核酸分析.ppt

单击此处编辑母版标题样式,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,1,第四章,核酸分析,2,核酸,(Nucleic Acid),包括,DNA,和,RNA,两种，是由,碱基,、,戊糖,和,磷酸,三者组成。,在自然界中,DNA,分子存在形式有：双链线状，双链闭环，双链开环和超螺旋四种基本结构。不同结构的,DNA,具有不同的生物功能，但绝大多数,DNA,分子是以,双链超螺旋结构形式存在,。,DNA,是遗传信息的携带者，是基因表达的物质基础，其遗传信息是通过不同核苷酸的排列顺序而被贮存的。,3,与,DNA,相比，,RNA,的结构较为简单，它主要是以单链形式存在，有时也能形成局部的双链发夹式结构。它的,一般功能是翻译，转录,DNA,分子所含的信息，指导蛋白质的合成,。,核酸在生物的生长、发育和繁殖等正常生命活动中起着非常重要的作用。此外，核酸与生命的异常现象,(,如：肿瘤,),的发生和遗传性疾病等紧密关联。因此，核酸是现代生物学、化学和医学重要的研究领域之一。,4,4.1.,脱氧核糖核酸及核糖核酸的结构,核酸是由大量的核苷酸单体以聚合方式组成的极长的线状聚合物。不同核酸的核苷酸数目可以从,80(,转移核糖核酸，,tRNA),个碱基对大到,10,8,个碱基对。,表示双链和单链核酸大小的单位分别为碱基对,(bp,，,basepare),和碱基,(b,，,base),，,kbp,和,Mbp,分别代表,1 000,和,1000000,个碱基对，而,1kb,则代表,l 000,个碱基。例如，噬菌体染色体的大小为,4MbP,，分子量大约为,3,lo,9,，长度为,1.5mm,。,DNA,比,RNA,大得多，如人细胞核最小的,DNA,分子中碱基对数目为,4.5Mbp,，最大的,RNA,分子仅含,50 kb,，二者相差约,1000,倍。,5,4.1.1,碱基、核苷及核苷酸,核苷酸是核苷的磷酸酯，它们是脱氧核糖核酸,(DNA),及核糖核酸,(RNA),的组成单元。,RNA,的组成单元是核糖核苷酸，而,DNA,的组成单元是,2,脱氧核糖核苷酸。,核酸中的五种主要碱基的结构,6,由碱基和核糖结合所形成的,-,糖苷类化合物称为核苷。,7,4.1.2 DNA,的结构,DNA,的一级结构,DNA,由两条互补的单链,DNA,组成，每条单链都是脱氧核苷酸间以磷酸二酯键连接起来的，为了书写的方便，因常在描述,DNA,一级结构时可用一些简单的方式来表示。,8,如左图,DNA,片段，可表示为,5,-dpApGpCpTpG-3,，或,d(pAGCTG),，式中的,d,代表脱氧核糖，,p,代表磷酸，当,p,写在碱基英文字母缩写右边时为,C,3,位,OH,基被酯化，写在左边时为,C,5,位,OH,基被酯化。一般为了更为方便起见，就简单地写为,AGCTG,，其方向规定为,5,3,方向。,9,DNA,的二级结构,DNA,的二级结构指,DNA,分子的空间结构，即三维空间的结构。,1953,年，,Watson,和,Crick,首先提出了,DNA,分子的双螺旋结构模型,10,DNA,双螺旋结构模型及碱基配对的示意图,11,DNA,的三级结构,DNA,的三级结构是指双螺旋链的扭曲，包括多重螺旋、分子内单链形成的环等等。其中超螺旋是最常见的结构。一些病毒,DNA,是单股螺旋而绝大多数天然,DNA,是双股螺旋。不论是单股还是双股螺旋都可能形成闭环而失去自由的,3,和,5,末端。闭环分子大多数都会扭转成为三维螺旋结构，也就是,DNA,分子的三维结构，一般称作超螺旋,(Supercoil or Superhelix),12,电镜下观察到的噬菌体,PM2,的超螺旋结构,(a),图为松弛环,DNA,，,(b),图为超螺旋,DNA,13,4.2,核酸的定量及结构分析,核酸是最重要的一类生物大分子，它与自然界中的各种生命活动都有着非常密切的关系。其含量的变化或结构的微小变化都可能导致意想不到的后果，如各种与基因相关的疾病的发生。可以说，该酸化学是现代分子生物学的主要研究内容。而所有这些研究工作都离不开核酸的分析问题，有时需要简单的定量，有时需要研究核酸结构的各种变化，等等。因此，,核酸分析化学实际上是打开与核酸相关的各种难题的一把金钥匙，各种方法的研究具有重要的理论意义和实际应用价值。,14,4.2.1,免疫化学法,原理,有些构型的,DNA(,如左手螺旋,DNA,，,Z-DNA),经化学修饰可以诱导产生高特异性的抗体，所产生的抗体可以用作分析这些核酸的免疫化学试剂。免疫化学方法尤其适合于,DNA,结构及,DNA,化学修饰的分析，如,DNA,与致癌物所形成的加成物的分析。抗,DNA,抗体对于高特异性确定各种碱基及构型，检测不同构型,DNA,间的转化，及在复杂的细胞环境下,DNA,的化学修饰都是非常有用的。,15,抗体制备,在实验中可采用两种免疫原来诱导单克隆或多克隆抗体。第一种免疫原是,DNA,与带正电荷的载体蛋白间所形成的非共价络合物，甲基化的牛血清白蛋白是常用的载体之一；另一种类型的免疫原是通过不同的方式将核酸组分,(,核苷酸、核苷或碱基,),与载体蛋白共价连接而获得。除了实验免疫之外，动物或人的自身免疫疾病所产生的血清也可作为核酸抗体的一种来源。,16,分析方法,用于检测抗体与,DNA,复合物的方法包括凝胶免疫扩散法，沉淀法，絮凝法，络合物的电镜分析法，酶联免疫吸附分析法,(ELISA),放射免疫分析法,(RIA),和凝胶位移分析法等。,17,4.2.2,光谱法,光谱方法可以分为下述三大类：,(1),电子光谱：包括紫外,(uv),及可见吸收光谱，荧光光谱，圆二色光谱,(CD),及线圆二色,(LD),光谱；,(2),振动光谱：包括红外,(IR),光谱，拉曼光谱及振动圆二色,(VCD),光谱；,(3),核磁共振,(NMR),光谱。,18,产生上述三类光谱的来源不同，因而各类方法的灵敏度也就有很大的差别。一般来说，电子光谱的灵敏度比振动光谱或,NMR,光谱高,1,2,个数量级。也就是说在使用振动光谱或,NMR,光谱时所需要的样品的浓度要比电子光谱时高,1,2,个数量级。另一方面，电子光谱不像振动光谱那样具有很强的特征性，当使用电子光谱时一般只利用了一种类型的生色基，如核酸碱基或其它类型的吸收配基面振动光谱可以提供核酸碱基及糖,磷酸酯骨架的各种类型化学键的吸收。,NMR,光谱的分辨率也很高，特别是,1,H NMR,和,13,C NMR,，,31,P NMR,光谱可以提供有关糖,磷酸酯骨架的特殊信息。振动光谱及,NMR,技术可以提供更多的有关核酸分子状态及核酸分子不同部位变化的信息。,19,紫外吸收光谱,1.,定量分析,20,世纪,60,年代就发现了核苷酸、多聚核苷酸及核酸的紫外吸收。所有聚合态的核酸都在,260 nm,处有一个宽的最大吸收带，,230 nm,处的吸收最小，在,200nM,以下的短波长区有另一最大吸收。吸光度比,A260/A280,和,A260/A230,是核酸质量的重要标准。纯核酸样品的,A260/A280,比值应该大于,1.8,；如果此值比较小则表示有蛋白质杂质的存在，因为蛋白质通常对,280 nm,处的吸收有很大的贡献。而比值,A260/A230,应该为,2,或更高此值低表示有蛋白质,(,肽键在此范围内有吸收,),或其它杂质。另外，样品的悬浊性或乳光也会使这些比值产生比较大的偏差。,20,2,吸收熔点曲线,当含有双螺旋,DNA,或,RNA,的水溶液的温度缓慢升高到某一温度时，由于解旋作用的发生，溶液的吸光度,(,一般在,260 nm),会迅速增大。这一转化过程突跃的中点所对应的温度称之为熔化温度,T,m,，与晶体的熔点对应。对链长较短的寡聚核苷酸，,T,m,或这种转化曲线的陡度随链的加长而增加，但,T,m,值在给定的条件下是固定值。,DNA,的,T,m,值与其所含的碱基,(G,C),或,(A,T),的相对含量之间的关系可用下述经验公式来表示：,21,一些,DNA,的变性温度曲线曲线,a,、,b,和,c,所代表的,DNA,中（,G,C,）分别为,38,、,52,和,66,22,圆二色,(CD),光谱,圆二色光谱是检测,DNA,构型变化的非常灵敏的技术。核酸的,CD,可用,随波长的变化来表示，,L,R,，,L,和,R,分别为用左手和右手圆极化光时的摩尔吸光系数。与核苷酸单体的,CD,相比，双螺旋核酸,(DNA,或双链,RNA),具有强得多的,CD,吸收带。,近紫外区,CD,谱常被看成是不同类型双螺旋,DNA,的特征，持别适合于检测核酸双螺旋由右手,B,到左手,Z,型的转化。,23,Poly(dG-dC).poly(dG-dC),在,22,C,下以,B(-),，,A(,),和,Z,型,(,),存在时的,CD,谱,(b)Poly(rG-rC).poly(rG-rC),在以,A,型,(-)(22,C),和,Z,型,(,)(46,C),存在时的,CD,谱,24,有许多化合物,(,如药物及染料,),在可见或近,UV,区具有吸收，但由于不含手性中心而不具有,CD,信号，而当它们与,DNA,和,RNA,的螺旋结构结合时便会产生强的,CD,吸收带。这些吸收带有时在,DNA,的吸收带之外,(,通常大于,300nm),，在这种情况下，,值的大小可以用来指示药物与,DNA,和,RNA,的相互作用。,比较有意义的例子是药物纺锤菌素,(Netropsin),、远霉素,(Distamycin),和,DAPI4,，,6,二脒基,2,苯基吲哚,),与,DNA,小沟区的相互作用。,25,拉曼光谱,现代激光拉曼光谱是研究核酸构型的强有力的工具。核酸拉曼光谱的范围大约为,6001800 cm,-1,。从原理上讲，拉曼光谱可以显示类似于,IR,光谱的化学键的振动态。,自,20,世纪,80,年代初期以来，振动拉曼光谱也被用于,DNA,构型变化的研究。通常采用对应于核酸碱基电子吸收,(250,280 nm),带的激发光激发。因此，只能观测到有关碱基构型变化的信息。振动拉曼光谱与常规拉曼光谱相比其优点是样品浓度可以低,20,100,倍，有时,DNA,构型发生变化时所引起的谱带强度的变化更大，检测比较容易。,26,核磁共振光谱,NMR,是目前用于,DNA,结构,(,构型,),研究的特殊技术。,31,P NMR,光谱已经被成功地用于推测磷酸二酯键的构型。,研究表明，核苷酸之间磷酸酯的化学位移对,O,3,P,和,P,O,5,寡聚核苷酸骨架的扭转角非常敏感。,27,在核酸研究中光谱方法是应用最为广泛的物理方法，,UV,光谱以其简单,(,测定,260 nm,处的吸光度,),而成为核酸研究实验室中用于测定,DNA,和,RNA,浓度的常规分析方法。,其它光谱方法都需要特殊的仪器，这些仪器只有在专业性比较强的实验室里才有。要获得隐藏在,DNA,、,RNA,及寡聚核苷酸等样品光谱数据后面的所有信息则需要特殊的训练和经验。,CD,，,IR,，拉曼，甚至,NMR,谱也可以用作定量及不同,DNA,构型比较的分析工具。可以跟踪构型的转化或配体的结合。有时根据转化和结合对温度的依赖性可以获得有关过程的热、动力学数据。,28,NMR,可用于合成的寡聚核苷酸或它们与蛋白质或配体所形成的络合物的研究，由此可以提供大量而重要的结构信息，特别是与计算机模拟计算结合使用时更是如此，所得结果可以与,x,射线晶体衍射所得的结果比较。,29,4.3,小分子与核酸相互作用的研究,在核酸化学研究中，小分子一般是指分子量不大于,1000,的一类有机化合物、络合物等，药物是这类化合物中典型的一类。这类小分子化合物一般属于癌化学治疗试剂、核酸的裂解试剂、核酸染色及结构探针。因此，对它们的研究一直非常活跃。,30,小分子与核酸相互作用研究受到重视的主要原因是：,(1),研究结果表明，绝大多数抗癌药物在生物体内的靶目标都是,DNA,，它们通过与肿瘤细胞,DNA,结合，干扰,DNA,的复制和,RNA,的合成，使肿瘤细胞遭受致命损伤，因而药物与,DNA,作用的研究是药物作用机理研究的关键所在。这一领域的研究对于有效地设计和指导新药物的合成具有重要的意义。,(2),广泛应用于分子生物学各个领域中的人工核酸内切酶是由小分子,DNA,裂解试剂和,DNA,识别结合系统组成的。由于这种内切酶能够在人们预先设计好的任何位点断裂,DNA,这就使其成为遗传工程技术中非常有用的工具。,(3),用作核酸探针的小分子可与某种特异的靶核酸分子发生明显的相互作用，从而可对核酸进行定量检测、序列和结构识别。,31,所以，小分子与核酸相互作用的研究，对于了解核酸的结构和功能，对于控制和改善基因表达，对于阐明药物的作用机理以及对于一些疾病的诊断、治疗均有着很重要的价值。,32,4.3.1,小分子与核酸的相互作用模式,小分子与核酸的相互作用可分为三种基本形式，即,共价相互作用,、,可逆相互作用,及,嵌入作用,。,33,共价作用,小分子与核酸的共价相互作用主要是同核酸各种碱基的反应，如亲核反应、亲电反应、加成反应等。目前临床上使用的烷化剂类抗癌药物，它们可以使,DNA,的碱基烷基化，从而干扰,DNA,的复制和,RNA,的合成，因而表现为具有抗癌活性。目前最畅销的顺铂类抗癌药物具有极强的抗癌活性，这主要是由于发生鸟嘌呤,N,一,7,位亲电反应，形成了链内和链间交联物，结果大大干扰了,DNA,的双螺旋结构。,34,有许多致癌物在代谢过程中会转化为烷基化试剂而使,DNA,的碱基产生烷基化。在芳香族含氮化合物中最危险的一类是芳环羟氨类衍生物，它们在氨的生物氧化或含氮化合物的代谢还原过程中产生。偶氮类化合物的活化通过第一步还原和第二步氧化实现。在这些致癌物的活化过程中细胞色素,C-P450(Cyt C-P450),常常起着非常重要的作用。实验结果表明，低于,1,g,g,的黄曲霉素可以引发小鼠的肝和肺产生肿瘤。,35,黄曲霉素的代谢环氧化物与,DNA,中乌嘌呤的结合,36,可逆作用,核酸与小分子间的非共价可逆相互作用有三种基本形式，它们是静电作用、与核酸沟区间的作用及嵌入作用。,小分子与核酸的可逆相互作用的三种基本形式,37,1,静电相互作用,(Electrostatic Interaction),核酸是高度电荷化的聚合电解质，其带负电荷的磷酸骨架可以同阳离子发生静电作用，这种作用对于核酸构型的稳定化是非常重要的。,2,与核酸沟区的相互作用,(Groove-binding),在,DNA,双螺旋结构中，存在着大沟区和小沟区它们在电场方面、氢键性质、空间效应及水化作用方面都有很大的不同。许多蛋白质分子及寡聚核苷酸分子主要与大沟区发生作用、而小分子因其分子体积小，主要同小沟区作用。,3.,嵌入作用,(Interaction),一些平面的、带正电荷的芳香族小分子，或者具有其他特殊结构的分子，可以嵌入到,DNA,双螺旋结构的碱基对之间，这种作用称为嵌入作用,38,4.3.2,小分子药物与核酸的相互作用,不少药物实际上都是金属络合物，因此，研究核酸与金属络合物的相互作用不仅可以揭示药物的作用机制，而且可以指导更有效地进行新药的设计和合成。,某些具有手性的金属络合物和有机分子能通过氢键、静电引力和范德华力挤压或插入到双链,DNA,分子的大、小沟中与之结合；而某些具有平面结构的分子能插入到碱基对之间，与,DNA,形成更复杂的络合物。这样形成的络合物在医学研究和基因表达方面具有重要的意义。,39,20,世纪,80,年代以来，人们发现某些金属的络合物，如,Fe-EDTA,，,Cu,邻二氮菲,(Cu,Phen),和,Fe,卟啉等能产生羟基自由基或金属氧化型衍生物，后者进攻核糖和脱氧核糖的,C,1,或,C,4,位，经分子重排导致核酸分子中磷酸二酯键的断裂而使核酸大分子降解。由于这种作用与核酸酶的作用相似，这些金属络合物被认为具有核酸酶活性。由于金属络合物的核酸酶活性的发现，为化学研究及其与生物学的结合和应用开拓了新的领域。例如，序列专一性的人工核酸酶,(Sequence,Specific Artificial Nuclease),的研究就是目前化学和生物学交叉研究领域中的一个热点。,40,所谓序列专一性的,人工核酸酶,，也称为,人工核酸内切酶,(Artificial Endonuclease),，指的是末端与金属络合物共价键合的寡聚核苷酸片段。它能与单链的靶,DNA,按碱基配对的原则进行分子杂交而形成双链区。当有氧化还原剂存在时，与之连接的金属络合物通过化学反应产生自由基，后者进攻相邻的核糖和脱氧核糖使之发生磷酸二酯键的断裂，而从靶,DNA,剪切出与之互补的序列。由于金属络合物和寡聚核苷酸都可以人为地设计合成，对于任何一个靶,DNA,，都能设计合成出相应的寡聚核苷酸的金属络合物，从而使其在预期的位点发生断裂。因此。这方而的研究在基因表达的人工调控中应用具有很大潜力。,41,寡聚脱氧核苷酸,EDTA,Fe(II),定位断裂,DNA,的原理,42,4.3.3,核酸小分子探针的研究,在生物化学相关的研究领域，小分子探针指那些可以探测生物大分子各种信息的一类小分子化合物，这类化合物可以与生物分子发生特异性相互作用，并使小分子化合物的物理化学性质、光谱性质或电化学性质等发生变化，根据这些性质的变化可获得生物分子的各种信息。这类小分子化合物因此被称之为探针。,43,核酸探针的研究涉及核酸的一级、二级及碱基的结构。利用适当的探针与核酸进行各种选择性反应以探测核酸本身所不能给出或不能灵敏给出的结构或量的信息。,常用的核酸小分子探针，按其物理化学性质来分，可以分为,有机染料探针,、,金属离子及其络合物探针,。,44,有机染料探针,这类探针基本上属于荧光探针。核酸及其碱基在常温下的荧光量子产率非常低，利用具有荧光的有机染料与,DNA,作用时荧光性质的变化可以获得有关,DNA,结构及定量的信息。,45,目前，在生物学和分子生物学研究中，溴乙锭,(Ethidium bromide,，,EB),一直作为电泳分析的荧光检测试剂而被广泛使用。它与,DNA,和,RNA,及双链寡聚核苷酸络合，并使,EB,的荧光增强，通常激发和发射分别在,530,620 nm,。这种方法对,DNA,的最低检出限为,10ng/ml,。,EB,与核酸中双链区的结合是特异的。利用它与各种构型核酸的结合比率的不同及所产生的荧光强度的变化，可以把各种构型的核酸区分开来。,46,例如，它能鉴别天然核酸和变性核酸，区分线状,DNA,、环状,DNA,和超螺旋,DNA,。另外，,EB,也可以结合到,RNA,上，所以测定,DNA,时，需要用,RNA,酶破坏掉,RNA,。除此之外，,EB,还用于鉴定血液中的细菌，检测,DNA,与蛋白质复合物的形成及测定聚合酶链反应产物的产量等。,47,48,另一种有机染料类探针为双苯并咪唑染料,(Hochest),。它是,DNA,小沟区结合的荧光探针，相对于,EB,而言它是非毒性的和水溶性的。它与,DNA,作用后使自身的荧光强度大大增强。该染料的荧光激发和发射波长分别为,355,和,460 nm,。富含,A,：,T,碱基的,DNA,对该染料的荧光增强最为显著。它用于琼脂糖凝胶电泳中,DNA,的检测，,RNA,不产生干扰。,49,金属离子及其络合物探针,一些过渡金属络合物可作为,DNA,构型的选择性探针。它基于络合物与,DNA,局部的构型、形状和对称性匹配作用所产生的选择性，即所谓构型选择性。这类金属络合物为手性分子，可识别不同构型的,DNA,。这些络合物可以作为,DNA,二级和三级结构的探针，以探测,DNA,构型的细微变化，而这些变化的部位往往是蛋白质结合之处。,50,4.4 DNA,序列的测定,DNA,序列分析是揭开遗传密码的关键，也是基因研究的基础。继,1953,年,Watson&Crick,提出,DNA,双螺旋结构以后，人们进行了一系列,DNA,一级结构分析方法的探索。由于凝胶电泳技术的发展及第二类限制性核酸内切酶的出现，,DNA,序列分析技术在,70,年代后期有了突破性进展。,Sanger,的末端终止法和,Maxam Gilbert,的化学测序法相继间世，并以其简单、快速及准确的优点成为目前被采用的主要测序方法。为此,Sanger,和,Maxam Gilbeert,分享了,1979,年诺贝尔化学奖。,DNA,测序方法经过不断地改进，在测序的对象和范围方面都有了很大的扩充。但它距一些大的测序项目，如人的基因组项目的研究的要求来说还有很大的差距。,51,4.4.1,人类基因组项目,人的基因组项目,(Human Genome Project),是美国于,1990,年提出的该项目规定在,15,年内投资,30,亿美元完成人的基因组的全部,DNA,测序、定位及遗传学研究。在这一系统工程中,DNA,序列分析是整个项目的重点和控制步骤，在该项目的第一个,5,年计划的第三年,(1993),，美国重新制定了新的,5,年计划,(1994-1998),强调经费每年必须达到,2,亿美元，并明确规定其中,1,亿美元用于发展,DNA,序列分析技术。,52,人是复杂的高等生物，人的基因组约含大约,8,万个基因，比所有典型生物的基因组都要复杂。如人的最小和最大染色体的碱基对数目分别为,50,和,250 Mb,，整个人的基因组的碱基总数约为,3000 Mb,；而整个酵母和水稻的基因组碱基对数目分别只有,15,和,46Mb,，比人的最小的染色体的碱基对数目还要小。,53,DNA,序列分析的方法可以按其发展及特点分为：,(1),目前所广泛采用的方法，它包括经典的板凝胶电泳放射性自显影法和基于板凝胶电泳激光荧光的自动化序列分析法；,(2),毛细管和阵列毛细管凝胶电泳激光荧光法及超薄层板凝胶电泳激光荧光法，这类方法也是基于聚丙烯酰胺凝胶的分析方法，但这些方法的主要目的是提高测序速度，以满足大型测序项目的要求；,54,(3),不使用凝胶电泳分离的直接测序技术，如质谱法、原子探针法,(,隧道扫描显微镜和原子力显微镜,),、杂交法和流动单分子荧光检测法。这类方法目前还处于探索阶段，它的成功将成为,DNA,测序方面的一场巨大的变革，大大减轻测序的工作量，提高测序的速度。,55,DNA,测序的基本步骤,1),通过适当的方法制备与待测序,DNA,模板互补的所有可能的带标记的单链寡聚核苷酸片段；,2),将得到的单链寡聚核苷酸片段混合物经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离。对电泳分离的要求是能够分辨出一个脱氧核苷酸的差异，而可以测得的寡聚核苷酸长度，往往受限于电泳分离技术的分离度。,3),从电泳图谱直接读出待测,DNA,的序列并进行核实。,56,4.4.2,特异性化学裂解法快速测定定,DNA,序列,首先需要制备一个单一末端以,32,P,标记的,DNA,片断，通常用多核苷酸激酶将,32,P,引进,5,-OH,末端，然后选择性地将此标记的,DNA,片段在四个核苷酸之一处断开。,例如，若标记的序列是：,5,-,32,P-GCTAGTAC-3,，则对每种碱基分别进行特异性切割所得到的放射性片段为：,在,A,处切割：,5,-,32,P-GCT,；,5,-,32,P-GCTAGT,在,G,处切割：,5,-,32,P-GCTA,在,C,处切割：,5,-,32,P-G,；,5,-,32,P-GCTAGTA,在,T,处切割：,5,-,32,P-GC,；,5,-,32,P-GCTAG,57,5,P,GCTAGTAC,3,片段在四种核苷酸碱基处分别特异性断裂后电泳分离，放射自显影的示意图,58,目前,DNA,测序中应用最为广泛的获得与待测序,DNA,模板互补的所有可能的单链寡聚核苷酸片段的技术是,Sanger,双脱氧法,和,Maxam-Gilbert,化学裂解法。,59,4.2.1.2 DNA,测序策略,人类基因组计划涉及,DNA,的大规模测序，它是一项庞大的工程。根据现有的技术水平，一套测序反应中可测到的可靠序列信息有限，因此人类还无法对基因组这样的复杂,DNA,大分子直接进行测序，而只能采取化整为零的测序基本策略，即将基因组,DNA,分割成一定大小的片段，然后分别对这些片段进行测序。目前,DNA,大片段测序的通用策略主要有,鸟枪测序法,和定向法。,60,4.2.1.3 DNA,测序的分离方法,凝胶电泳技术,毛细管电泳技术,芯片毛细管电泳技术,61,4.2.2 DNA,传感技术,DNA,传感技术或者基因传感技术是一种建立在,DNA,特异性杂交基础之上的,DNA,检测技术，它是将核酸作为分子识别及检测层并与各种换能器相结合而产生的一种可以在分子水平上进行快速检测、监控的微量生物分析技术，在,DNA,测序、遗传性疾病诊断、环境监控分析、基因指纹图谱的建立及法医鉴定等方面都有着极大的应用价值和意义。,62,基因传感器的工作原理是：将,DNA,探针（捕获探针）固定在载体表面，在适当的温度、,pH,值和离子强度下与互补的靶序列,(Target-sequence),选择性地结合形成表面双链,DNA,，然后换能器将信号放大并进行检测。由于该传感器中探针与靶序列间以高度序列选择性通过氢键形成双螺旋结构，因此能在多种非互补序列的混合物中识别出靶序列而具有极强的分子识别功能，此探针一般为人工合成的单链寡聚脱氧核苷酸片段，其长度从十几个到上千个核苷酸不等。,DNA,传感技术的发展主要有赖于,DNA,在载体表面上的固定化、换能器对杂交信号的检测等两个方面。,63,双脱氧终止法,在测序用的缓冲液中含有四种,dNTP,及聚合酶,.,测序时分成四个反应,每个反应除上述成分外分别加入,2,3-,双脱氧的,A,C,G,T,核苷三磷酸,(,称为,ddATP,ddCTP,ddGTP,ddTTP),然后进行聚合反应,.,在第一个反应物中,ddATP,会随机地代替,dATP,参加反应一旦,ddATP,加入了新合成的,DNA,链,由于其,3,位的羟基变成了氢,所以不能继续延伸,.,所以第一个反应中所产生的,DNA,链都是到,A,就终止了,;,同理第二个反应产生的都是以,C,结尾的,;,第三个反应的都以,G,结尾,第四个反应的都以,T,结尾,电泳后就可以读出序列了,.,64,例如,假如有一个,DNA,互补序列是,GATCCGAT,我们试着做一下,:,在第一个反应中由于含有,dNTP+ddATP,所以遇到,G,T,C,三个碱基时没什么问题,但遇到,A,时,掺入的可能是,dATP,或,ddATP,比如已合成到,G,下一个如果参与反应的是,ddATP,则终止,产生一个仅有,2,个核苷酸的序列,:GA,否则继续延伸,可以产生序列,GATCCG,又到了下一个,A,了,.,同样有两种情况,如果是,ddATP,掺入,则产生的序列是,GATCCGA,延伸终止,否则可以继续延伸,产生,GATCCGAT.,所以在第一个反应系统中产生的都是以,A,结尾的片段,:GA,GATCCGA,同理在第二个反应中产生的都是以,C,结尾的片段,:GATC,GATCC,在第三个反应中产生的都是以,G,结尾的片段,:G,GATCCG,在第四个反应中产生的都是以,T,结尾的片段,:GAT,GATCCGAT,电泳时按分子量大小排列,A,反应的片段长度为,2,7;C,反应的为,4,5;G,反应的为,1,6;T,反应的为,3,8,四个反应的产物分别电泳,结果为,8 7 6 5 4 3 2 1,我们可以从右向左读,为,GATCCGAT,至此,测序完成。,65,鸟枪法是将目的,DNA,随机地处理成大小不同的片段，再将这些片段的序列连接起来的测序方法。,