现代生物技术导论.docx

详述发酵过程中监测的各项参数？（PPT）
实验室从自然界中分离得到1株产蛋白酶的细菌菌株，试设计试验分离纯化该蛋白酶。（有，自己总结写话）（下面有个可供参考）
什么是植物组织培养，详述植物组织培养常见问题和对策。
答：在含有营养物质及植物生长物质的培养液中，培养离体植物组织（器官或细胞）并诱导使其长成完整植株的技术。器官或细胞，原生质体等，通过无菌操作，在人工控制条件下进行培养以获得再生的完整植株或生产具有经济价值的其他产品的技术。狭义是指组培指用植物各部分组织，如形成层。薄壁组织。叶肉组织。胚乳等进行培养获得再生植株，也指在培养过程中从各器官上产生愈伤组织的培养，愈伤组织再经过再分化形成再生植物。

问题级对策
1 污染问题及对策
　　1.1 污染原因分析
　　控制污染是组培过程中的首要技术。造成污染的原因很多，如外植体的种类、取材的季节、时间、预处理方法、消毒药剂的种类、浓度、消毒时间以及消毒方法、培养基和器皿灭菌、操作人员、工作环境的要求、超净工作台的工作质量等都与污染密切相关。一般来说，组培污染源分为3大类：材料带菌、接种污染、培养过程感染。
　　1.2 对策
　　选择合理的外植体种类、取材的季节、时间、初代接种选取大小适宜的外植体。在组培中应选取带菌较少或不带菌体的材料作为外植体。对母株预处理，改善植株栽培环境，对母株喷布杀菌剂或抗生素。改变灭菌方法，使用真空减压灭菌、多次消毒灭菌、混合消毒液、灼烧等。在培养基中加入其它抑菌剂。切分潜在的带菌材料时，要保证所用的接种工具已经过彻底的消毒；继代培养时确保污染的材料应给予丢弃。针对接种污染，要做到紫外灯接种室消毒，清洗超净工作台；接种工具、材料不要与酒精灯、超净工作台铁网面、台面接触；接种人员接种时用酒精棉擦手或用浓度为75 %的酒精喷洒双手，接种时应穿上无菌的白大衣，戴上帽子和口罩；无菌室要注重平时除湿和熏蒸消毒工作。培养过程中要定期对培养室进行消毒处理，及时清除污染材料，污染的材料及仪器必须经过药液消毒后方可使用。
2 褐化问题及控制措施
　　2.1 褐化概念及原因分析
　　褐化是指在植物组织培养过程中，外植体在诱导脱分化或再分化时，自身组织由其表面向培养基释放褐色物质，以致培养基逐渐变成褐色，外植体也随之进一步变褐而死亡的现象。褐化一般分为2种：由于细胞受胁迫或其它不利条件影响所造成的细胞死亡而形成的褐化现象；由于酚类物质被多酚氧化酶氧化所引起的褐化。影响褐化的因素一般与基因型、外植体情况、培养条件、培养基有关。如温度对褐化影响很大，高温能使 多酚氧化酶的活性提高，促进酚类氧化；而低温可以抑制酚类化合物的合成，降低多酚氧化酶活性，减少酚类氧化，从而减轻褐化。
2.2 控制措施
　　多选择幼龄植株取材，使外植体处于旺盛的生长状态，可大大减轻褐变。在植株的一定部位取材，使材料中酚类物质含量较低，也有助于减少褐化。对母株进行遮光处理，不仅利于初代培养物的萌发，还可减轻褐化程度。利用硫代硫酸钠、植酸、抗坏血酸等抗氧化剂、活性炭等吸附剂能够阻止多酚氧化物对酚类物质的氧化作用，可减少或减轻褐变。实验证明，琼脂量的减少、较低的pH值也有利于减少褐变。选取适宜的培养条件如适度的低温、初培暗光或弱光培养可抑制酚类的氧化，采用45℃以上的短时间高温处理也能使多酚氧化酶失去活性，达到抗褐变的目的。
3 玻璃化现象及解决途径
　　3.1 “玻璃化现象”内涵及发生原因
　　玻璃化现象是指在培养过程中材料呈半透明状，组织结构发育畸形的现象。玻璃化的苗因组织畸形，分化能力降低，移栽后也很难成活，所以不宜用作继代和移栽的材料。它已成为组培工作的一大难题，目前其根本原因尚无定论。根据吴若菁等[1]对香石竹的组培研究得知，影响组培苗玻璃化的原因主要与激素的种类、浓度、琼脂的浓度、外植体的取材部位、不适宜的培养条件有关。
　 3.2 解决途径
　　可从以下几个方面降低或防止玻璃化现象的发生。①利用固体培养，调节培养基的 pH值，提高琼脂浓度，降低培养基的衬质势，造成细胞吸水阻遏，可降低玻璃化；②适当提高培养基中蔗糖含量或加入渗透剂，提高培养基的碳氮比，降低 NH4+浓度，降低培养基中的渗透势，减少培养基中植物材料可获得的水分；③降低培养器内部环境的相对湿度，保持适宜温度，改善氧气供应状况，减少玻璃化苗的出现；④适当降低培养基中细胞分裂素和赤霉素的浓度；⑤利用高于40℃的温度对外植体热击处理可消除玻璃化；⑥增加自然光照，实验证明，玻璃苗放于自然光下几天后，茎、叶变红，玻璃化现象可逐渐消失，这可能与自然光中的紫外线有关；⑦改善培养容器的通风换气条件，如用通气好的封口膜封口。
4 其它问题及相关对策
　　如黄化现象和变异率高的问题。培养基中 Fe含量不足、培养环境通气不良、培养温度不适、激素配比不当、糖用量不足、光照不足等都会造成黄化现象。只有找出问题的根源对症下药才能从根本上解决问题。关于变异率高的问题，不仅不利于保存资源和培育优良的品种，还会严重影响工业化生产的组培苗的质量，必须从原始材料、培养基配方、增殖代数、愈伤组织等方面严控变异率的发生。

什么是基因工程，详述基因工程中如何筛选转化子的策略。
答：基因工程（genetic engineering）又称基因拼接技术和DNA重组技术，是以分子遗传学为理论基础，以分子生物学和微生物学的现代方法为手段，将不同来源的基因按预先设计的蓝图，在体外构建杂种DNA分子，然后导入活细胞，以改变生物原有的遗传特性、获得新品种、生产新产品。基因工程技术为基因的结构和功能的研究提供了有力的手段。

筛选 1、根据载体标记基因筛选转化子 方法：将转化处理后的受体细胞接种在含适量选择药物的培养基上，在最适生长温度条件下培养一段时间，根据菌落生长情况挑选出转化子。
2、根据报告基因筛选转化子。 报告基因：一个编码可被检测的蛋白质或酶的基因，即表达产物易被鉴定的基因。由于受体细胞内报告基因的表达，出现新的遗传性状，以此来识别被转化的细胞或未被转化的细胞。
3、根据形成噬菌斑筛选转化子 转化子在培养基上被裂解形成噬菌斑，而非转化子能正常生长，两者很容易区分。

试以谷氨酸为例，详述微生物发酵过程的工艺流程（有，打印）

详述发酵的一类、二类和三类发酵？
答：一类发酵：产物形成与底物利用直接相关，为生长联系型，又称简单发酵型，产物直接由碳源代谢而来，产物生成速度的变化与微生物对碳源利用速度的变化是平行的，产物生成与微生物的生长也是平行的。在这些发酵过程中，菌体的生长、基质的消耗、产物的生成三个速度都有一个高峰，三高峰几乎同时出现。
二类发酵：产物形成与底物利用间接相关，为部分生长联系型，又称中间发酵型，产物不是碳源的直接氧化产物，而是菌体代谢的主流产物。它的特点是在发酵的第一时期碳源大量消耗用于菌体的迅速增长而产物的形成很少或全无，第二时期碳源大量消耗用于产物的高速合成及菌体的生长。
三类发酵：产物形成与底物利用不相关，为非生长联系型，又称复杂发酵型，产物的生成在菌体生长和基质消耗完以后才开始，与菌体生长不相关，与基质消耗无直接关系，所形成的产物为次级代谢产物。

实验室从自然界中分离得到1株产淀粉酶的细菌菌株，试设计试验克隆该淀粉酶的基因并进行表达。
1 材料 菌株和质粒 限制性核酸内切酶T4DNA连接酶 TaqDNA聚合酶等
2 DNA的提取和纯化 基因组DNA提取、纯化，以及质粒的提取
3 DNA文库的构建和筛选
4 基因测序及蛋白质序列分析和同源性比较
5 基因的克隆 将基因序列用PCR扩增后，纯化，酶切，与载体相连后，转入大肠杆菌中，用酶切检测的方法筛选出含重组质粒的菌株。
6 酶活力的测定
7 蛋白质测定和电泳分析
8酶水解产物的硅胶板薄层色谱分析

什么是转基因植物，详述转基因大豆的潜在风险和对策。
转基因植物：转基因植物(Transgene plant)是拥有来自其他物种基因的植物。该基因变化过程可以来自不同物种之间的杂交，但今天该名词更多的特指那些在实验室里通过重组DNA技术人工插入其他物种基因以创造出拥有新特性的植物。

风险：
1、 标记基因和启动子可能造成难以预料的后果
转基因大豆具卡那霉素、潮霉素、庆大霉素等抗菌素抗性筛选标记基因，可能使人体及其周围生物获得抗菌素抗性，也可能逃逸到人类身上，或者进入其他动植物的染色体，造成难以预见的后果。另外，由于花椰菜花叶病毒35s基因的启动子来源于植物病毒基因，有人怀疑它存在着与其他病毒重组可能，产生新的病毒和疾病。
2、 抗除草剂基因的转移可能产生超级杂草，转基因作物也能产生表型畸形，自身可能变为杂草
据研究，转基因大豆使大豆更易感染疾病和受到害虫的侵袭。大量种植转基因大豆引起耐除草剂杂草的蔓延以及疾病的传播。使用除草剂较种植常规大豆多11.4%从而加速了抗性杂草的发展。转基因大豆上草甘膦的使用限制了大豆根部的生长和固氮功能，特别是在缺水情况下。据研究，由于盲目种植转基因油菜，加拿大农田里发现了拥有多种耐抗除草剂特性的野草化油菜的植株，即超级杂草，同时也导致种质的污染并且被传播到北美其他地方。
3、 难以控制逃逸对生物安全的影响
由于表面与非转基因大豆没有什么不同，转基因大豆在运输、装卸、处理过程中，或与非转基因大豆混杂很易发生逃逸；也可能由于监控不力进入农贸市场，这会导致灾难性的后果：如直接食用是否对人类安全产生影响？被制成豆芽后残渣逃逸的后果如何？最可怕的是难以评估农民购入后直接种植这些大豆对生物多样性的影响。
4、 未知DNA的影响
比利时科学家2001年8月在RR大豆中发现了一些来历不明的未知DNA。有证据显示热温或干旱等环境压力下，不明的DNA可能会增加大豆木质素，导致植物蛋白的改变。
5不同用途的转基因作物之间交叉污染对生物安全的影响不容低估
主要有几种情况：一是可食用转基因玉米污染随后种植的 转基因大豆；二是药用转基因玉米污染随后种植的转基因大豆。目前我国也不允许种植转基因大豆但允许进口。如果转基因大豆进口盲目增长，一旦失控，将对物种多样性产生毁灭性的灾难；届时，我国人民的健康和安全将面临威胁。
对策：
（一）应加强对转基因大豆的生物安全管理
1、加强对转基因大豆进口的生物安全风险评估。要吸取墨西哥玉米的教训，必须考虑中国是大豆源产国和品种多样性集中地，从国情出发加强进口转基因大豆的生物安全评估；目前我国对转基因产品进口的临时管理办法基本上留于形式，只要求每批次大豆进口申请，一般一申请就批准，结果难以达到维护生物安全的目的。为此，应严格按照《农业转基因生物安全评价管理办法》进行审批，农业部、国家环
保总局、外经贸部、卫生部和国家质量检验检疫总局应密切配合，切实保障我国的生物安全。在临时措施结束后，应按照国际惯例（270天）审批转基因大豆进口；
2、维护法律法规的严肃性，对转基因大豆及其加工的豆油和豆粕全面、强制加贴标识。我国已于2002年3月20日发布了《农业转基因生物标识管理办法》，规定进口大豆特别是其加工的豆油和豆粕必须加贴标识。但至今为止，没有一家企业贴上标签，为严肃法纪，应进行全国执法大检查，对违规者严肃处理，并加大宣传力度，给予消费者充分的知情权和选择权；
3、应制定转基因大豆及其制品可追踪性管理办法，对转基因大豆入境后的运输、仓储、包装、加工、销售建立严格的监管机制，防止转基因大豆遗漏或逃逸；
4、加强检验检疫，杜绝危害我国生物安全的外来有害生物的进入；
5、应制定转基因大豆、豆油、豆粕国家强制性标准；
6、政府部门、行业协会、民间组织、企业之间按分工原则建立有效的协调和调控机制，共同提高生物安全能力建设。
（二）加强国际合作，维护合法权益
1、加强信息交流，掌握转基因大豆的发展动向和安全性状况；
2、大力支持《生物安全议定书》的实施与完善，应参考WTO争端解决机制建立适合于转基因产品特点的争端解决机制；
3、在新一论WTO贸易与环境谈判中，应坚持《生物安全议定书》中的一些基本原则，一方面要反对歧视和贸易保护主义，另一方面要保证生物安全。
（三）大力发展我国自己的非转基因大豆种植业尤其是绿色-有机大豆的生产与出口
1、大豆产业发展前景广阔
大豆既是粮食作物，又是经济作物，也是工业原料，是重要的植物蛋白资源和食用油料，极具开发潜力。大豆蛋白可被应用到各种食品和饮品、可食性包装材料、精细化工等领域。豆粕则是畜牧业和水产养殖业饲料蛋白的主要来源。据统计，目前世界上大豆食品达1.2万种。大豆含有可精深加工并对人体有特殊功能的活性物质，如磷脂、低聚糖、皂苷、异黄酮、天然维生素E等。营养学家认为，21世纪是“大豆世纪”。大豆还可被广泛应用于化工、环保、军事、医药、纺织服装、航空、航天等领域。
2、统一认识，把支持和加快大豆产业发展作为应对WTO挑战、发展农业产业化的重要举措
应由国家经贸委牵头，会同农业部、外经贸部等部门共同制订大豆产业政策。只要国家重视和予以适当支持，大豆种植业完全可以摆脱停滞不前局面，能迅速扩大生产并满足日益增长的需求，我国可以把大豆产业培育优势支柱产业，改变世界第一进口国的局面，成为世界大豆种植、加工和出口强国。这一产业政策的重点是：完善大豆科研、品种繁育与技术推广体系；创造良好生产条件，鼓励种植优质高产大豆，提高单产和总产量水平，降低成本；支持绿色-有机大豆发展；大力支持产地国家级加工龙头企业的发展；免征豆粕和豆油的铁路建设基金；制定大豆及其制品出口振兴计划，大豆及其制品应全额退税；鉴于进口猛增已对大豆产业造成很大危害，时机合适时可采取一般保障措施；完善大豆振兴计划，在充分发挥东北高油大豆为主优势同时，制定黄淮海地区大豆行动计划，积极开发黄淮海大豆蛋白和油量双高优势；尽快成立并积极发挥中国大豆协会的作用，同时建立大豆产业发展基金。

什么是转基因动物，详述克隆羊“多莉”的过程。
答：转基因动物是指用实验导入的方法将外源基因在染 色体基因内稳定整合并能稳定表达的一类动物。

在培育多莉的过程中，科学家采用体细胞克隆技术，主要分四个步骤进行：
①从一只六岁雌性的芬兰多塞特(Finn Dorset)白面绵羊（称之为A）的乳腺中取出乳腺细胞，将其放入低浓度的培养液中，细胞逐渐停止分裂，此细胞称之为供体细胞。
②从一头苏格兰黑面母绵羊（称之为B）的卵巢中取出未受精的卵细胞，并立即将细胞核除去，留下一个无核的卵细胞，此细胞称之为受体细胞。
③利用电脉冲方法，使供体细胞和受体细胞融合，最后形成融合细胞。电脉冲可以产生类似于自然受精过程中的一系列反应，使融合细胞也能像受精卵一样进行细胞分裂、分化，从而形成胚胎细胞。
④将胚胎细胞转移到另一只苏格兰黑面母绵羊（称之为C）的子宫内，胚胎细胞进一步分化和发育，最后形成小绵羊多莉。

试以青霉素为例，详述微生物发酵过程的工艺流程。
答：
青霉素发酵过程
• 青霉素发酵时，青霉素生产菌在合适的培养基、PH、 温度和通气搅拌等发酵条件下进行生长并合成青霉素。 • 发酵开始前，有关设备和培养基（主要是碳源、氮源、 前体和无机盐等）必须先经过灭菌，后接入种子。 • 在整个过程中，需要不断通气和搅拌，维持一定的罐 温和罐压，在发酵过程中往往要加入泡沫剂，假如酸 碱控制发酵液的PH，还需要间歇或连续的加入葡萄糖 及铵盐等化合物以补充碳源及氮源，或补进其他料液 和前体等以促进青霉素的生产。

• 发酵工艺控制：
1.基质浓度 2.培养基成分的控制 3.温度
4. pH 值、溶氧
5.菌丝状态
6.泡沫的控制
1.基质浓度 ：
在发酵过程中，常常因为前期基质量浓度过 高，对生物合成酶系产生阻遏或对菌丝生长产生抑制（如葡萄糖的阻遏和抑制 , 苯乙酸的生长抑制）, 而后期基质浓度低限制了菌丝生长和产物合成。所以， 在青霉素发酵中通常采用补料分批操 作法 ，以维持一定的最适浓度 。
2.培养基成分的控制 :
A.碳源：发酵中常用乳酸或葡萄糖。
乳糖最为便宜，但因货源较少，很多国家采用 葡萄糖代替。但当葡萄糖浓度超过一定限度时，会 过分加速菌体的呼吸，以至培养基中的溶解氧不能 满足需要，使一些中间代谢物不能完全氧化而积累 在菌体或培养基中，导致pH下降，影响某些酶的活 性，从而抑制微生物的生长和产物的合成。 目前普遍采用淀粉的酶水解产物，葡萄糖化液流 加，以降低成本。
• B.氮源： 主要有机氮源为玉米浆、棉籽饼粉、 花生饼粉、酵母粉、蛋白胨等。
玉米浆为较理想的氮源，含固体量少，有利 于通气及氧的传递，因而利用率较高。 有机氮源还可以提供一部分有机磷，供菌体 生长。无机氮如硝酸盐、尿素、硫酸铵等可适量 使用。
• C.无机盐：
碳酸钙用来中和发酵过程中产生的杂酸，并控制发酵 液的pH值 为菌体提供营养的无机磷源一般采用磷酸二氢钾。 另外加入硫代硫酸钠或硫酸钠以提供青霉素分子中所 需的硫。 铁离子对青霉素有毒害作用，应严格控制发酵液中铁 含量在30ug/mL以下。现在还有一些工厂采用铁罐发酵， 在发酵过程中铁离子便逐渐进入发酵液；发酵时间愈长， 则铁离子愈多。铁离子在50µg/ml以上便会影响青霉素的 合成。所以青霉素的发酵罐采用不锈钢制造为宜。
• D.前体： 前体的加入是青霉素发酵的关键问题之一。 添加苯乙酸或者苯乙酰胺，可以借酰基转移的作用， 将苯乙酸转入青霉素分子，提高青霉素G的生产强度。 但苯乙酸对发酵有影响，一般以苯乙酰胺较好。 也有采用苯乙酸月桂醇酯，其优点是在发酵中月桂醇 酯水解，苯乙酸结合进青霉素成品。而月桂酸作为细菌营 养剂及发酵液消沫剂，且其毒性比苯乙酸小，但价格较贵。 前体要在发酵开始20h后加入，并在整个发酵过程中 控制在50µg/ml左右。前体用量大于0.1%时，青霉素的生 物合成均下降。所以一般发酵液中前体浓度以始终维持在 0.1%为宜。
3.温度 ：
青霉素发酵的最适温度随所用菌株的不同可 能稍有差别 , 但一般认为应在25 °C 左右。温度 过高将明显降低发酵产率 , 同时增加葡萄糖的维 持消耗 , 降低葡萄糖至青霉素的转化率。对菌丝 生长和青霉素合成来说 , 最适温度不是一样的, 一 般前者略高于后者, 故有的发酵过程在菌丝生长阶 段采用较高的温度，以缩短生长时间, 到达生产阶 段后便适当降低温度 , 以利于青霉素的合成。
4. pH 值、溶氧 ：
pH值：青霉素发酵的最适pH 值一般认为在6.8～7.2 左右, 应尽量避免 pH 值超过7.0。因为青霉素在碱性条 件下不稳定,容易加速其水解。 溶氧:对于好氧的青霉素发酵来说,溶氧浓度是影响发 酵过程的一个重要因素。当溶氧浓度降到30%饱和度以下 时,青霉素产率急剧下降,低于10%饱和度时,则造成不可逆 的损害。溶氧浓度过高,说明菌丝生长不良或加糖率过低, 造成呼吸强度下降,同样影响生产能力的发挥。 在罐的夹层或蛇管中需通冷却
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水以维持一定罐温。 在整个发酵过程中，需不断通无菌空气和搅拌，以维 持一定罐压或溶氧。 33
5. 菌丝状态：
• 菌丝浓度：发酵过程中必须控制菌丝 浓度不超过临界菌体浓度, 从而使氧 传递速率与氧消耗速率在某一溶氧水 平上达到平衡。 • 菌丝生长速度：在葡萄糖限制生长的 条件下，当比生长速率低于0.015h-1 时，比生产速率与比生长速率成正比。 因此, 要在发酵过程中达到并维持最 大比生产速率,必须使比生长速率不低 34 0.015h-1。发酵工艺控制
6.泡沫的控制 ：
在发酵过程中产生大量泡沫, 可以用天然油脂, 如豆油、 玉米油等或用化学合成消泡剂 “ 泡敌 ” 来消泡。 应当控制其用量并要少量多次加入, 尤其在发酵前期 不宜多用, 否则会影响菌体的呼吸代谢 。 加消沫剂控制泡沫，必要时还加入酸、碱以调节发 酵液的pH。

简述外源基因在原核细胞中表达的基本条件
1、通过表达载体将外源基因导入宿主细胞
提供转录翻译所必须的调控元件，如启动子、终止子、转录终止子、核糖体结合位点等。
2、必须利用原核生物的强启动子和S-D序列等调控元件。
3、外源基因不能带有间隔序列（内含子） 基因来源：（1）Genomic DNA (原核) （2）cDNA（真核）（3）人工化学合成（选择细菌偏爱的密码子） （4）PCR扩增
4、外源基因与载体连接后必须形成正确的开放阅读框架
5、利用宿主细胞的调控系统。
详述农杆菌Ti质粒转化丝状真菌的方法。
1、获取目的基因：用限制性核酸内切酶切割下目的基因。
2、基因表达载体的构建：将目的基因与载体（大多数选用质粒）用DNA连接酶连接起来。
3、将目的基因导入受体细胞：将含目的基因的重组质粒导入农杆菌（农杆菌为受体细胞）。
4、目的基因的检测与鉴定：用DNA分子杂交技术/分子杂交技术/抗原-抗体杂交/个体生物学水平鉴定
5、最后将成功表达的细胞导入菌体内，进行个体生物学水平鉴定。