生物化学实验CQMU市公开课金奖市赛课一等奖课件.pptx

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,生物化学试验 CQMU,纸层析法观测转氨基作用,P、63,生物化学与分子生物学试验室,.09,第1页,第1页,学习氨基酸纸层析基本原理,掌握氨基酸纸层析操作技术,实验目,第2页,第2页,层析技术,层析法又称色谱法，是一个依据物质物理或化学性质不同（如吸附力、溶解度等）而建立物质分离、分析方法，是近代生化最惯用技术之一。,试验原理,基本原理：在层析系统（固定相流动相）中，因为混合物各组份理化性质不同，与两相相互作用（吸附、溶解等）能力不同，伴随流动相不停向前移动，不同组分最终得以分开。,第3页,第3页,纸层析,属于分派层析，利用混合物在二种或二种以上不同溶剂中总分派系数不同而使物质分离方法。,以滤纸为支持介质，水被吸附在滤纸纤维上形成固定相，有机溶剂如酚等为流动相。,把预分离物质加在纸一端，使流动溶剂经此向另一端移动，伴随流动相移动，待分离物质进行连续、动态不停分派。在固定相分派趋势大组份，随流动相移动速度慢；反之，在流动相分派趋势较大成份，移动速度快，最终不同组份彼此分离。,第4页,第4页,ALT催化转氨基反应,纸层析观测转氨基作用技术基础：,丙氨酸,和,谷氨酸,能够通过纸层析得以分离,第5页,第5页,试验环节,肝匀浆制备：,转氨基反应：取试管二支，分别标明,测定管,与,对照管,，各加入肝匀浆10滴，测定管加入37水浴保温10分钟，,对照管放入沸水浴中煮10分钟,，待对照管冷却后，于两试管中分别加入0.1 mol/L 丙氨酸10滴，0.1 mol/L-酮戊二酸10滴，pH 7.4 0.01 mol/l 磷酸缓冲液1.5 ml，摇匀，放进37水浴保温30分钟，保温完毕，马上将测定管放入沸水浴中煮沸10分钟以终止反应，取出冷却后，过滤。取滤液备用。,第6页,第6页,层析：准备滤纸点样层析终止。,测定管上清液,0.1 mol/L丙氨酸,对照管上清液,0.1 mol/L谷氨酸,第7页,第7页,显色,：将上述滤纸平放在培养皿上，用喷雾器喷上0.5%茚三酮之丙酮溶液，使滤纸所有湿润再用吹风机或60烘箱干燥之，此时可见紫色斑出现。,分析：,比较色斑位置及色泽深浅，计算Rf值，分析是否发生了转氨基反应。,第8页,第8页,注意事项,层析液中含有腐蚀性酚，取用时注意安全，预防溅到皮肤及眼睛；,操作中接触滤纸前要洗手擦净，并尽也许避免手与滤纸中间部位接触；,点样点不宜过大，直径小于0.5 cm。,第9页,第9页,Lets begin！,开始试验！,第10页,第10页,