NY∕T 3179-2018 甘蔗脱毒种苗检测技术规范(农业).pdf

ICS 65.020 B 16 NY 中华人民共和国农业行业标准NY/T 3179-2018 甘震脱毒种苗检测技术规范Technical specification for the certification of sugarcane pathogen-free planting stock 2018-03- 15发布2018-06-01实施中华人民共和国农业部发布前言本标准按照GB/T1. 1-2009给出的规则起草。本标准由中华人民共和国农业部提出。NY/ T 3179-2018 本标准由全国农作物种子标准化技术委员会归口。本标准起草单位:福建农林大学农业部福建甘庶生物学与遗传育种重点实验室/国家甘N.工程技术研究中心、全国农业技术推广中心、中国热带农业科学院热带生物技术研究所。本标准主要起草人许莉萍、阙友雄、方晓东、周泽字、张树珍、苏亚春、陈常兵、高世武、杨本鹏、郭晋隆、吴期滨、王恒波。I NY/ T 3179-2018 甘脱毒种苗检测技术规范范围本标准规定了甘煎脱毒种苗等的术语和定义、检测对象、抽样、检测方法和检测结果判定。本标准适用于甘i.ii;宿根矮化病菌、甘i.ii;花日十病毒、高粱花叶病毒、甘煎条纹花叶病毒和甘i.ii;黄叶病毒的检测以及甘煎脱毒种茵的抽样和检定。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本文件。NY/ T 2679 甘煎病原商检测规程宿根矮化病菌环介导等温扩增检测法3 术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3. 1 脱毒种苗pathogen-free planting stock 经腋芽、茎尖或其他等甘煎材料培养、繁殖或煎茎温水处理而获得的符合相关质量要求的煎苗(包括瓶苗、袋苗、袋裁苗、杯苗、穴盘苗、无琼脂苗或裸根苗等)或种茎(包括原种、基础种和生产用种以及经温水处理等途径获得的各类种苗)。3.2 原种primary seed 在甘煎种苗脱毒体系中，经对检测对象进行检测合格的组培苗;或由该组培茵种植田间并经6个月-9个月生长采收后的种茎，要求30条主茎平均有效节不超过16节。3.3 基础种secondary seed 以原种为种菌，种植田间并经6个月-9个月生长采收后的种茎.要求30条主茎平均有效节不超过16节。3. 4 生产用种commercial seed 以基础种为种苗，种植田间并经6个月-9个月生长采收后的种茎.要求30条主茎平均有效节不超过16节。4 检测对象4. 1 甘i.ii;宿根矮化病菌(Leifsonixylisubsp. xyli. Lxx)。4. 2 甘煎花叶病毒(Sugarcanemosaic virus ，SCMV)。4. 3 高粱花H十病毒(Sorghummosic virus . SrMV)。4. 4 廿煎条纹花叶病毒(Sugarcaneslreak mosaic virus ，SCSMV)。4. 5 廿i.ii;黄叶病毒(Sugarcaneyellow lefv川ls，SCYLV)。NY/T 3179-2018 5 抽样5. 1 抽样方法按照五点取样法进行，示意图见图1。各点取样数量一致，单行连续取样，不同甘m;品种或不同类型(女口原种各种形式的小苗、田间繁殖的原种种茎等)的种苗均需独立抽样。图1五点取样法5. 2 抽样数量危害性病害甘m;黑穗病的发生率根据表型调查来确定，无论面积大小，每点调查100株.5个取样点共调查500株。各类煎苗(如瓶苗、袋装苗、袋栽苗、杯苗、穴盘苗、无琼脂苗或裸根苗等)以瓶、袋、株为单位，其中瓶茵以瓶为单位，袋装茵以袋为单位，袋栽苗、杯苗、穴盘苗、无琼脂苗或裸根苗以株为单位;田间种植的种茵以公顷(hm2)为单位，各类种苗目标病原检测的抽样数量见表1。表1不罔类型种茵的抽样数量种苗类型种苗数量4二1000瓶/株i.1I:商1001瓶/株-5000瓶/株5001瓶/株-20000瓶/株20000瓶/株4二1hm 田间种植茵1. 1 hm -2.0 hm 2. 1 hm -4. 0 hm 4.0 hm 6 检测方法6. 1 环介导等iE扩增(LAMP)用于检测甘煎样品中甘煎宿根矮化病菌，见附录Ao6. 2 聚合酶链式反应(PCR)用于检测甘f.-宿根矮化病菌，见附录B。6. 3 逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)抽样数盘，瓶/株15 25 50 75 15 25 50 75 用于检测甘煎花叶病毒、高粱花叶病毒、甘煎条纹花叶病毒和甘f.-黄叶病毒，见附录C。7 检测结果判定7. 1 实验有效判定所有检测只有在阳性对照、阴性对照和空白对照的检测结果均正常时，才能对待检样品的检测结果进行判定。7. 2 祥品检测结果判定甘m;宿根矮化病菌的检测结果根据附录A或附录B判定，如采用2种检测方法且检测结果不一致2 NY/ T 3179-2018 时，则以阳性结果为准;甘N.花叶病毒、高粱花叶病毒、甘煎条纹花叶病毒和甘煎黄叶病毒的检测结果根据附录C判定。在阳性对照、阴性对照和空白对照检查结果均正常的情况下，试样的检测结果呈阳性，即判定该样品携带相应的病原;如试样的检测结果呈阴性，则判定该样品不携带相应的病原。7. 3 重复检验如果2个平行样检测结果不一致时，应再次进行检测，直到检测结果一致方可进行判定。3 Y/ T 3179一2018附录A(规范性附录)甘族宿根矮化病菌环介导等温扩增(LAMP)检测方法A. 1 试剂除另有规定外，所用试剂均为分析纯。A. 1. 1 1. 0 mol!L Tris-HC1(pH 8.0)母液的配制:称取121.1 g Tris，溶解于800mL的ddH20中，用6 mol!L HCl调节pH至8.0后，用ddH20定容到1.0 L A. 1. 2 O . 5 mol! L EDT A (pH 8. 0)母液的配制:称取186.1 g Na2 EDTA 2H20，加入800mL ddH20，充分搅拌，用2mol!L NaOH调节pH至8.。后，用ddH20定容到1.0L。A. 1.3 2XCTAB抽提缓冲液:含100mmol! L Tris-HCl (pH 8.0)、20mmol! L EDT A、1.4 mol! L aCl和2.0%CTAB，在121C、0.1MPa下湿热灭菌20min30 min，使用前加入O.l%(V/V)的-硫基乙醇。A. 1.4 氯仿/异戊醇(V/V)=24/1。A. 1.5 检测引物序列:F3:5-ACATCGGTACGACTGGGT-3; B3:5-TGGCCGACCAAAAAAGGT- 3 ; FIP(F1c+ F2) :5-GGCGTACTAAGTTCGAGCCGTT- GGTCAGCTCATGGGTGGA - 3 ; BIP(Blc+ B2) :5-CCTCGCACATGCACGCTGTT- CTCAGCGTCTTGAAGACACA -3; LF: 5- CTCCGCACCAATGTCAATGT- 3 ; LB:5-CTGAGGGACCGGACCTCATC-3。A. 1. 6 其他试剂:dNTP Mixture(各10mmol!L)、含有10XReactionBuffer(反应缓冲液)的BstDNA 聚合酶、乙二胶四乙酸二锅(Na2EDTA.2H2Q)、6mol!L盐酸(HCl)、2mol! L氢氧化纳(NaOH)、嵌入型染料SYBRGreen 1 (l 000 X )、乙醇、异丙醇、自-疏基乙醇、75%乙醇、液氮、过氧化氢(H202) 。A.2 仪器设备和耗材A. 2. 1 高速台式冷冻离心机:相对离心力12000Xg以上，温度4C8C。A. 2. 2 常温离心机:相对离心力3000Xg以上。A. 2. 3 小型离心机:可用于PCR反应管瞬间低速离心用的小型离心机。A. 2. 4 微量加样器:0.1L2.5L、lLlOL、2L20L、10L100L、20L200L、100Ll 000L. A. 2. 5 恒温水浴锅:要求具有显示温度的功能。A. 2. 6 其他设备:冰箱(2C4C和一200、高压灭菌锅、鼓风干燥箱、液氮罐、核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计、电子天平(感盘0.001g)。A. 2. 7 取样工具:砍刀、剪刀、银子、带槽钻子、钳子。A. 2. 8 耗材:离心管、PCR反应管、Tip头、滴管、100mL和1000mL容盐瓶、100mL和1000mL细口瓶、盐筒。NY/ T 3179-2018 A.3 样品的采集与前处理A. 3. 1 取样每次取样前以及每取一个新的样品前，取样工具均需要用清水冲洗并用75%乙醇进行擦拭消毒。取样过程中应避免样品交叉污染。取样和样品前处理过程中均应戴一次性手套，样品采集后，置于一次性保鲜袋中，编号备用。A. 3. 1. 1 煎茎:采集I节2节中部茎。茎去皮后，采用钳子直接挤压出汁，汁收集在5mL10 mL无菌离心管中;或用带槽钻子直接在田间甘煎茎中部取汁。A.3. 1. 2 组培苗:小苗样品采集全株，株高超过25cm的也可采集叶片，2叶为I份。A.3. 1. 3 叶片:采集甘煎植株中部带有中脉的叶片，1片为1份。A. 3. 2 对照材料A. 3. 2. 1 阳性对照:用己知含甘宿根矮化病原菌的样品做阳性对照。A. 3. 2. 2 阴性对照:用已知不含甘煎宿根矮化病原菌的样品做阴性对照。A. 3. 2. 3 空白对照:用等体积的无菌ddHzO替代样品做空白对照。A. 3. 3 样品的存放与运送样品采集后，应放置在4.C左右的冰箱中，建议在1d4d内进行后续操作。若需长途运送，应采用保温箱中加干冰密封后运送。A. 4 总DNA提取A. 4. 1 取数支2.0mL元菌离心管，并进行编号。A. 4. 2 称取0.2g甘组培苗和叶片样品，加入液氮研磨成粉未状(研磨过程要保持液氮不挥发干净)，用小药勺将组织粉末转移到2.0mL无菌离心管中，待液氮挥发完，备用;取2.0mL 煎汁样品于2mL无菌离心管中，室温下3000Xg离心5min，将上清液转移至新的无菌离心管中，室温下12000Xg离心10min，弃上清液，留下沉淀，备用。A. 4. 3 r古装有样品的离心管中加入800L预热(约65.C)的2XCTAB抽提缓冲液，充分摇匀。65.C保温40min，保温期间，每隔5min颠倒3次4次混匀。A. 4. 4 在4.C下12000Xg离心10min，弃沉淀，取上清液移至新的无菌离心管中，加入等体积氯仿/异戊醇(V/ V =24/ 1)，剧烈振荡30S . A. 4. 5 吸取上层清液至另一新的元菌离心管中，加入2/ 3体积的预冷的异丙醇或2倍体积的元水乙醇，轻轻颠倒混匀，于一20.C下放置30min或4.C8.C下静置过夜，待DNA析出。A. 4. 6 在4.C下12000Xg离心15min，获得DNA沉淀。用500L75%乙醇将DNA洗涤2次。4.C下4500Xg离心5min，弃去上清液，晾干或用灭菌过的泼、纸吸干后，加灭菌双蒸水50L溶解(大约0.5 h)，得到样品DNA溶液。A. 4. 7 取样品DNA溶液5.0L，加元菌水稀释至1.0 mL，用核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计，测定波长260nm和280nm处的吸光值A260和AZ80, AZ60 / A280 比值在1.72. 1之间才能用于后续试验。如该比值不在此区间，说明质量不符合要求，应重新制备样品DNA溶液。DNA浓度按式(1)计算。c = A X N X 50/1000(l) 式中:c一-DNA浓度，单位为微克每微升(g/U;A一-260nm处的吸光值;5 NY/T 3179-2018 DNA稀释倍数，本操作稀释倍数为200。将样品DNA溶液的浓度调整到20ng/L左右，置一20C保存备用。A.5 环介导等温扩增A. 5. 1 在冰上融化各反应组分，瞬间低速离心(约2000Xg下离心3s5s)，根据测试样品数量，计算好各试剂的使用量，每份样品应设置2个平行反应。A. 5. 2 除样品外，按表A.l配制反应混合液，全部加完并充分混合均匀后，盖上离心管的盖子，瞬间低速离心(约2000Xg下离心3s5 s)。再打开离心管的盖子，用微孟加样器向每个PCR反应管中各分装24.0L。A. 5. 3 内表面，加1.0L A. 5. 5 将上述加样后的A. 5. 6 瞬间低速离心(约2000A. 5. 7 每次检测实验均应设阳性对照、A.6 结果判定A. 6. 1 实验有效判别中各组分的终浓度.反应体系又才，加1.0L Xg下离心3S 按NY/T2679的要求进行。当阳性对照、阴性对照和空白对照均符合下述显色反应(见图A.l)时，视为有效实验;杏则，视为无效实验。6 IY!T 3179-2018 空向对照2 说明阴性对照3 4 阳性对照5 6 阳性样品7 8 1.2一一空向对照.PCR反应管中反应液呈褐色5.8一一阳性对照，PCR反应管中反应液呈绿色.3.4 阴性对照，PCR反应管中反应液呈褐色:图A.l显色反应有效实验识别图A. 6. 2 检测结果判定观察PCR反应管的颜色反应结果:如试样反应呈绿色，判定为阳性，说明该试样携带甘l宿根矮化病菌;如试样反应呈褐色，判定为阴性，说明该试样不携带甘l宿根矮化病菌。A. 6. 3 重复检验如果2个平行样检测结果不一致时，应再次进行检测，直到检测结果一致方可进行判定。7 Y!T 3179-2018 附录B(规范性附录)甘肃寄宿根矮化病菌多聚酶链式反应(PCR)检测法B.1 试剂除另有规定外，所用试剂均为分析纯。B. 1. 1 1. 0 mol/L Tris-HC1CpH 8.0)母液的配制:配方见附录A.B. 1. 2 0. 5 mo1/L EDTACpH 8.0)母液的配制:配方见附录A。B. 1. 3 2XCTAB抽提缓冲液:配方见附录A.B. 1.4 氯仿/异戊醇CVjV):配方见附录A。B. 1. 5 检测引物序列:上游引物:5-CCGAAGTGAGCAGATTGACC-3 ; 下游引物:5-ACCCTGTGTTGTTTTCAACG -3。B. 1.6 目标扩增片段:439 bp. B. 1. 7 其他试剂:10XEx Taq bufferCM!f plus)、dNTPsC2.5 mmol/ L)、ExTaq D:IA酶(5UjL)、乙二胶囚乙酸二纳CNazEDTA.2Hz()、6mol/L盐酸CHCl)、 2mol/ L氢氧化纳(NaOH)、乙醇、异丙蹲、-硫基乙醉、75%乙醇、液氮、过氧化氮(H202)。B. 2 仪器设备和耗材同附录A中的A.2。B. 3 样品的采集与前处理B. 3. 1 取样同附录A中的A.3. 1。建议采用甘煎煎茎的汁样品。B. 3. 2 对照材料同附录A巾的A.3. 2. B. 3. 3 样品的存放与运送同附录A中的A.3. 3。B.4 总DNA提取同附录A中的A.4。B. 5 PCR扩增B. 5. 1 在冰上融化各反应组分，瞬间低速离心(约2000Xg下离心3s-5 s).根据测试样品数量.计算好各试剂的使用量，每份样品应设置2个平行反应。B. 5. 2 除样品外，按表B.l配制反应混合液，所有组分加完并充分混合均匀后，盖上离心管的盖子，瞬间低速离心(约2000Xg下离心3s-5 s)，再打开离心管的盖子，用微量加样器向每个PCR反应管中各分装24.。L.B NY/ T 3179-2018 表B1 PCR反应体系(25L)组分使用最L反应体系中各组分的终浓度10XE.r Taq buffer(Mgh plus) 2.5 IX dNTPs(2. 5 mmol/ U 2. 0 0.2 mmol/L ExTaq D:-.1A酶(5U/U O. 125 0.025 U，L 上游寻|物00mol/U1.0 O. 4mol L 下游寻|物00mol/L) 1.0 0.4mol/L 样品1.0 1. 0 ng/L ddH,O 17.375 如PCR缓冲液中不含Mg贝IJPCR反应体系馆另加MgCl，(25 mmol L)至终浓度2.5mmol/ L, B. 5. 3 在已设定的PCR反应管中分别加入样品DNA溶液(25ng/L)各1.0L，空白对照加1.0L元菌ddH20代替样品DNA溶液，盖上PCR反应管的盖子.瞬间低速离心(约2000Xg下离心3S 5 s)后进行PCR扩增。扩增程序:95C预变性10min, 35循环(94C 30 s, 56C退火30s, 72C延伸30 s), 72C再延伸4min。B. 5. 4 每次检测实验均应设阳性对照、阴性对照和空白对照。B. 5. 5 PCR产物电泳检测:将适量的琼脂糖1m人1XTAE缓冲液中，加热溶解，配制成浓度为2.0%的琼脂糖溶液，将其倒入制胶板上，插上梳板，室温下凝罔成凝胶后.放入1X丁AE缓冲液.轻轻垂直向上拔去梳板。吸取5.0L的PCR产物与1L6X上样缓冲液clmL 6X上样缓冲液含O.5L Gel-Red 核酸染料)混合后加入点样孔巾，其中一个点样孔巾加入DNA分子量标记，接通电源在5Y/cm条件下电泳。B.6 结果要IJ定B. 6. 1 实验有效判别根据DNA分子量标记判断PCR扩增产物电泳后所出现的条带的大小。当阳性对照出现与目标扩增片段大小一致的条带、阴性对照和空臼对照未出现该条带时，视为有效实验;否则.视为无效实验。B. 6. 2 检测结果判定观察PCR扩增产物电泳后所出现的条带的大小:如试样中出现与阳性对照大小一致的条带，判定为阳性，说明该试样携带甘煎宿根矮化病菌;如试样中未出现与阳性对照大小一致的条带，判定为阴性，说明该试样不携带甘煎宿根矮化病菌。B. 6. 3 重复检验如果2个平行样检测结果不一致时，应再次进行检测，直到检测结果一致方可进行判定。9 NY/ T 3179-2018 附录C(规范性附录)逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测法C.1 试剂溶解RNA用的试剂为0.1%DEPC处理过的灭菌双蒸水。除另有规定外，其余所用试剂均为分析纯。C. 11 检测引物序列C. 1, 1, 1 甘蕉花叶病毒检测引物序列与目标扩增片段上游引物:5-GAAGAWGTYTTCCAYCAAKCWGGAAC-3(W=T/ A, Y=C/ T,K=G/T); 下游引物:5-AGCTGTGTGTCTCTCTGTATTCTC- 3 ; 目标扩增片段906bp。C.1,12 高粱花叶病毒检测引物序列与目标扩增片段上游引物5-ATGGAAAAAAGTTACGTCGATCTCTTAA - 3 ; 下游引物:5-CATAAACTGTGGTGGAGTTTGGTTG - 3 ; 目标扩增片段245bp。C. 1 1.3 甘穰条纹花叶病毒检测引物序列目标扩增片段上游引物:5-GTGGGTTCAGTTCTCGGTTC-3; 下游引物5-TTTTTTCCTCCTCACGGGGCAGGTTGATTG - 3 ; 目标扩增片段500bp. C.11,4 甘穰黄叶病毒检测引物序列目标扩增片段上游引物:5-AGCGATAGTGAATGAATACGGG- 3 ; 下游引物:5-GCCTACCTATTTGGGATTCTGG - 3 ; 目标扩增片段608忡。C. 12 其他试剂:10XExTq buffer(Mg2+ plus)、dNTPs(2.5 mmol/U、ExTaqDNA酶(5U/!-L)、Trizol试剂、氯仿、乙醇、异丙醇、75%乙醇、液氮、0.1%DEPC处理过的灭菌双蒸水。C.2 仪器设备和耗材基本同A.2。不同点是:离心管、PCR反应管、枪头均为购买的无RNA酶、无DNA酶的离心管、PCR反应管和枪头。C.3 样品的采集与前处理C. 3. 1 取样同附录A中的A.3.1. C. 3. 2 对照材料同附录A中的A.3. 2。C. 3. 3 样品的存放与运送同附录A中的A.3. 3。10 Y!T 3179-2018 C.4 总RNA提取为杜绝外游、酶的污染，要求操作环境干净无灰尘，严格戴好口罩和手套。将样品叶片表面用75%酒精棉擦拭干净后，投入研钵中，液氮研磨至粉末状，每1.5 mL离心管分装0.1g样品。每管加入1.0mL Trizol试剂，迅速混匀，室温下静宣10min以利于核酸蛋白复合体的分离。加入200L预冷的氯仿，快速摇晃15s.室温下静置5min.于4C.12000Xg离心15min.上清液转移至新的1.5 mL离心管。加入等体积20C预冷的异丙醇，颠倒混匀，室温静置10min。于4C.12000Xg离心10min.弃上清液。沉淀用75%乙醇溶液洗涤2次.100%无水乙障洗涤1次，风干，用0.1%DEPC处理过的灭菌双蒸水80L溶解，得到样品RNA考产品说明书。C. 5 cDNA合成C. 6. 2除子，瞬间低管中各分装C. 6. 3 在已设定的PCR反ddH20代替样品DNA溶液，盖上C. 6. 4 PCR扩增程序盒提取样品总RNA.操作步骤参L.空白对照力Q1. 0 L元菌C. 6. 4. 1 甘J!if.花叶病毒检测程序，94C预变性4min.35循环C94C变性30s. 50C退火30s.72C延伸1 min). 72C再延伸5min. C. 6. 4. 2 高粱花叶病毒检测程序:94C预变性4min.35循环C94C变性30s. 56C退火30s.72C延伸1 min). 72C再延伸5min。C. 6. 4. 3 甘煎条纹花叶病毒检测程序:94C预变性5min.35循环C94C变性45s. 55C退火45s. 72C 延伸45s) . 72C再延伸10min. C. 6. 4. 4 甘庶黄叶病毒检测程序:94C预变性4min，35循环C94C变性30s, 50C退火30s.72C延伸11 Y/T 3179-2018 1 mi时，72C再延伸5min。C. 6. 5 每次检测实验均应设阳性对照、阴性对照和空白对照。C. 6. 6 PCR产物电泳检测:将适量的琼脂糖加入lXTAE缓冲液中，加热溶解，配制成浓度为2.0%的琼脂糖溶液，将其倒入制胶板上，桶上梳板，室温下凝固成凝胶后，放入lXTAE缓冲液，轻轻垂直向上拔去梳板。吸取5.0L的PCR产物与1L6 X上样缓冲液(1mL 6X上样缓冲液含o.5L Gel-Red核酸染料)混合后加入点样孔中，其中一个点样孔中加入DNA分子毡标记，接通电源在5V/cm条件下电泳。C.7 结果判定C. 7. 1 实验有效判别根据DNA分子量标记判断PCR扩增产物电泳后所出现的条带的大小。当阳性对照出现与目标扩增片段大小一致的条带、阴性对照和空白对照未出现该条带时，视为有效实验;否则，视为无效实验。C. 7. 2 检测结果要IJ定观察PCR扩增产物电泳后所出现的条带的大小:如试样中出现与阳性对照大小一致的条带，判定为阳性，说明该试样携带所检测的病毒;如试样中未出现与阳性对照大小一致的条带，判定为阴性，说明该试样不携带所检测的病毒。C. 7. 3 重复检验如果2个平行样检测结果不一致时，应再次进行检测，直到检测结果一致方可进行判定。12 FCN-EF凹Hhz中华人民共和国农业行业标准甘蕉脱毒种茵检测技术规范NY/ T 3179- 2018 中同农业出版社出版(北京市朝阳区麦子底街18号楼)(邮政编码100125网址.ccap. corn. cn) 中同农业出版社印刷厂印刷新华书店北京发行所发行各地新华书店经销* 峰* 印张1.25 字数25下字2018年5月北京第1次印刷晤开本880rnrnX1230rnrn 1/16 2018年5月第l版书号，16109 . 4467 定价32.00元峰-一版权专有侵权必究举报电话[phone]