免疫学及免疫学检验标记技术.pptx

Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,*,*,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,免疫学及免疫学检验,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,免疫学及免疫学检验,标识免疫技术,医学检验系临床微生物学及免疫学教研室,三月,免疫学及免疫学检验标记技术,第1页,标识,免疫技术,=,抗原抗体反应,示踪物标识,灵敏性,特异性,标识免疫技术主要特点：,高特异性,、,高灵敏性,免疫技术,+,标识技术,免疫学及免疫学检验标记技术,第2页,标识免疫技术,免疫测定技术,免疫组化技术,示踪物及,标识技术,放射免疫技术,荧光免疫技术,酶免疫技术,化学发光技术,金免疫技术,免疫学及免疫学检验标记技术,第3页,第八章 放射免疫技术,类型：,放射免疫分析（radioimmunoassay,RIA）,免疫放射分析（immunoradiometric,assay,IRMA）,广义放射免疫技术还包含放射受体分析（使用受体测量抗原）和放射配体结合分析（使用配体研究受体）。,特点:灵敏度高,(10,-9,-10,-15,g/L),、特异性强、,重复性好等,免疫学及免疫学检验标记技术,第4页,标识物:,惯用核素有两大类,射线：,131,I、,125,I、,57,Cr和,60,Co,射线：,14,C、,3,H和,32,P。,使用最广泛是：,125,I,性质活泼、易制备标识物,对被标识物免疫活性影响小,测量方法简便、已推广,半衰期较长、核素丰度高,免疫学及免疫学检验标记技术,第5页,标识方法,125,I标识,原理：取代分子中酪氨酸或酪胺残基及组胺残基上氢原子,方法：,直接标识法,氯胺T法和乳过氧化物酶法,间接标识法,联接标识法,免疫学及免疫学检验标记技术,第6页,适用分子,原理,特点,缺点,直接标识,肽类、蛋白质、酶,存在酪氨酸、组胺残基等基团,操作简便、易标识、比放射性高,不适于活性功效区残基标识,间接标识,甾类化合物、核苷酸等小分子化合物,不存在酪氨酸、组胺残基等基团,需添加,可防止氧化还原剂对被标识物活性损伤等,添加基团可能影响被标识物活性,免疫学及免疫学检验标记技术,第7页,标识物纯化,对游离,125,I等试剂与标识物进行分离,方法：分子筛凝胶过滤；离子交换层析；聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）；高效液相色谱（HPLC）,免疫学及免疫学检验标记技术,第8页,标识物判定,放射化学纯度,单位标识物中结合在被标识物上放射性占总放射性百分率。普通要求大于95。,免疫活性,标识过程中，被标识物活性损伤程度。B/T,80,，B/T,抗原损伤。,比放射性,单位化学量标识物中所含放射性强度.惯用Ci/g、mCi/mg、Ci/mmol等单位表示。,比放射性,方法更灵敏；过高 辐射自损伤大，对标识物免疫活性影响大，储存稳定性差。,免疫学及免疫学检验标记技术,第9页,抗血清判定,多克隆抗体抗血清是放射免疫分析主要试剂之一，其质量直接影响方法特异性和灵敏度。,亲协力,选取亲和常数K值大(10,9,10,12,L/mol)抗血清,特异性,其程度可直接影响结果准确性,滴度,最大稀释度。在本技术方法中是指结合50标识抗原时抗血清稀释度。,免疫学及免疫学检验标记技术,第10页,放射免疫分析,（RIA）,基本原理,采取定量标识抗原（Ag,）和非标识抗原（Ag）竞争性结合有限量特异性抗体（Ab）反应。,免疫学及免疫学检验标记技术,第11页,免疫学及免疫学检验标记技术,第12页,免疫学及免疫学检验标记技术,第13页,以未结合Ag*为F，Ag*Ab复合物为B，则B/F与Ag量变存在着函数关系。,B/F 60,(),50,40,30,20,10,0.8 1.6 2.4 3.2 4.0 4.8 5.6,Ag(ng/ml),免疫学及免疫学检验标记技术,第14页,测定方法与步骤,1.抗原抗体反应：平衡法或非平衡法,2.分离结合与游离标识物,沉淀剂沉淀复合物，离心分离。如第二抗体沉淀法、聚乙二醇沉淀法或活性炭吸附法等。要求：分离彻底，快速；分离试剂和过程不影响反应平衡；操作简便，重复性好且经济。,3.放射性测定及数据处理,晶体闪烁计数仪(,射线)或液体闪烁计数仪(,射线),绘制标准曲线，计算待检抗原浓度。,免疫学及免疫学检验标记技术,第15页,免疫放射分析（IRMA）,基本原理,单位点IRMA,：利用过量标识抗体与待测抗原进行反应，形成抗原抗体复合物，反应平衡后，用固相抗原结合反应液中剩下未结合标识抗体并将其分离，测定上清液放射量。,免疫学及免疫学检验标记技术,第16页,免疫学及免疫学检验标记技术,第17页,双位点IRMA,先用固相抗体与抗原反应结合,然后再用过量标识抗体与已结合于固相抗原另一抗原决定簇结合,形成固相抗体-抗原-标识抗体复合物,洗弃反应液中剩下标识抗体,测定固相上放射性。,免疫学及免疫学检验标记技术,第18页,免疫学及免疫学检验标记技术,第19页,IRMA与RIA异同点,标识物,在RIA中 核素标识抗原，抗原有不一样种类，依据其化学结构，标识时需用不一样核素和不一样方法。在IRMA中 核素标识抗体。抗体为蛋白质，有利于碘化标识，不一样抗体标识方法基本相同。标识抗体比活度高，提升了分析灵敏度。,反应速率,反应速度与反应物浓度呈正比，在IRMA中标识抗体是过量，而且不存在竞争性结合复杂反应，所以反应速度较RIA快。在RIA中抗体量是微量，所以一定要用高亲和力多克隆抗体，而在IRMA中应用亲和力较低单克隆体也能得到满意结果。,免疫学及免疫学检验标记技术,第20页,反应原理,RIA为竞争抑制，测得放射性量与受检抗原呈反比。IRMA为非竞争结合，剂量反应曲线为正相关直线关系。,特异性,在双位点IRMA中，普通均应用针对不一样位点单克隆抗体，其交叉反应率低于应用多克隆抗体RIA。,检测范围,通常RIA工作范围为2-3个数量级，而RIMA可达3个数量级以上。,免疫学及免疫学检验标记技术,第21页,分析误差,RIA中加入抗体和标识抗原都是定量，加样误差可严重影响测定结果。IRMA中标识和固相抗体在反应中都是过量，只有受检标本加样误差才会影响分析结果。所以，IRMA批内和批间变异均比较小。,其它,RIA能够测定大分子量与小分子量物质，双位点IRMA只能测定在分子上含有2个以上抗原表位物质。在RIA中应用为多克隆抗体，亲和力和特异性要求较高，但用量极少。IRMA中标识抗体和固相抗体用量较多，普通均用起源丰富、特异性较高单克隆抗体。,免疫学及免疫学检验标记技术,第22页,放射免疫技术应用,惯用于各种激素、微量蛋白、肿瘤标志物和药品等微量物质测定。,问题：放射性污染、惯用核素半衰期短、试剂盒稳定时不长不易自动化仪器分析等。,免疫学及免疫学检验标记技术,第23页,第九章 免疫荧光技术,免疫荧光技术,(immunofluorescence technique)是标识免疫技术中发展最早一个。,是将抗原抗体反应特异性与荧光物质检测敏感性和直观性结合起来一个方法。,免疫学及免疫学检验标记技术,第24页,基本原理,利用荧光素标识抗体，使之在涂片上或组织切片上与标本中待检抗原特异结合，采取高发光效率点光源，透过滤色板发出一定波长光，使结合在标本上荧光素被激发而产生荧光，借助荧光显微镜观察底物片上荧光染色形态，来判断有没有待检抗原或抗体。,免疫学及免疫学检验标记技术,第25页,第一节 荧光基本知识,免疫学及免疫学检验标记技术,第26页,异硫氰酸荧光素（FITC）,为黄色或橙黄色结晶粉末，分子量为389.4，最大吸收光波长为490-495nm，最大发射光波长520-530nm，展现明亮,黄绿色荧光,，是应用最广泛荧光素。,主要优点：人眼对黄绿色较为敏感；通常切片标本中绿色荧光少于红色，,降低背景干扰,。,免疫学及免疫学检验标记技术,第27页,免疫学及免疫学检验标记技术,第28页,四乙基罗丹明（RB200）,为橘红色粉末，不溶于水，易溶于酒精和丙酮。性质稳定，可长久保留。最大吸收光波长为570nm，最大发射光波长为595600nm，呈,橘红色荧光,。惯用于双重标识或对比染色。,免疫学及免疫学检验标记技术,第29页,四甲基异硫氰酸罗丹明（TRITC）,最大吸引光波长为550nm，最大发射光波长为620nm，呈,橙红色荧光,。其异硫氰基可与蛋白质结合，但荧光效率较低。,免疫学及免疫学检验标记技术,第30页,荧光分子辐射能力在受到激发光较长时间照射后会减弱甚至猝灭，一些化合物对荧光有猝灭作用，所以荧光物质保留应注意防止光（尤其是紫外光）直接照射和与其它化合物接触。,免疫学及免疫学检验标记技术,第31页,荧光抗体制备,作为标识荧光素应符合以下要求,：,应含有能与蛋白质分子形成共价健化学基团，与蛋白质结合后不易解离，而未结合色素及其降解产物易于去除。,荧光效率高,与蛋白质结合后，仍能保持较高荧光效率。,荧光色泽与背景组织色泽对比鲜明。,与蛋白质结合后不影响蛋白质原有生化与免疫性质，与蛋白质结合物稳定，易于保留。,标识方法简单、安全无毒。,免疫学及免疫学检验标记技术,第32页,荧光抗体是将荧光素（如,FITC,）与特异性抗体以化学方式共价结合而成。,标识方法：搅拌法(适合大样品),透析法(适合小样品),标识抗体纯化：透析法,层析分离法,免疫学及免疫学检验标记技术,第33页,荧光抗体判定,F/P,比率,：,将制备荧光抗体稀释至,A,280,1.0,，分别测读,A,280,（蛋白质特异吸收峰）和标识荧光素特异吸收峰,免疫学及免疫学检验标记技术,第34页,F/P,值越高，说明抗体分子上结合荧光素越多，反之则越少。普通用于固定标本荧光抗体以,F/P1.5,为宜，用于活细胞染色以,F/P2.4,为宜。,免疫学及免疫学检验标记技术,第35页,抗体效价,：效价越大标识抗体特异性越高非特异荧光越少。效价在1:16-1:32者较为理想,抗体特异性,：免疫电泳和交叉免疫电泳观察特异性沉淀线或沉淀峰，在紫外线照射下发出强烈荧光,免疫学及免疫学检验标记技术,第36页,第二节 免疫荧光显微技术,基本原理,：使荧光抗体与标本切片中组织或细胞表面抗原进行反应，洗涤除去游离荧光抗体后，于荧光显微镜下观察，在黑暗背景上可见明亮特异荧光,。,免疫学及免疫学检验标记技术,第37页,直接法,荧光抗体染色,免疫学及免疫学检验标记技术,第38页,直接法,优点：操作简便、特异性高、非特异 荧光染色原因少，,缺点：灵敏度偏低，每检验一个抗原需制备对应特异荧光抗体,免疫学及免疫学检验标记技术,第39页,间接,法,免疫学及免疫学检验标记技术,第40页,间接法,优点：灵敏度高，在不一样抗原检测中只需应用一个荧光抗体。既可检测抗原，也可检测抗体。,免疫学及免疫学检验标记技术,第41页,免疫荧光技术在医学检验中应用,在细菌学检验中主要用于菌种判定。,免疫荧光用于梅毒螺旋体抗体检测是梅毒特异性诊疗惯用方法之一。,用荧光抗体染色法可检出病毒及其繁殖情况。,在寄生虫感染诊疗中，间接免疫荧光试验（IFAT）是当前公认最有效检测疟疾抗体方法。,免疫学及免疫学检验标记技术,第42页,免疫荧光法还是检测本身抗体好工具，在本身免疫病试验诊疗中应用广泛。其突出优点是能以简单方法同时检测抗体和与抗体起特异反应组织成份，并能在同一组织中同时检验抗不一样组织成份抗体。,荧光抗体技术一个特殊应用是流式细胞分析（flowcytometry）。可用于检测细胞大小、折散率、粘滞度等，更惯用于T细胞亚群等检测。,免疫学及免疫学检验标记技术,第43页,第十章 酶免疫技术,免疫学及免疫学检验标记技术,第44页,第一节 酶免疫技术概述,基本原理,利用酶催化底物反应生物放大作用,提升特异性抗原-抗体免疫学反应检测敏感性一个标识免疫技术。,免疫学及免疫学检验标记技术,第45页,基本特点：,标识后保留酶和抗原(抗体)活性,酶促反应专一性，确保特异性,底物反应放大作用，提升敏感性,酶标试剂保留稳定,操作简便，安全易行,免疫学及免疫学检验标记技术,第46页,主要试剂制备与要求,免疫学及免疫学检验标记技术,第47页,一、酶与酶作用底物,（一）用于标识酶要求：,酶活性高,标识后酶活性稳定，且不影响标识抗原与抗体免疫反应性,酶催化底物后信号易判定或测定,酶活性不受样品中其它成份影响,酶、辅助因子及底物理化性质稳定，安全无害，价廉,免疫学及免疫学检验标记技术,第48页,（二）惯用酶及其底物,1.辣根过氧化物酶（HRP）,惯用底物：,邻苯二胺（OPD）：反应显橙黄色，应避光，致癌性,四甲基联苯胺（TMB）：反应后呈蓝色，无需避光，无致癌性，但水溶性差。,免疫学及免疫学检验标记技术,第49页,免疫学及免疫学检验标记技术,第50页,2.碱性磷酸酶（AP）,惯用底物为对硝基苯磷酸酯（p-NPP），产物为黄色。,*,AP灵敏性高与HRP，但不易取得纯品，稳定性及酶标识物收率,低于HRP，且价高，故应用不如HRP普及。,免疫学及免疫学检验标记技术,第51页,二、酶标识抗体或抗原,基本要求：,酶标识抗原纯度要高，抗原性完整；抗体特异性好，效价高，亲和力强，比活性高以及易于批量生产和分离纯化,免疫学及免疫学检验标记技术,第52页,酶标识方法,1.交联法,以双功效交联剂为“桥”，分别与酶和抗体（抗原）连接形成结合物。如戊二醛交联法。,2.,直接法,用过碘酸钠活化酶蛋白分子后，再与抗体（抗原）结合。仅适合用于含糖蛋白分子酶（如HRP）标识物制备。,免疫学及免疫学检验标记技术,第53页,三、固相载体,基本要求,结合容量高，结合稳定；可与抗原抗体复合物等大分子蛋白结合；生物大分子固化后仍保持活性；固化方法简便易行、快捷经济。,免疫学及免疫学检验标记技术,第54页,固相载体种类与选择,1.,塑料制品,材料经济，操作简便，易于自动化，最惯用。,2.,微颗粒,结合容量大，反应快速，逐步普遍用于自动化分析。,3.,膜载体,硝酸纤维素膜（NC）、尼龙膜等微孔滤膜，广泛应用于定性或半定量斑点ELISA。,免疫学及免疫学检验标记技术,第55页,四、免疫吸附剂,原理：非共价键吸附或共价键化学偶联（包被）。,普通采取偏碱性（pH9.6）碳酸盐溶液（ELISA板）。,封闭：15牛血清白蛋白或520小牛血清。,免疫学及免疫学检验标记技术,第56页,酶免疫技术分类,酶免疫组化,用于检测组织切片或细胞涂片中抗原和抗体,酶免疫技术 均相酶免疫测定,酶免疫测定 固相酶免疫测定,异相酶免疫测定,（ELISA）,液相酶免疫测定,免疫学及免疫学检验标记技术,第57页,均相酶免疫测定Ag+Ab,-E,Ag Ab,-E,+Ab,-E,基本原理：利用酶标抗体结合抗原形成复合物后，标识酶活性发生改变原理，在不将复合物与游离酶标抗体分离情况下，直接测定系统中总标识酶活性改变，进而推算出待检样品中抗原量。,免疫学及免疫学检验标记技术,第58页,异相酶免疫测定,（enzymeimmunoassay,EIA）,基本原理：在抗原抗体反应后，先将抗原抗体复合物与游离酶标抗体分离，再测定酶标识复合物催化底物显色活性，最终推算出样品中抗原含量。,液相EIA,：分离剂分离游离和结合标识物。,固相EIA,：固相载体结合酶标复合物，经洗涤去除游离酶标抗体。如ELISA。,Ag+Ab,-E,Ag Ab,-E,+Ab,-E,免疫学及免疫学检验标记技术,第59页,第二节 酶联免疫吸附试验,e,nzyme,l,inked,i,mmuno,s,orbent,a,ssay,(ELISA),免疫学及免疫学检验标记技术,第60页,基本原理：,使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性,在测定时，把受检标本（测定其中抗体或抗原）和酶标抗原或抗体按不一样步骤与固相载体表面抗原或抗体起反应,免疫学及免疫学检验标记技术,第61页,用洗涤方法使固相载体上形成抗原抗体复合物与其它物质分开，最终结合在固相载体上酶量与标本中受检物质量成一定百分比。,加入酶反应底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物量与标本中受检物质量直接相关，故可依据颜色反应深浅进行定性或定量分析,免疫学及免疫学检验标记技术,第62页,ELISA技术类型：,ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体，在这种测定方法中有3种必要试剂：,固相抗原或抗体，,酶标识抗原或抗体，,酶作用底物。,免疫学及免疫学检验标记技术,第63页,免疫学及免疫学检验标记技术,第64页,1双抗体夹心法,免疫学及免疫学检验标记技术,第65页,免疫学及免疫学检验标记技术,第66页,特点：,非竞争结合反应,惯用于抗原检测,适合用于分子中含有最少两个抗原决定簇多价抗原，而不能用于小分子半抗原检测,所用两种抗体分别针对同一个抗原分子不一样抗原决定簇,免疫学及免疫学检验标记技术,第67页,2间接法,免疫学及免疫学检验标记技术,第68页,免疫学及免疫学检验标记技术,第69页,3.竞争法,免疫学及免疫学检验标记技术,第70页,特点：,用于抗原和半抗原定量测定，也可反抗体进行测定。,酶标Ag（Ab）与样品或标准品中非标识Ag（Ab）含有相同与固相Ab(Ag)结合能力。,反应体系中，固相Ab（Ag）和酶标Ag（Ab）是固定限量，且前者结合位点少于酶标识与非标识Ag（Ab）分子数量和。,反应后，结合与固相载体上复合物中被测定酶标Ag（Ab）量（酶活性）与样品中非标识Ag（Ab）浓度成反比。,免疫学及免疫学检验标记技术,第71页,4.捕捉法（反向间接法）,主要用于 血清中某种抗体亚型成份（如IgM）测定。,基本原理：,固相抗IgM,待检标本(IgM),抗原(与特异抗体结合),酶标抗体,底物,免疫学及免疫学检验标记技术,第72页,第三节 膜载体酶免疫测定,固相膜免疫测定与ELISA相类似,其特点是以微孔膜作为固相.标识物可用酶和各种有色微粒子,如彩色乳胶、胶体金等。惯用固相膜为硝酸纤维素膜。,类型：免疫渗滤试验：穿流形式,免疫层析试验：横流形式,斑点酶免疫吸附试验（dot-ELISA）,免疫印迹法,(Western blot),免疫学及免疫学检验标记技术,第73页,免疫印迹法（immunoblottingtest，IBT）,亦被称为Western blot,分三个阶段进行:,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）,电转移,酶免疫定位,免疫学及免疫学检验标记技术,第74页,SDS-PAGE,抗原等蛋白样品经SDS处理后带阴电荷，在聚丙烯胺凝胶中从阴极向阳泳动，分子量越小，泳动速度就越快。此阶段分离效果肉眼不可见（只有在染色后才显出电泳区带）,免疫学及免疫学检验标记技术,第75页,免疫学及免疫学检验标记技术,第76页,电转移,将在凝胶中已经分离条带转移至硝酸纤维素膜上，选取低电压（100V）和大电流（1-2A），通电45min转移即可完成。此分阶段分离蛋白质条带肉眼仍不可见。,免疫学及免疫学检验标记技术,第77页,酶免疫定位,将印有蛋白质条带硝酸纤维素膜（相当于包被了抗原固相载体）依次与特异性抗体和酶标第二抗体作用后，加入能形成不溶性显色物酶反应底物，使区带染色。阳性反应条带清楚可辨，并可依据SDA-PAGE加入分子量标准，确定各组分分子量。,免疫学及免疫学检验标记技术,第78页,免疫学及免疫学检验标记技术,第79页,免疫学及免疫学检验标记技术,第80页,第四节 酶免疫测定应用,免疫学及免疫学检验标记技术,第81页,病原体及其抗体广泛应用于传染病诊疗。病毒如肝炎病毒、风疹病毒、疱疹病毒、轮状病毒等；细菌如链球菌、结核分枝杆菌、幽门螺杆菌和布氏杆菌等；寄生虫如弓形体、阿米巴、疟原虫等。,蛋白质如各种免疫球蛋白、补体组分、肿瘤标志物（比如AFP、CEA、PSA）、各种血浆蛋白质、同工酶、激素（如HCG、TSH）。,非肽类激素如T3、T4、雌激素、皮质醇等。,药品和毒品如地高辛、苯巴比妥、庆大霉素、吗啡等。,免疫学及免疫学检验标记技术,第82页,ABC-ELISA,(应用亲和素和生物素ELISA),免疫学及免疫学检验标记技术,第83页,生物素-亲合素系统(biotin-avidin system，BAS)，是70年代后期应用于免疫学，并得到快速发展一个新型生物反应放大系统。因为它含有生物素与亲合素之间高度亲和力及多级放大效应，并与荧光素、酶、同位素等免疫标识技术有机地结合，使各种示踪免疫分析特异性和灵敏度深入提升。,免疫学及免疫学检验标记技术,第84页,亲和素,是一个糖蛋白，能够和4个生物素分子亲密结合。现在使用更多是从链霉菌中提取链霉和素（strepavidin）。,生物素,（biotin）。卵黄、肝组织提取用化学方法制成衍生物，生物素羟基琥珀亚胺酯（biotin-hydroxysuccinimide，BNHS）。末端羧基可与蛋白质、糖类和酶等各种类型大小分子形成生物素化产物。,免疫学及免疫学检验标记技术,第85页,亲和素与生物素结合，虽不属免疫反应，但特异性强，亲和力大，二者一经结合就极为稳定。因为,1个亲和素分子有4个生物素分子,结合位置，能够连接更多生物素化分子，形成一个类似晶格复合体。所以把亲和素和生物素与ELIS偶联起来，就可大提升ELISA敏感度。,免疫学及免疫学检验标记技术,第86页,桥联法ABC-ELISA（avidinbiotincomplex-ELISA）夹心法测抗原过程,免疫学及免疫学检验标记技术,第87页,广泛应用于生物医学试验研究各个领域，既可用于微量抗原、抗体及受体定量、定性检测及定位观察研究，亦可制成亲和介质用于上述各类反应体系中反应物分离、纯化。,免疫学及免疫学检验标记技术,第88页,