NY∕T 2889.2-2016 氨基寡糖素 第2部分：氨基寡糖素水剂(农业).pdf

ICS 65.100.30 B 17 NY 中华人民共和国农业行业标准NY/ T 2889.1-2016 氨基寡糖素第1部分:氨基寡糖素母药Oligochitosan一Part 1 : Oligochitosan technical concentrates ( TK ) 2016-05-23发布2016 -10 -01实施;中华人民共和国农业部发布NYj T 2889. 1-2016 目。吕NYj T 2889(氨基寡糖素分为2部分:一一第1部分:氨基寡糖素母药;第2部分:氨基寡糖素水剂。本部分为NYjT2889的第1部分。本部分按照GB/T1. 1-2009给出的规则起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利，本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本部分由农业部种植业管理司提出并归口。本部分起草单位:农业部农药检定所、中同科学院大连化学物理研究所。本部分主要起草人:周欣欣、袁善奎、杜垦光、李曙光、李国平、瞿唯钢、陶要菁、张善学、拓亚琴、周艳明、王一苗。I 范围本部分规定了农药氨基寡本部分适用于以壳2 下列文件。凡是不注GB/ T 1 GB/ T GB/ T GB/ GB GB GB GB/ GB/ GB/ 3 要求4 试验方法4. 1 抽样NY / T 2889. 1-2016 氨基寡糖素第1部分:氨基寡糖素母药按照GB/T1605规定进行样品的采集，用随机数表法确定抽样的包装件，最终抽样量不少于100 g。采样时应特别注意避免样品污染，采样容器和工具应经过消毒灭菌，样品采集后应立即进行检验，若不能立即检验，应在40C条件下贮存。NY/ T 2889. 1一20164. 2 鉴别试验根据实验室的条件可选择离子色谱法或质谱法进行氨基寡糖素有效成分的鉴别。4.2.1 离子色谱法本鉴别试验可与氨基寡糖素母药中氨基葡萄糖质量分数的测定同时进行。在相同色谱条件下，氨基寡糖素母药试样溶液中氨基葡萄糖、壳二糖、壳三糖、壳四糖、壳五糖和壳六糖色谱峰的保留时间与对应标样溶液色谱峰的保留时间，其相对差值应在1.5%以内。氨基寡糖素母药至少要含有壳二糖至壳六糖中的2个或者多个。氨基寡糖素呵?药和混合标准榕液的离子色谱见图l。B 4 6 A 说明:A一一混fT标准浴液:3一一壳四糖，13-一氨基寡精家母约溶液;4一一氨基葡萄糖.l一-壳六糖，5 壳三糖;2 壳于1椭6壳J糖。图1氨基寡糖素母药和混合标准溶液离子色谱图4. 2. 2 质谱法4.2.2. 1 方法提要本鉴别试验，通过样品的基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF -MS)分析，利用数据处理软件，进行样品数均分子量、重均分子量、多分散性和平均聚合度统计分析，氨基寡糖素母药应至少含有壳二糖至壳六糖中的2个或者多个。氨基寡糖素母药的质谱图见罔2。2 型 5创)()4回)()3。2国卫。11围)()2创4()()说明l一一壳J糖;2一一壳=气糖;3 壳阿糖-4一一壳五糖:523.Q7 600 M1J止-旦立i旦旦且.l.I单J:!.8 l)() 12时】14 l剧)()18创32四JO22 质荷比5 壳六腑，6 壳七糖;7 壳八糖。图2氨基寡糖素母药质谱图NY/ T 2889. 1-2016 4. 2. 2. 2 试剂和溶液a) 基质2，5-二短基苯甲酸;b) 校正用混合多肤标准品;c) 乙睛:色谱纯;d) 乙醇:色谱纯;e) 三氟乙酸。4. 2. 2. 3 仪器基质辅助激光解析电离飞行时间质谱仪，采用反射模式、正离子检测，全景式宽域聚焦技术，数据采用统计软件进行分析处理。4. 2. 2. 4 测定步骤基质2，5-二楚基苯甲酸和校正用混合多肤标准品用乙腊、超纯水、三氟乙酸按照体积比200: 100 : 3配制成乙睛酸性济剂。将2，5-二握基苯甲酸和待测样品分别榕于上述榕剂配制成50g/L和10 g/L溶液备用。将等体积的基质和样品溶液充分混匀，取O.5L混合液滴于靶板上，待榕剂自然挥发样品结晶后，滴加O.5L乙醇，使样品与基质?昆合物二次结晶，乙醇挥发后即可进行质谱检测。4. 3 氨基寡糖素质量分数的测定氨基寡糖素质量分数的测定可以采用分光光度法和离子色谱法，其中离子色谱法作为仲裁方法。4.3. 1 分光光度法试样用浓盐酸(优级纯)水解成氨基葡萄糖，氨基葡萄糖在碱性条件下与乙酷丙翻形成色原，色原在酸性反应液中与对二甲基氨基苯甲醒反应显红色，其颜色深浅程度与氨基寡糖素质量分数呈线性关系，采用分光光度法测定氨基寡糖素的含量。4.3.1. 1 试剂和溶液a) 水:去离子水;b) 125.45 g/ L磷酸三纳溶液CA榕液):称取Na3P04 12HzO 125.45 g，用水定容至1000mL; c) 100g/L四棚酸铀溶液也洛液):称取95%四棚酸纳100.00g，用水定容至1000mL; d) 磷酸三铀-四棚酸铀溶液:取98mLA与2mLB相混即得;e) 3.5%乙酌丙酬试剂:取乙酷丙酣3.5mL，用磷酸三铀四棚酸铀榕液配成100mL; f) 对二甲氧基苯甲醒CPDABA)试液:取0.16g PDABA恪于1.5 mL 12 mol/L盐酸溶液后，以10. 5 mL异丙醇稀释;g) 标样:盐酸氨基葡萄糖，已知质量分数二三99.0%。4.3. 1.2 主要仪器、设备分光光度计。4.3. 1.3 试验步骤4. 3. 1. 3. 1 标样溶液的制备准确称取标样0.6000g(精确至0.0002剖，转移到25mL容量瓶中，用水定容至2 5mL，制成20mg/mL氨基葡萄糖溶液。用移液枪分别取20mg/mL氨基葡萄糖榕液375L(相当于氨基葡萄糖7.5mg)置于10mL带聚四氟乙烯衬垫螺旋盖的玻璃管(水解管)中，然后用移液枪加入6mol/L盐酸2.625mL，充分混匀后在管子里充入高纯氮气并将管子密封，于100.C油浴中加热3h。冷却到室温后打开螺旋盖，用移液枪将1. 0 mL水解液转移到蒸发皿中，在70.C烘箱中挥发至干。加1mL水将蒸发皿中的团体榕解后在70.C烘箱中挥发至干，此步骤重复2次。用5mL 7Jc将得到的固体溶解，并转移到25mL容量瓶中。用5 mL 7Jc洗涤蒸发皿，液体转入到同一容量瓶中，重复洗涤2次，用水定容到25mL。得到标准氨基葡萄糖、溶液。3 NY/ T 2889. 1一20164. 3. 1. 3. 2 标准曲线的制作取10mL带螺旋盖试管5支，依次加入氨基葡萄糖标准液OmL、0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL, 再分别用移液枪加水到总体积为0.8mL，得到浓度分别为Og/mL、25g/mL、50g/mL、75g/mL、100g/mL的氨基葡萄糖梯度溶液。在每个试管中加入乙酷丙E同试剂0.6mL，混匀，加盖，于1000C油浴中加热30min，冰水浴冷却，冷至室温后加入2mL PDABA试剂。10min后以Og/mL为对照，在535 nm处测定吸光度。做3组重复，取平均值。以吸光度为纵坐标、对应的氨基葡萄糖含量为横坐标绘图。4.3. 1. 3. 3 试样溶液的制备称取30mg试样置于带四氟酸3mL，充分混匀后在管子复，冷却到室温后打开螺旋辞辛解，并转移到50m 水定容。制对照，在5354.3. 1.4计试样中式中:K C 3 50 7 100 1000-毫克换算4.3. 1.5 允许差两次平行测定结果相对差，4.3.2 离子色谱法(仲裁分析)后用移液管加入6mol/ L盐热3h。每个试样3个重箱中挥发至干。加1水将得到的罔体g/mL为(1) 将氨基寡糖素母药在酸性条件下水解为霆雪嘲嘲嗯-防军氧化铀溶液为流动相，使用脉冲安培检测器和高效阴离子交换色谱柱，对水解产物进行分离和测定，利用外标法进行定量。4.3.2. 1 试剂和溶液a) 氢氧化纳溶液质量分数为50%:优级纯;b) 无水乙酸饷:优级纯;c) 水:符合GB/T6682中一级水的规定，即电导率(250C)0.01 mS/m; d) 氢氧化纳榕液(8mol/U; e) 盐酸梅液(8mol/U; ) 100 mmol/ L NaOH+ 100 mmol/L CH3COONa榕液:在2L塑料试剂瓶中加入约1900mL经4 NY /T 2889. 1-2016 过0.4m尼龙滤膜过滤的水，加人无水乙酸纳16.4g，再移入氢氧化铀榕液(质量分数为50%)10. 5 mL至水面以下，然后加入水至2L刻度，通氮气保护后摇匀备用。g) D-氨基葡萄糖盐酸盐标准品:已知质量分数，二三99.0%。4. 3. 2. 2 仪器a) 离子色谱仪:包含在线脱气装置的四元梯度泵、柱温箱、脉冲安培检测器(Au工作电极，pH/Ag/ AgCl复合参比电极，糖标准囚电位)、色谱工作站;b) 分析柱:CarboPacPA100 250 mmX 4 mm(i. d.)，保护柱:CarboPacPA100 50 mmX 4 mm c) 带聚四氟乙烯衬垫4. 3. 2. 3 离子色谱操作a) 流动相:回b) 流速:1.实验_舶圆圆噩噩-圆圆网庇矗汇二氧化碳。上述-数:;li，四坠舌辑在目斟月获得最佳效果。典型的说明:1一一氨基葡萄糖。图34.3.2.4 测定步骤4.3. 2. 4. 1 标样溶液的配制称取D-氨基葡萄糖盐酸盐标样约15mg(精确至O.000 2 g)置于50mL容量瓶中，用水稀释至刻度，超声振荡5min，冷却至室温，摇匀。用移液管移取上述溶液5.0mL于100mL容盐瓶中，用水稀释至刻度，摇匀。4.3. 2. 4. 2 试样溶液的配制称取氨基寡糖素母药约15mg(精确至0.0002g)置于10mL带聚四氟乙烯衬垫螺旋盖的厚壁耐压管中，加入5.0mL 8. 0 mol/L盐酸，充分混匀后充入高纯度氮气并密封，980C油浴下搅拌8h。冷却至NY/ T 2889. 1-2016 室温，打开螺旋盖，缓慢加入8.0mol/L的氢氧化铀榕液，调节水解液的pH约至7.0，再将水解液全部转移到50mL容量瓶中，用水稀释至刻度，超声振荡5min，冷却至室温，摇匀。用移液管移取上述榕液5.0mL于100mL容量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀。4.3. 2. 4. 3 测定在上述操作条件下，待仪器基线稳定后，连续注人数针标样溶液.计算各针相对响应值，待相邻两针的相对响应值变化小于1.5%，按照标样洛液、试样榕液、试样济液、标样榕液的顺序进行测定。4. 3. 2. 5 计算将测得的两针试样溶液以及试样前后两针标样济液中氨基葡萄糖峰面积分别进行平均。试样中以氨基葡萄糖计的氨基寡糖素质量分数按式(2)计算:式中:A2 X m X 179. 17 . (2) l=Al ; X 2is: 63 XXK l 一一试样中氨基寡糖素质量分数(以氨基葡萄糖计)，单位为百分率c%); A2 试样溶液中，氨基葡萄糖峰面积的平均值;m 一一氨基葡萄糖盐酸盐标样的质量，单位为克(g); 一一氨基葡萄糖盐酸盐标样的质量分数，单位为百分率(%); A1 一一标样溶液中，氨基葡萄糖峰面积的平均值;m z 试样的质量，单位为克(g);179. 17 氨基葡萄糖摩尔质量，单位为克每摩尔(g/mol); 215. 63一-0-氨基葡萄糖盐酸盐摩尔质量，单位为克每摩尔(g/mo) ; K 一一校正系数，校正氨基寡糖素在降解为氨基葡萄糖过程中的损失，K=1.7。4.3. 2. 6 允许差氨基寡糖素质量分数两次平行测定结果之差应不大于5%.取其算术平均值作为测定结果。4. 4 氨基葡萄糖质量分数的测定4.4.1 方法提要样品用水榕解，以氢氧化饷榕液为流动相，使用脉冲安培检测器和高效阴离子交换色谱柱，对试样中的氨基葡萄糖进行离子色谱分离和测定。4. 4. 2 试剂和溶液a) 氢氧化铀榕液(质量分数为50%):优级纯;b) 水:符合GB/T 6682-2008中一级水的规定，即电导率(250C)O. 01 mS/ mj c) 200 mmol/ L NaOH榕液:在2L塑料试剂瓶中加入1900mL经过O.4m尼龙滤膜过滤的一级水，再移入氢氧化铀溶液(质量分数为50%)20.9mL至水面以下，然后加入一级水至2L刻度，通氮气保护后摇匀备用。d) 0-盐酸氨基葡萄糖标准，品，已知质量分数，二三99.0%。4. 4. 3 仪器a) 离子色谱:离子色谱仪，包含在线脱气装置的四元梯度泵、柱温箱、脉冲安培检测器(Au工作电极，pH/Ag/ AgCl复合参比电极，糖标准四电位)、色谱工作站;b) 分析柱:Carbopac PA100 250 mm X 4 mm (i. d. )，保护柱CarbopacPA100 50 mm X 4 mm (i. d. ) 。4. 4. 4 色谱条件a) 流动相:11(200mmol/L NaOH: H2Q)=10: 90; b) 流速:0.4mL/ min; 6 NY j T 2889. 1-2016 c) 进样方式:手动进样;d) 进样体积:25L;e) 柱温:30.C ; f) 保留时间:氨基葡萄糖约16.4min。实验中各淋洗液上方均施加0.4MPa的氮气进行保护，防止淋洗液吸收空气中的二氧化碳。上述操作参数是典型的，可根据不同仪器特点，对给定的操作参数作适当调整，以期获得最佳效果。典型的氨基寡糖素母药溶液的离子色谱罔见图4。说明:1一一氨基葡萄桥。图4氢基寡糖素母药溶液的离子色谱图4. 4. 5 测定步骤4.4.5. 1 标样溶液的配制称取D-氨基葡萄糖盐酸盐标样约30mg(精确至0.0002g)置于100mL容量瓶中，用水稀释至刻度，超声振荡5min，冷却至室温，摇匀。用移液管移取上述溶液1.0 mL于100mL容量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀。4. 4. 5. 2 试样溶液的配制称取氨基寡糖素母药约100mg(精确至0.0002g)置于100mL容量瓶中，用水稀释至刻度，超声振荡5min，冷却至室温，摇匀。4. 4. 5. 3 测定在上述操作条件下，待仪器基线稳定后，连续注人数针标样榕液，计算各针相对响应值，待相邻两针的相对响应值变化小于1.5%，按照标样榕液、试样溶液、试样溶液、标样溶液的顺序进行测定。4. 4. 5. 4 计算将测得的两针试样溶液以及试样前后两针标样溶液中氨基葡萄糖峰面积分别进行平均。试样中氨基葡萄糖质量分数按式(3)进行计算。A2 X m X 179. 17 2=Al m2215.63100(3) 式中:2 试样中氨基葡萄糖质量分数，单位为百分率(%); 100一一标样稀释倍数。4. 4. 6 允许差两次平行测定结果的相对偏差应不大于10%，取其算术平均值作为测定结果。4. 5 灰分按照GB5009.4的规定进行测定。4. 6 水分按照GB5009.3的规定进行测定。7 NYj T 2889. 1-2016 4.7 pH的测定按照GBjT1601的规定进行测定。4. 8 水不溶物的测定按照GBjT 28136-2011中3.3的方法测定。5 产品检验与验收应符合GBjT1604的规定。极限值的处理应按照GBjT8170-2008中4.3. 3的规定进行。6 标志、标签、包装、贮运6. 1 标志、标签氨基寡糖素母药的标6. 2 包装包装应符合GB6. 3 贮运贮运时严防日害物质混装、1昆运6. 4 安全在使用说6. 5 验收期验收期为要求。8 有毒有合标准