被改造成表达优良性状的“,工程菌,”。大肠杆菌可生产多种酶，如，谷氨酸脱羧酶、天门冬氨酸酶、,-,半乳糖苷酶、限制性核酸内切酶、,DNA,聚合酶、,DNA,连接酶、核酸外切酶等。,枯草杆菌：,用途很广，可用于生产,-,淀粉酶、蛋白酶、,-,葡聚糖酶、碱性磷酸酶等。,（,2,）放线菌,链霉菌：生产葡萄糖异构酶的主要微生物,14,（,3,）霉菌,黑曲霉：生产糖化酶、,-,淀粉酶、果胶酶、酸性蛋白酶、过氧化氢酶、核糖核酸酶、脂肪酶等,米曲霉：生产糖化酶和蛋白酶，在我国传统的酒曲和酱油曲中得到广泛应用,红曲霉、青霉、木霉、根霉、毛霉,（,4,）酵母,啤酒酵母：主要用于酿造啤酒、酒精、饮料酒和面包制造。用于转化酶、丙酮酸脱羧酶、醇脱氢酶等的生产,假丝酵母：单细胞蛋白的主要生产菌,15,第二节 酶的生产方式,按发酵方法可分为：,一、固体发酵法（传统方法）,固体培养发酵的培养基，以麸皮、米糠等为主要原料，加入其他必要的营养成分，制成固体或半固体的麸曲，经灭菌、冷却后，加入产酶菌株，在一定条件下进行发酵。,主要用于真菌的酶生产，其中用米曲霉生产淀粉酶，以及用曲霉和毛霉生产蛋白酶在我国已有悠久历史。我国传统的各种酒曲、酱油曲等都采用这种方式进行生产，其主要目的是获得淀粉酶和蛋白酶。,优点：,设备简单，操作方便，麸曲中酶浓度较高，特别适用于各种霉菌的培养和发酵产酶。,缺点：,劳动强度较大，原料利用率较底，固体发酵条件控制不易均匀，生产周期较长。,16,二、液体深层通气发酵法（,最广泛应用）,采用液体培养基，置于发酵容器中，经灭菌、冷却后接入产酶细胞，在一定条件下进行发酵。,液体深层发酵是目前酶发酵生产的主要方式。,优点：,不仅适用于微生物细胞，也可用于各种植物细胞和动物细胞的悬浮培养和发酵。,机械化程度较高，技术管理较严，酶产率较高，质量较好，产品回收率较高。,易于为人为控制。,17,三、固定化细胞或固定化原生质体发酵,1,、固定化细胞发酵（,70,年代后期发展起来）,固定化细胞指固定在水不溶性载体上，在一定的空间范围内进行生命活动（生长、繁殖和新陈代谢）的细胞。,优点：,（,1,）固定化细胞的密度较高，反应器水平的生产强度较大，可提高生产能力；,（,2,）发酵稳定性好，可反复使用或连续使用较长的时间，易于连续化、自动化生产；,（,3,）细胞固定在载体上，流失较少，可在高稀释率的情况下连续发酵，大大提高设备利用率；,（,4,）发酵液中含菌体较少，利于产品分离纯化，提高产品质量等。,缺点：,历史不长，技术要求较高，需要特殊的固定化细胞反应器，只适用于胞外酶的生产等。,18,2,、固定化原生质体发酵（,80,年代中期发展起来）,原生质体是除去细胞壁后由细胞膜及胞内物质组成的微球体。,优点：,（,1,）变胞内产物为胞外产物。,（,2,）提高酶产率。,（,3,）稳定性较好。,（,4,）易于分离纯化。,缺点：,制备较复杂，发酵培养基中需要维持较高的渗透压，而且还要防止细胞壁的再生等。,19,第三节 发酵工艺条件及其控制,保藏细胞,细胞活化,原生质体细胞扩大培养固定化细胞,固定化原生质体 发酵 预培养,培养基 分离纯化 无菌空气,酶,20,一、细胞活化与扩大培养,保藏细胞在使用之前必须接种于新鲜的斜面培养基上，在一定的条件下进行培养，以恢复细胞的生命活动能力，这就叫,细胞活化,。,为了保证发酵时有足够数量的优质细胞，活化了的细胞一般要经过一级至数级的扩大培养。用于细胞扩大培养的培养基称为,种子培养基,。,21,二、培养基的配制,培养基是指人工配制的用于细胞培养和发酵的各种营养物质的混合物。,由于酶是蛋白质，酶的形成也是蛋白质的合成过程，因此微生物产酶的培养基要有利于蛋白质的合成。,22,1,、,碳源,构成菌体成分的重要元素，,产生各种代谢产物和细胞内贮藏物质的主要原料，,同时又是化能异养型微生物的能量来源。,在酶的发酵生产中，除了要从,营养的角度,考虑碳源的选择以外，还要考虑到碳源,对酶生物合成的调节作用,。,2,、氮源,不同的细胞对各种氮源的要求各不相同，应根据要求进行选择和配制。一般说来，动物细胞要求有机氮，植物细胞主要要求无机氮，微生物细胞中，异氧型微生物用有机氮，自氧型微生物用无机氮。,23,3,、无机盐类,构成菌体成分；,作为酶活性基的组成部分或维持酶的活性；,调节渗透压、,pH,值、氧化还,原电位等；,作为自养菌的能源。,当盐浓度太高时，对微生物生长有抑制作用，而在较低浓度,时却能刺激生长。,在微生物的发酵生产中，应特别注意有些金属离子是酶的组成成分，如钙离子是淀粉酶的成分之一，也是芽孢形成所必需的。,24,4,、生长因素,凡是微生物生长不可缺少的微量有机物质都称为生长因子,(,又称生长素,),，包括氨基酸、嘌呤、嘧啶、维生素等。,与微生物有关的维生素主要是,B,族维生素，这些维生素是各种酶的活性基的组成部分，没有它们，酶就不能活动。,25,三、,pH,值的调节控制,不同细胞生长繁殖的最适,pH,值有所不同。,一般情况下，多数细菌、放线菌生长的最适,pH,为中性至微碱性（,pH 6.58.0,）；而霉菌、酵母则偏好微酸性（,pH 4.06.0,）；植物细胞生长的最适,pH,为,56,。,培养基,pH,在发酵过程中能被菌体代谢所改变。若阴离子,(,如醋酸根、磷酸根,),被吸收或氮源被利用后产生,NH,3,，则,pH,上升；阳离子,(,如,NH,4,、,K,+,),被吸收或有机酸的积累，使,pH,下降。,26,培养基,pH,不仅影响微生物的生长和产酶，而且对酶的分泌也有作用。有些细胞可以同时产生多种酶，通过控制培养基的,pH,值，往往可以改变各种酶之间的产量比例。,所以在细胞培养和发酵过程中，必须对培养基的,pH,值进行适当的控制和调节。,pH,值的调节可以通过改变培养基的组分或其比例来实现。必要时可使用缓冲溶液，或流加适宜的酸、碱溶液，以调节控制培养基中,pH,值的变化。,27,四、温度的调节控制,细胞发酵产酶的最适温度与最适生长温度有所不同，而且往往低于最适生长温度，这是由于在较低的温度条件下，可提高酶的稳定性，延长细胞产酶时间。,有些酶的发酵生产，要在不同阶段控制不同的温度条件。在生长繁殖阶段控制在细胞生长最适温度范围内，以利于细胞生长繁殖，而在产酶阶段，则需控制在产酶的最适温度。,28,五、溶解氧的调节控制,微生物对氧的需要不同，是由于依赖获得能量的代谢方面的差异。好气性菌主要是有氧呼吸或氧化代谢，厌气菌为厌气发酵,(,分子间呼吸,),，兼性厌气菌则两者兼而有之。,在培养基中生长和发酵产酶的细胞，一般只能利用溶解在培养基中的氧气,溶解氧,。由于氧是难溶于水的气体，培养基中含有的溶解氧并不多，很快就会被细胞利用完。为此，必须在发酵过程中连续不断地供给无菌空气，使培养基中的溶解氧保持在一定水平，以满足细胞生长和产酶的需要。,29,六、提高酶产量的措施,1,、添加诱导物,对于诱导酶的发酵生产，在发酵培养基中添加诱导物能使酶的产量显著增加。一般可分为三类：,酶的作用底物,，例如乳糖诱导,-,半乳糖苷酶的生成，青霉素是青霉素酚化酶的诱导物。,酶的反应产物,，例如纤维素二糖可诱导纤维素酶的产生。,酶的底物类似物,，例如异丙基,-D-,硫代半乳糖苷（,IPTG,）对,-,半乳糖苷酶的诱导效果比乳糖高几百倍。其中使用最广泛的诱导物是不参与代谢的底物类似物。,30,2,、控制阻遏物浓度,微生物酶的生产受到代谢末端产物的阻遏和分解代谢物阻遏的调节。为避免分解代谢物的阻遏作用，可采用难于利用的碳源，或采用分次添加碳源的方法使培养基中的碳源保持在不致于引起分解代谢物阻遏的浓度。,31,3,、添加表面活性剂,在发酵生产中，,非离子型的表面活性剂,常被用作产酶促进剂，但它的作用机理尚未搞清；可能是由于它的作用改变了细胞的通透性，使更多的酶从细胞内透过细胞膜泄漏出来，从而打破了胞内酶合成的反馈平衡，提高了酶的产量。此外，有些表面活性剂对酶分子有一定的稳定作用，可以提高酶的活力，例如在霉菌的发酵生产中添加,1%,的吐温可使纤维素酶的产量提高几倍到几十倍。,32,4,、添加产酶促进剂,产酶促进剂是指那些能提高酶产量但作用机理尚未阐明的物质，它可能是酶的激活剂或稳定剂，也可能是产酶微生物的生长因子，或有害金属的螫合剂，例如添加植酸钙可使多种霉菌的蛋白酶和橘青霉的,5-,磷酸二酯酶的产量提高,220,倍。,33,第四节 酶生物合成模式,34,35,36,1,、同步合成型：,（,1,）酶的合成与细胞生长同步进行。当细胞进入对数生长期，酶大量产生，细胞生长进入平衡期后，酶的合成随着停止。,（,2,）同步合成型又称生长偶联型。其生物合成可以诱导，但不受分解代谢物阻遏和反应产物阻遏。,（,3,）,当除去诱导物或细胞进入平衡期后，酶的合成立即停止，这表明这类酶所对应的,mRNA,是很不稳定的。,37,2,、延续合成型：,（,1,）酶的合成伴随着细胞的生长开始，但在细胞生长进入平衡期后，酶还可以延续合成较长的一段时间。,（,2,）,属于延续合成型的酶可受诱导但不受分解代谢物阻遏和产物阻遏，而且该酶所对应的,mRNA,是相当稳定的，在生长平衡期以后相当长所一段时间内继续用于酶的合成。,38,3,、中期合成型：,（,1,）酶的合成在细胞生长一段时间以后才开始，而在细胞进入平衡期后，酶的合成也随着停止。,（,2,）,特点是：其合成受到反馈阻遏，而且其所对应的,mRNA,是不稳定的。,39,4,、滞后合成型：,（,1,）只有当细胞生长进入平衡期以后，酶才开始合成并大量积累。,（,2,）,属于滞后合成型的酶，在对数生长期不合成，可能是由于受到分解代谢物阻遏作用的影响，当阻遏解除以后，酶才开始大量合成。加上其所对应的,mRNA,稳定性高，所以能在细胞停止生长后，进继续利用积累的,mRNA,进行翻译而合成酶。,40,综上所述，,mRNA,的稳定性以及培养基这阻遏物的存在是影响酶生物合成模式的主要因素。,在酶的工业生产中，为了提高产酶率和缩短发酵周期，,最理想的合成模式应是延续合成型,。因为属于这一类型的酶，在发酵过程这没有生长期和产酶期的明显差别。,41,