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生化药物生产项目报告书

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姓名: 朱 鹏 飞
学号: 040941
班级: 生物技术1211
生化药物生产
项目报告书

目 录
项目一: 核酸的生产
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2. 实验方案制定
3. PPT展示
4. 实验报告
5. 实验过程与结果图片展示
项目二: SOD的生产
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项目三: 卵磷脂的生产
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项目四: 香菇多糖的生产
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1.资料查找
1.1核酸相关知识
1.1.1核酸简介
由许多核苷酸聚合成的生物大分子化合物, 为生命的最基本物质之一。核酸广泛存在于所有动物、 植物细胞、 微生物内、 生物体内核酸常与蛋白质结合形成核蛋白。不同的核酸, 其化学组成、 核苷酸排列顺序等不同。在一定理化因素作用下, 核酸双螺旋等空间结构中碱基之间的氢键断裂, 变成单链的现象称为变性。引起核酸变性的常见理化因素有加热、 酸、 碱、 尿素和甲酰胺等。变性DNA在适当条件下, 可使两条分开的单链重新形成双螺旋DNA的过程称为复性
1.1.2种类
核酸同蛋白质一样, 也是生物大分子。核酸的相对分子质量很大, 一般是几十万至几百万。核酸水解后得到许多核苷酸, 实验证明, 核苷酸是组成核酸的基本单位, 机组成核酸分子的单体。一个核苷酸分子是由一分子含氮的碱基( 称碱基) 、 一分子五碳糖( 即五碳糖) 和一分子磷酸组成的。根据五碳糖的不同能够将核苷酸分为脱氧核糖核苷酸( DNA) 和核糖核苷酸( RNA) 。
DNA存在多级结构
l DNA的一级结构即由核苷酸聚合而成的生物大分子。
l DNA二级结构即双螺旋结构( double helix structure) 。
l DNA三级结构是指DNA链进一步扭曲盘旋形成超螺旋结构。
l DNA的四级结构——DNA与蛋白质形成复合物

1.1.3作用
核酸在蛋白质的复制和合成中起着储存和传递遗传信息的作用。核酸不但是基本的遗传物质, 而且在蛋白质的生物合成上也占重要位置, 因而在生长、 遗传、 变异等一系列重大生命现象中起决定性的作用。
DNA是储存、 复制和传递遗传信息的主要物质基础, RNA在蛋白质合成过程中起着重要作用, 其中转运核糖核酸, 简称tRNA, 起着携带和转移活化氨基酸的作用; 信使核糖核酸, 简称mRNA, 是合成蛋白质的模板; 核糖体的核糖核酸, 简称rRNA, 是细胞合成蛋白质的主要场所。
A.积极作用
核酸在实践应用方面有极重要的作用, 现已发现近 种遗传性疾病都和DNA结构有关。如人类镰刀形红血细胞贫血症是由于患者的血红蛋白分子中一个氨基酸的遗传密码发生了改变, 白化病患者则是DNA分子上缺乏产生促黑色素生成的酪氨酸酶的基因所致。肿瘤的发生、 病毒的感染、 射线对机体的作用等都与核酸有关。70年代以来兴起的遗传工程, 使人们可用人工方法改组DNA, 从而有可能创造出新型的生物品种。如应用遗传工程方法已能使大肠杆菌产生胰岛素、 干扰素等珍贵的生化药物。
核酸氧化分解后变成了磷酸和碱基的嘌呤和嘧啶, 当前还没有发现嘧啶有何害处, 但嘌呤是导致人类尿酸增高和痛风的主要原因。
B.消极作用
核酸氧化分解---生成嘌呤---嘌呤在肝脏进一步氧化成为( 2, 6, 8--三氧嘌呤) 又称为尿酸, 尿酸盐沉积到关节腔等组织引起痛风发作。
因此, 核酸不是越多越好, 同时, 这也说明了为什么中老年易患痛风, 因为年纪来了, 大量的细胞死亡, 而细胞内有大量的核酸, 生成嘌呤, 再生成尿酸, 从而导致痛风发作。防治好痛风就是要防止核酸被氧化。
1.1.4核酸的组成
核酸同蛋白质一样, 也是生物大分子。核酸的相对分子质量很大, 一般是几十万至几百万。核酸由C、 H、 O、 N、 P, 5种元素组成。核苷酸是组成核酸的基本单位, 是组成核酸分子的单体, 核酸是核苷酸经过3’, 5’－磷酸二酯键连接的。单个核苷酸是由含氮有机碱( 称碱基) 、 戊糖( 即五碳糖) 和磷酸三部分构成的。
碱基: 构成核苷酸的碱基分为嘌呤和嘧啶二类。嘌呤主要指腺嘌呤( A) 和鸟嘌呤( G) , DNA和RNA中均含有这二种碱基。嘧啶主要指胞嘧啶( C) 胸腺嘧啶( T) 和尿嘧啶( U) , 胞嘧啶( C) 为DNA和RNA共有, 而胸腺嘧啶( T) 只存在于DNA中, 尿嘧啶( U) 则只存在于RNA中。

1.1.5 DNA与RNA的区别

核酸
DNA
RNA
名称
脱氧核糖核酸
核糖核酸
结构
规则的双螺旋结构
一般呈单链结构
基本单位
脱氧核糖核苷酸
核糖核苷酸
五碳糖
脱氧核糖
核糖
含
氮
碱
基
A( 腺嘌呤)
A( 腺嘌呤)
G( 鸟嘌呤)
G( 鸟嘌呤)
C( 胞嘧啶)
C( 胞嘧啶)
T( 胸腺嘧啶)
U( 尿嘧啶)
分
布
主要存在于细胞核, 少量存在于线粒体和叶绿体
主要存在于细胞质

功
能
绝大多数生物的遗传物质, 携带遗传信息, 在生物体的遗传、 变异和蛋白质的生物合成中具有极其重要的作用
作为遗传物质: 只在RNA病毒中; 不作为遗传物质: 在DNA控制蛋白质合成过程中起作用。mRNA是蛋白质是合成的直接模板、 tRNA能携带特定氨基酸、 rRNA是核糖体的组成成分; 催化作用: 酶的一种

1.2核酸的制备
核酸几乎存在所有生物的细胞中, 因此制备的原料多种多样, 采用的生物材料不同, 制备的方法也会有所不同, 但基本原理都是一样的。
首先破碎细胞, 释放细胞内容物, 即释放出核酸, 常见的破碎细胞的方法有组织粉碎机、 研钵、 超声波、 酶处理、 冻融法; 然后除杂, 应该清除的杂质主要包括三部分
( 1) 非核酸的大分子污染物: 蛋白质、 多糖及脂类物质等
( 2) 非需要的核酸分子: 分离某一特定的核酸分子时, 其它的核酸分子皆为杂质;
( 3) 加入的有机溶剂和某些金属离子
最后分理出核酸, 当然分离出核酸后, 还能够进一步纯化。沉淀是分离核酸的最常见的方法
常见的盐类有醋酸钠、 醋酸钾、 醋酸铵、 氯化钠、 氯化钾及氯化镁; 常见的有机溶剂则为乙醇、 异丙醇和聚乙二醇, 我们一般采用乙醇沉淀核酸。核酸沉淀常常含有少量共沉淀的盐, 需用70%～75%的乙醇洗涤去除
1.3核酸的检测
1.3.1 定性检测
RNA和DNA的显色
D－核糖核酸＋浓盐酸＋地衣酚———反应显绿色
D－2－脱氧核糖核酸＋酸＋二苯胺———反应显蓝紫色
1.3.2 DNA的定量和纯度测定
常见的测定方法有:
紫外分光光度法( 此法要求核酸纯度很高, 1 个吸光度值相当于50μg ／ mL 双螺旋DNA; 除了定量测定以外还可进行核酸纯度的检测, A260 ／A280比值, 纯的DNA 为1．8, RNA 为2．0, 样品中含有蛋白质和苯酚时, A26／A280比值降低。)
定糖法( DNA 糖部分为脱氧核糖, RNA 糖部分为核糖, 分别能够进行二苯胺显色法和地衣酚显色法) ;
定磷法( 测定核酸的磷酸部分) 。
这里着重二苯胺显色紫外分光光度法
( 1) 原理
DNA 在酸性条件下其嘌呤碱与脱氧核糖间的糖苷键断裂, 生成嘌呤碱、 脱氧核糖和脱氧嘧啶核苷酸, 而2－脱氧核糖在酸性环境中加热脱水生成ω－羟基－γ－酮基戊糖, 与二苯胺试剂反应生成蓝色物质, 在595nm波长处有最大吸收。DNA 在40～400μg 范围内, 光吸收与DNA 的浓度成正比。在反应液中加入少量乙醛, 能够提高反应灵敏度。
( 2) DNA 吸光度的测定
①A260测定:
以H2O 作为空白, 取上清测A260值后确定稀释倍数, 使A260值在2．0 左右( DNA此时的浓度约为100μg ／mL。( 由于二苯胺法的测定范围是40~400μg ／mL DNA, 因此DNA 浓度如果太小会影响测定结果) 。
②A280测定:
A260 ／A280比值计算。纯的DNA 为1．8, RNA为2．0。如果样品中混有RNA, 则比值大于1．8; 如果样品中
混有蛋白质, 则比值小于1．8。所用的DNA 溶液为前面提取后溶解的DNA 样品。
( 3) DNA 标准曲线的制作和样品测定
加完各试剂后, 充分混匀。于60℃水浴中保温1h, 冷却后于595nm 波长处以0 管为空白调零, 测定各管光密度( OD595) 。以DNA 的含量为横坐标, 光密度( 吸收值) 为纵坐标, 绘制标准曲线。( 注: 待测溶液中的DNA 含量应调整至标准曲线的可读范围内。样品1 和样品2 为不同稀释倍数的DNA 溶液。)
( 4) DNA 含量计算
以样品的光密度, 根据标准曲线计算出相对应DNA 含量, 并同紫外法测定的值进行比较。( 注: 二苯胺试剂具有腐蚀性, 且二苯胺反应产生的蓝色不易褪色, 操作中应防止洒出; 比色时, 比色杯外面一定要擦干净。)
2.方案制定
2.1核酸的制备
( 1) 实验原理
在溶解细胞, 核蛋白释放后, 根据DNA不溶于0.14mol/L NaCl溶液而RNA可溶的特性将DNA核蛋白与RNA核蛋白分离, 得到粗品。粗品中主要成分为DNA和蛋白质, 用氯仿、 异戊醇进行抽提, 可除去其中的蛋白质。再加入一定量的异丙醇或乙醇, 较长的基因组DNA分子将形成纤维状絮团漂浮其中, 而质粒或细胞器中的小分子DNA则只能形成颗粒状沉淀物附着在容器壁或底部, 用玻棒挑出纤维状絮团即可达到比较满意的分离效果, 得到纯度较高的基因组DNA。上清液中的RNA同样也能够采用相同的方法提取, 先用氯仿、 异戊醇除去其中的蛋白质, 再加入异戊醇或乙醇离心得到RNA沉淀。
( 2) 实验原料、 试剂、 器材与仪器
实验原料: 新鲜猪肝
实验试剂: 95%乙醇、 氯仿、 异戊醇, 固体氯化钠等
器材与仪器: 可见光光度计、 紫外分光光度计、 冷冻离心机、 水浴锅、 烧杯、 量筒、 玻璃棒、 三角瓶、 离心管等。
( 3) 操作步骤
① 取新鲜猪肝少许, 剪碎后洗去血水, 加入2倍组织重的0.14mol/LNaCl-0.5mol/L柠檬酸混合液, 用组织粉碎机粉碎, 制得匀浆
② 取10ml匀浆装入离心管, 平衡后于3500r/min离心15min, 保留上层RNA提取液留着备用;
③ 在沉淀加入1mol/LNaCl, 再次于3500r/min离心10min;
④ 取上清液, 加入氯仿和少许异戊醇3500r/min离心10min, 得到蛋白质沉淀, 除去蛋白质
⑤ 取上清液加1到2倍体积的95%乙醇搅拌, 得到DNA沉淀
⑥ 在保留的上层RNA提取液中, 加入氯仿和少量异戊醇, 充分振荡, 然后3500r/min离心10min,得到蛋白质沉淀
⑦ 取上清液, 加入1到2倍体积95%乙醇, 离心, 可得到RNA沉淀
2.2核酸的检测
( 1) RNA的鉴定, 地衣酚显色法
RNA与地衣酚会发生显色反应, 溶液变为绿色, 且颜色越深, 说明RNA含量越多。
将RNA 沉淀用2mL 蒸馏水溶解, 然后转移至2 只试管中, 每只1mL。其中一只试管中加入3mL 地衣酚试剂, 然后置沸水中20min, 观察颜色反应; 另外一只试管中加入2mL 二苯胺试剂, 60℃条件下反应1h, 观察颜色反应。
( 2) DNA的鉴定, 二苯胺显色法
DNA会与二苯酚发生显色反应, 溶液会变成蓝色, 且颜色越深说明DNA含量越多。
在DNA沉淀中加入1mol/LNaCl溶液或者蒸馏水溶解沉淀。各取上述1mL DNA 溶液于两只试管中, 其中一只里面加入3mL 地衣酚试剂, 然后置沸水中20min, 观察颜色反应; 另外一只试管中加入2mL 二苯胺试剂, 60℃条件下反应1h, 观察颜色反应。
3.PPT展示

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1.1 SOD的基础知识
1.1.1简介
超氧化物歧化酶, 别名肝蛋白、 奥谷蛋白, 简称: SOD。SOD是一种源于生命体的活性物质, 能消除生物体在新陈代谢过程中产生的有害物质。对人体不断地补充SOD具有抗衰老的特殊效果。1938年Marn等人首次从牛红血球中分离得到超氧化物歧化酶。1969年McCord等重新发现这种蛋白, 而且发现了它们的生物活性, 弄清了它催化过氧阴离子发生歧化反应的性质, 因此正式将其命名为超氧化物歧化酶。SOD被视为生命科技中最具神奇魔力的酶、 人体内的垃圾清道夫。SOD是氧自由基的自然天敌, 是机体内氧自由基的头号杀手, 是生命健康之本。它在生物界的分布极广,几乎从人到细胞,从动物到植物,都有它的存在。
1.1.2对人体的作用
炎症过程中产生的过氧化物游离基可造成机体的损害, SOD能促使过氧化物游离基转化成过氧化氢和氧具有而有强大的抗炎作用。O2具有细胞毒性, 可使脂质过氧化, 损伤细胞膜, 引起炎症, 肿瘤和自身免疫性疾病, 并可能促使机体衰老, SOD为自由基清除剂, 它广泛存在于生物体的各种组织中, 能清除自由基O2。
( 1) 抑制心脑血管疾病
机体的衰老与体内氧自由基的产生与积累密切相关, SOD 可清除人体内过多的有害的氧自由, 是对健康的有益的功效成分。具有调节血脂的保健作用, 可预防动脉粥样硬化, 预防高血脂引起的心脑血管疾病。降低脂质过氧化物的含量。
( 2) 抗衰老
年龄的增长和某些体外因素会造成机体和皮肤组织自由基产生超过机体正常清除自由基的的能力, 从而使皮肤组织造成伤害, 导致衰老。由于SOD能够清除自由基, 因而能够延缓衰老。人之因此会衰老, 老化迹象一点一滴出观, 如色素沉淀、 体力衰退、 是因为体内产生氧化作用, 所谓”氧化作用”就类似于生锈, 抗氧化剂的补充有助于降低氧化的速度, 减慢衰老的脚步。
( 3) 防治自身免疫性疾病
SOD对各类自身免疫性疾病都有一定的疗效。如红斑狼疮、 硬皮病、 皮肌炎等。对于类风湿关节炎患者应在急性期病变未形成前使用, 疗效较好。
( 4) 肺气肿
肺气肿患者亦可使用 SOD , 但应在病变初期肺弹性纤维尚未受到损害时使用, 疗效较好。
( 5) 辐射病及辐射防护
该品可用来治疗因放疗引起的膀胱炎、 皮肌炎、 红斑狼疮及白细胞减少等疾病, 对有可能受到电离辐射的人员, 也可注射 SOD 作为预防措施。
( 6) 老年性白内障
对这类疾病应在进入老年期前即开始经常服用抗氧化剂, 或者说经常注射SOD。一旦形成白内障, 则应该摘除, 因为此时使用SOD无效。
( 7) 预防慢性病
自由基是科学家最近才发现导致各种慢性病与老化的罪魁祸首, 故说它是”万病之源”, 是人体健康的大敌, 自由基对身体的伤害是日积月累的, 特别是糖尿病与心血管方面的疾病, 林天送博士说: ”照顾好您的心血管, 就能够活到九十岁。”养成多多摄取抗氧化物的好习惯, 保证能够让您远离慢性疾病的威胁。
( 8) 抗疲劳
过多的自由基在体内残存, 就犹如毒素蓄积在体内一样, 会让人: 容易疲劳、 厌倦、 注意力不集中、 常常昏昏沉沉、 打哈欠。SOD对上班族熬夜加班、 学生应付考试所产生的疲劳, 在提振精神及集中注意力方面成效显著, 有助于工作绩效的提升, 及考试成绩的进步。
( 9) 消除副作用, 避免二次伤害
手术会引起大量自由基, 而接受化疗的癌症病患体内的抗氧化能力也会大大地降低, 低到某个程度, 自由基就会损害细胞、 黏膜、 五脏六腑、 脑、 中枢神经等．因此手术前后, 癌症患者口服抗氧化剂来迅速恢复体力, 加速伤口复原。
( 10) 化解女性的危机
妇女的氧化危机有三:
A.皮肤出现斑点皱纹: 因为氧自由基无法有效被清除, 破坏胶原蛋白、 弹力纤维蛋白, 使皮肤保湿及维持弹性的功能丧失, 皱纹横生, 加速黑色素的沉淀;
B.血液循环不良、 经期不顺、 黑眼圈、 肤色灰暗无光泽;
C.更年期障碍: 因为动情激素的缺乏、 体内的抗氧化能力降低, 常有以下症状出现: 阵发性朝热、 失眠、 夜间流汗、 头痛、 情绪不稳、 心神不宁。
1.1.3在生活中的应用:
SOD是生物体内氧自由基的天然清除剂, 具有广泛的医用价值, 可作为药品、 食品及日化产品的添加剂。
l SOD 被批准用于临床使用, 它对一些由于年龄、 疾病或伤害造成的组织硬化以及纤维化显示出强大的再生修复能力。
l SOD已被成功地应用于放疗后的辅助治疗、 控制心脏病人的进展、 用于治疗严重的风湿性关节炎、 骨关节病。在丹麦, 有人经过注射SOD 治疗风湿性关节炎。
l 超氧化物歧化酶广泛应用于化妆品添加剂方面, 如利用超氧化物歧化酶制造的SOD面膜、 SOD 蜜、 SOD蛇粉等化妆品, 当前已有不下数百种产品。。
l SOD 被作为一种补充食物, 经过动物研究发现, 口服SOD 在它发挥作用之前就已被消化系统破坏了。人们想尽各种可行的办法使SOD在人体内维持较高的水平, 即在消耗食物的同时, 提供合适的营养供肝脏合成SOD, 或者直接将外源SOD 包裹在食物蛋白质中, 经消化系统而不被消化, 进入身体其它位置。
1.2 SOD的制备
SOD在生物体内分布广泛, 能够提取的原材料有很多, 根据材料的不同, 提取方法也会不同, 这里我们着重介绍从大蒜中提取SOD的方法.
( 1) 磷酸缓冲液提取法
大蒜SOD 极性较大, 易溶于水, 根据”相似相溶”原理, 可用水来浸取大蒜SOD。但磷酸缓冲液可提高浸取效能增加制品的稳定性, 减少杂质, 因此实际操作中常采用pH 7.8 的磷酸缓冲液代替水来浸取大蒜SOD, 得到粗提取液。但该方法的缺点是浸出范围广, 选择性相对差, 容易浸出大量的无效成分, 且会引起一些有效成分的水解。
( 2) 超声波破碎法
超声波破碎法是一种辅助浸取技术。超声波的”空化作用”产生极大的压力造成被粉碎物细胞壁或整个细胞的破碎, 而且整个破碎过程在瞬间完成。超声波产生的振动作用增加了溶剂的湍流强度及相接触面积, 加快了细胞内物质的释放、 扩散及溶解, 从而强化了传质, 有利于细胞内有效成分的提取
( 3) 热变性法
热变性法是依据SOD 的热稳定性原理设计的。SOD 的热稳定性高, 当温度低于60 ℃时, 短时间的热处理不会使酶活力有明显的变化, 而一般的杂蛋白却在温度高于55 ℃时就易变性沉淀, 因此, 对大蒜粗提液进行短时间的热处理能够达到去除杂蛋白的目的。
( 4) 有机溶剂分级沉淀法
① 丙酮沉淀法
利用向蛋白质溶液中加入弱极性的有机溶剂, 改变溶液的介电常数, 使不同种类蛋白质的溶解度产生不同程度降低的原理可进行蛋白质的纯化。在粗酶液中逐量加入丙酮, 可使SOD及其它杂蛋白的溶解度发生变化, 依次从溶液中沉淀出来。
② 氯仿- 乙醇沉淀法
氯仿- 乙醇混合液可作为萃取剂将SOD 溶解于其中, 并将杂蛋白沉淀出来。另外, Cu/Zn- SOD 对氯仿- 乙醇的作用不敏感, 处理12 h 后, 活性没有明显的变化, 因此用该法粗分离大蒜SOD 是可行的。
( 5) 硫酸铵分级盐析法
盐析法是利用在高浓度的电解质溶液内, 蛋白质分子表面的水化层被破坏, 使蛋白质分子中的憎水区域裸露而导致蛋白质分子聚集沉淀的原理进行分离的。硫酸铵因价廉、 溶解度大, 且能使蛋白质的性质保持稳定而成为最常见的盐析剂。
( 6) 透析
透析是利用蛋白质分子不能经过半透膜, 而使蛋白质和其它小分子物质分开的方法。透析一般不作为纯化酶的一种单元操作, 但经过透析可除去酶液中的盐类、 有机溶剂、 低分子量抑制剂等, 因此它在纯化过程中极为常见。透析膜的截留极限一般在分子量5 000 左右, 而Cu/Zn- SOD的分子量远高于此, 因此适合于透析法。
( 7) 膜分离技术
膜分离技术采用了能选择地透过一种物质, 而阻碍另一种物质透过的具有特定性质的半透膜, 它的实质是利用物质经过膜的传递速度不同而使其得以分离。
1.3 SOD的检测
我们经过测定SOD的酶活性, 检测SOD。氧化物歧化酶( SOD) 的催化底物是O2 , 一般多以一定时间内产物生成量或底物的消耗量作为酶活性单位。由于O2 自身很不稳定, 且不易制备, 测定SOD的方法除少数采用直接法外, 一般多为间接法。
常见的有:
⑴ 邻苯三酚自氧化法
即改良Marklund法。原理是基于经典的分光光度法, 在碱性条件下, 邻苯三酚自氧化成红桔酚, 用紫外-可见光谱跟踪波长为325nm、 420nm或650nm( 经典为420nm) , 同时产生O2 , SOD催化O2 发生歧化反应从而抑制邻苯三酚的自氧化, 样品对邻苯三酚自氧化速率的抑制率, 可反映样品中的SOD含量。本法具有特异性强, 所需样本量少( 仅50μl) , 操作快速简单, 重复性好, 灵敏度高, 试剂简单等优点。
⑵ 细胞色素C还原法( McCord法)
原理是黄嘌呤-黄嘌呤氧化酶体系中产生的O2 使一定量的氧化型细胞色素C还原为还原型细胞色素C, 后者在550nm有最大光吸收。在SOD存在时, 由于一部分O2 被SOD催化而歧化, O2 还原细胞色素C的反应速度则相应减少, 即其反应受到抑制。将抑制反应的百分数与SOD浓度作图可得到抑制曲线, 由此计算样品中SOD活性。本法是间接法中的经典方法, 但本法灵敏度较低。
(3)化学发光法原理
黄嘌呤氧化酶在有氧条件下, 催化底物黄嘌呤或次黄嘌呤发生氧化反应生成尿酸, 同时产生O2。后者可与化学发光剂鲁米诺反应, 使其产生激发。SOD能清除O2 从而抑制鲁米诺的化学发光。本法可应用于SOD的微量测定, 不但灵敏度高, 简便易行, 而且特异性与准确性至少与细胞色素C还原法类似。
(4)电泳法
电泳染色定位法的基本原理是根据光化学法与NBT还原法。电泳则采取垂直板聚丙烯酰胺凝胶电泳。既可采用SOD活性正染色( 呈现棕色区带) 也可采取SOD活性负染色( 呈现无色透明区带) 。根据凝胶上电泳分离的SOD区带的着色深浅与面积大小, 对样品进行半定量分析, 也可制作校正曲线计算样品中的SOD含量。染色定位法常见于鉴定SOD, 很少为了定量, 主要原因是它不及化学法简便, 但鉴定SOD却较化学法为优。用电泳法可鉴定SOD是否掺有杂质蛋白, 有无同工酶, 且可半定量地确定SOD的活性大小。
2.方案制定
2.1 SOD的制备
( 1) 实验原理
SOD广泛存在于各种生物体内, 迄今为止人们已从各种动物脏器、 血液、 原生动物、 植物、 昆虫、 藻类、 细菌、 真菌等各种生物组织中成功分离得到了SOD。
我们这次利用大蒜制取SOD。大蒜蒜瓣和悬浮培养的大蒜细胞中含有丰富的SOD, 经过组织或细胞破碎后, 用pH7.8的磷酸缓冲液提取出来。再用氯仿-乙醇混合液去除杂蛋白, 再用盐析法和有机溶剂法两种方法分离出SOD沉淀。
( 2) 实验原料、 试剂、 器材与仪器
实验原料: 大蒜蒜瓣
实验试剂: 石英砂、 磷酸缓冲液( 0.05mol/L,pH7.8)、 氯仿-乙醇混合液、 固体硫酸铵、 连苯三酚、 K2HPO4-KH2PO4缓冲液
器材与仪器: 离心机、 紫外分光光度计、 研钵、 离心管、 玻璃棒、 托盘天平等
( 3) 操作步骤
整个过程在0-5℃条件下进行
① SOD酶的提取: 称取5克大蒜蒜瓣, 加入石英砂研磨破碎细胞后, 加入pH7.8、 0.05mol/L的磷酸缓冲液15ml, 继续研磨20min, 使SOD酶充分溶解到缓冲溶液中, 然后6000rpm冷冻离心15min, 弃沉淀, 取上清液。
② 去除杂蛋白: 上清液中加入0.25倍体积的氯仿-乙醇混合液搅拌15min, 6000rpm离心15min, 弃去沉淀, 得到的上清液即为粗酶液。
③ SOD的沉淀分离: 粗酶液在搅拌下缓慢加入固体硫酸铵至饱和浓度60％, 持续搅拌15min, 6000rpm离心15min, 得到SOD酶沉淀。
④ SOD的纯化: 将沉淀溶于pH7.8、 0.05mol/L的5ml缓冲液中, 然后6000rpm冷冻离心15min, 弃沉淀, 取上清液, 用凝胶Sephacryl S-200进行纯化, 然后超滤浓缩。
⑤ 将浓缩液冷冻干燥后即得成品
2.2 SOD的检验
( 1) 检验原理
连苯三酚在碱性条件下, 能迅速自氧化, 释放出O, 生成带色的中间产物。在自氧化过程的初始阶段, 黄色中间物的积累在滞后30~45s后就与时间成线性关系。在有SOD存在时由于它能催化O生成O2与H2O2,从而阻止了中间物的积累, 经过计算就能求出SOD的活力。
连苯二酚自氧化法测定酶活力, 酶活力按下式计算:

总活力( U) = 单位体积活力×原液总体积
比活力( U/mg) =单位体积酶液活力/单位体积
酶活力单位定义: 在25℃恒温条件下, 每毫升反应液中, 每分钟抑制邻苯酚自氧化率达50%的酶量定义为1个酶活力单位。
( 2) 检验所需溶液的配制
① pH8.3的0.05mol/L K2HPO4-KH2PO4缓冲液: 25℃下96.5ml的1mol/L K2HPO4与3.5ml 的1mol/L的KH2PO4混合后, 用水稀释至 ml
0.05mol/L连苯三酚溶液: 称取3.15g连苯三酚用0.01mol/L盐酸溶液溶解并定容至500ml
( 3) 检验步骤
( 即酶活力的测定)
① 测定连苯三酚的自氧化速率, 调节连苯三酚溶液用量, 将其自氧化率控制在0.070( ±0.002) D/min, 经试验测得连苯三酚溶液用量为6μl
② 样品活性的测定
在10ml试管中加入pH8.30的4.50ml的K2HPO4-KH2PO4缓冲液和一定体积的样液, 在25±0.5℃的恒温水浴中保温10min, 然后加入在25±0.5℃的恒温水浴中预热好的连苯三酚溶液6μl, 空白管用0.01mol/L的HCl代替, 迅速摇匀倒入1cm比色杯中, 以空白管为参比, 在325nm下, 每隔30s测一次吸光值, 连续记录3min,调节样液体积, 使样液中连苯三酚的氧化速度控制在0.035( ±0.002) D/min, 记录此时样液体积。

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1.1卵磷脂基础知识
1.1.1基本介绍
卵磷脂属于一种混合物, 是存在于动植物组织以及卵黄之中的一组黄褐色的油脂性物质, 卵磷脂是生物膜的重要组分,其构成成分包括磷酸、 胆碱、 脂肪酸、 甘油、 糖脂、 甘油三酸酯以及磷脂。卵磷脂被誉为与蛋白质、 维生素并列的”第三营养素”。
化学名称: 磷脂酰胆碱, 简称: PC , 卵磷脂按照其纯度的高低, 一般分为 PC50、 PC 60 、 PC70、 PC80、 PC 90、 PC95等产品形式。最高能够提纯到98%, 因为其纯度越高, 氧化性能越强, 越不易保存, 故提纯到98%的卵磷脂需要做氢化处理, 然后保存。未经过氢化处理的卵磷脂, 一般要求在充氮的密封容器中。
纯净的卵磷脂常温下为一种无色无味的白色固体, 由于制取或精制方法、 储存条件不同被氧化而呈现淡黄色至棕色。
磷脂最早是由Uauquelin于18 从人脑中发现, Golbley于1844年从蛋黄中分离出来, 并于1850年按照希腊文lekithos( 蛋黄) 命名为Lecithin( 卵磷脂) ,因此又称为蛋黄素, 并以希腊文命名为Lecithos( 卵磷脂) 。
1.1.2主要来源
蛋黄中含有丰富的卵磷脂, 牛奶、 动物的脑、 骨髓、 心脏、 肺脏、 肝脏、 肾脏以及大豆和酵母中都含有卵磷脂。其中又以属蛋黄、 大豆和动物肝脏的含量最高, 鸡蛋中的卵磷脂品质最高, 可是难以提取, 这使得其价格堪与黄金相媲美。
1.1.3功效
( 1) 人体营养需要
人体所需的外源性胆碱90%是由卵磷脂提供, 当膳食胆碱不足时, 体内尚存卵磷脂的内源资源即也可补充人体需要
( 2) 对血清脂质的调节作用
调节血清脂质水平意味着能降低胆固醇水平, 保护肝脏, 也能改进记忆力, 加强免疫力以及抗脂肪肝的活力。
( 3) 有助于胞囊纤维变性时对脂肪的吸收
胞囊纤维变性是一种外分泌腺失调, 一般都是因为体内脂质有限, 胰脂酶, 胆汁盐和碳酸氢钠存量不足引起。胞囊纤维变性严重影响脂肪的吸收, 摄入脂肪有30%-60%吸收不良, 因而会造成脂肪痢。溶血磷脂酰胆碱能使摄入脂肪移位, 将甘油一酯及脂肪酸在低共熔基质中相结合。在有碳酸氢钠离子及胆汁盐情况下, 变得容易吸收。
( 4) 健康心脏
证实卵磷脂对心脏健康有积极作用, 因为它能调节胆固醇在人体内的含量、 有效降低胆固醇、 高血脂及冠心病的发病率。
( 5) 有益大脑, 增强记忆力, 延缓衰老
脑神经细胞中卵磷脂的含量约占其质量的17%-20%。卵磷脂的充分供应保证充分的”胆碱”与人体内的”乙酰”合成为”乙酰胆碱”, ”乙酰胆碱”是大脑内的一种信息传导物质, 脑部的神经传导物质( 乙酰胆碱) 减少是引起老年痴呆的主要原因, 补充卵磷脂能提高脑细胞的活性化程度, 提高记忆与智力水平。长期补充卵磷脂能够减缓记忆力衰退的进程, 预防或推迟老年痴呆的发生。
(6)滋润皮肤
卵磷脂是人体每一个细胞不可缺少的物质, 如果缺乏, 就会降低皮肤细胞的再生能力。卵磷脂是一种天然的解毒剂, 它能分解体内过多的毒素, 并经肝脏和肾脏的处理排出体外, 正常人体内含有许多毒素, 特别是在肠道内, 当这些毒素含量过高时, 便会随着血液循环沉积在皮肤上, 从而形成色斑或青春痘。再加上卵磷脂良好的亲水性和亲油性, 缺乏会导致皮肤粗糙、 有皱纹。另外, 卵磷脂所含的肌醇还是毛发的主要营养物, 能抑制脱发, 使白发慢慢变黑。
(7)调剂心理
社会竞争日趋激烈, 人们长期处在紧张的环境和种种压力下, 常患有焦虑、 急躁、 易怒、 失眠、 耳鸣等症, 即植物神经紊乱, 一般被称为神经衰弱。经常补充卵磷脂, 可使大脑神经及时得到营养补充, 保持健康的工作状态, 利于消除疲劳, 激化脑细胞, 改进因神经紧张而引起的急躁、 易怒、 失眠等症。
另外, 吸烟的人应该多多的补充卵磷脂。
1.1.4应用
因为有这些生物学功能, 常有以下的应用
(1)保护肝脏
(2)健康心脏
(3)促进大脑发育, 增强记忆力, 预防老年痴呆症
(4) 血管的”清道夫”
(5)糖尿病患者的营养品( 卵磷脂不足会使胰脏机能下降, 无法分泌充分的胰岛素, 不能有效地将血液中的葡萄糖运送到细胞中, 这是导致糖尿病的基本原因之一。)
(6)有效地化解胆结石( 体内过多的胆固醇会发生沉淀, 从而形成胆结石, 胆结石90%是由胆固醇组成。)
(7) 胎、 婴儿神经发育的必须品( 人体脑细胞约有150亿个, 其中70%早在母体中形成。婴幼儿时期是大脑形成发育最关键时期, 卵磷脂能够促进大脑神经系统与脑容积的增长、 发育。为了促进胎儿脑细胞能健康发育, 孕妇补充分够的卵磷脂是很重要的。)
(8)消除青春痘、 雀斑并滋润皮肤
( 9) 卵磷脂能够促进肠胃血液循环及肠胃蠕动, 有助于预防及改进便秘
( 10) 良好的心理调和剂
因此它的适用人群是: 婴幼儿, 学生、 知识分子及中老年人, 长期饮酒、 营养过剩及脂肪肝患者, 、 糖尿病患者, 胆结石患者, 爱美的女士, 便秘人群。
当前市场上的卵磷脂多是从大豆中提取, 工业用卵磷脂的剂型主要有: 液体、 颗粒、 粉末三种, 液体浓度在70%左右, 颗粒及粉末可达95%以上。卵磷脂软胶囊是以液体卵磷脂为原料加入甘油或大豆油稀释后, 用明胶包裹而成, 有效成分含量低一般少于60%, 价格较低, 是大部分品牌卵磷脂采用的剂型。
1.2卵磷脂的制备
当前,国际上制备卵磷脂的方法主要有有机溶剂萃取法、 柱层析法、 半透膜分离法、 乙酰化法、 制备薄层色谱法、 高效液相色谱法、 超临界CO2萃取法。可是对于蛋黄卵磷脂来说,其提取纯化方法研究还比较有限,主要有以下几种:
( 1) 有机溶剂提取法
有机溶剂法最为常见,原理是蛋黄中各组分以及不同的磷脂组分在有机溶剂中的溶解度不同。溶剂提取法的关键在于找到一种好的溶剂或溶剂系统,对被提取的目标产物应具有良好的溶解性和选择性。其优点是分离效率高、 生产周期短、 易实现自动化;缺点是卵磷脂纯度不高,处理时间长,且存在有机溶剂残留的问题。蛋黄中的油脂、 中性脂肪以及游离脂肪酸可由丙酮脱除,不溶于丙酮的磷脂沉淀,再使用低碳醇、 正己烷、 乙醚等溶剂将溶于其中的卵磷脂与不溶于这些溶剂的其它磷脂分离开来。也可先浸提卵磷脂再脱油。但有国外的研究表明,先用丙酮对蛋黄进行