细胞生物学实验指导标准样本.doc

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实验一 叶绿体的分离与荧光观察
1．实验目的
了解叶绿体分离的一般原理和方法, 并熟悉应用荧光显微镜方法观察叶绿体荧光现象。
2．实验原理
叶绿体是植物细胞中较大的一种细胞器, 能发生特有的能量转换。利用低速离心机能够分离叶绿体, 其分离在等渗溶液( 0.35mol/L氯化钠或0.4mol/L蔗糖溶液) 中进行, 目的是为了防止渗透压的改变引起叶绿体的损伤。将匀浆液在1000r/min离心, 去除其中的组织残渣和一些未被破碎的完整细胞, 然后, 3000r/min离心, 可获得沉淀的叶绿体( 混有部分细胞核) 。在室温下进行分离要迅速。
某些物质在一定短波长的光( 如紫外光) 的照射下吸收光能进入激发态, 从激发态回到基态时, 就能在极短的时间内放射出比照射光波长更长的光( 如可见光) , 这种光就称为荧光。若停止供能, 荧光现象立即停止。有些生物体内的物质受激发光照射后, 可直接发出荧光( 称为自发荧光) , 如叶绿素的火红色荧光。有的生物材料本身不发荧光, 但它吸收荧光染料后同样也能发出荧光( 称为间接荧光) , 如叶绿体吸附吖啶橙后可发橘红色荧光本实验利用荧光显微镜对发荧光的叶绿体进行观察。
3．实验材料、 用品
⑴ 实验材料: 菠菜叶片
⑵ 实验药品: 蒸馏水, 0.35mol/L氯化钠溶液, 0.01%吖啶橙。
⑶ 实验仪器: 普通离心机, 组织捣碎机, 天平, 荧光显微镜, 显微镜, 载玻片, 盖玻片, 镊子, 接种针, 目镜测微尺, 物镜测微尺, 恒温箱, 培养皿, 滤纸, 试管, 试管架, 移液管, 滴管, 烧杯, 无荧光载片, 盖玻片, 离心管。
4．实验步骤
⑴ 选取新鲜的菠菜嫩叶, 洗擦干后去除叶梗及粗脉, 称3g于0.35mol/L氯化钠溶液15ml中置组织捣碎机或研钵中。
⑵ 利用组织捣碎机低速( 5000r/min) 匀浆, 3~5min, 或研磨成匀浆。
⑶ 用6层纱布过滤, 滤液盛于烧杯中。
⑷ 取滤液4ml在1000r/min下离心2min, 弃去沉淀。
⑸ 将上清液在3000r/min下离心5min, 弃去上清液, 沉淀即为叶绿体( 混有部分细胞核) 。
⑹ 沉淀用0.35mol/L氯化钠溶液悬浮。
⑺ 取叶绿体悬液1滴置于载玻片上, 加盖玻片后用普通光学显微镜观察。使用荧光显微镜观察时, 将叶绿体悬液滴在无荧光的载玻片上, 再滴加1滴0.01%吖啶橙荧光染料, 盖上无荧光的盖玻片后即可观察。
⑻ 观察叶绿体的形态结构、 测量1-5个叶绿体的长轴和短轴、 叶绿体发射荧光的现象。
5．实验报告
⑴ 观察叶绿体的形态结构,测量5~10个叶绿体的长轴和短轴求其平均值。
⑵ 记录荧光显微镜下观察的叶绿体自发荧光和次生荧光现象, 分析结果。
6．思考题
⑴ 分离叶绿体实验的原理是什么? 操作过程中应注意什么?
⑵ 普通光学显微镜和荧光显微镜的原理有何异同点?
实验二 线粒体和液泡系的超活染色与观察
活体染色是能使生活有机体的细胞或组织特异性着色但对活样品又没有毒害作用的一种活体染色方法, 其目的是显示生活细胞内的某些结构, 而不影响细胞的生命活动和产生任何物理、 化学变化以致引起细胞的死亡。活体染色技术可用来研究生活状态下的细胞形态结构和生理、 病理状态。
一般把活体染色分为体内活体染色与体外活体染色两类。体外活体染色又称超活染色, 它是由活的动、 植物分离出部分细胞或组织小块, 以染料溶液浸染, 染料被选择固定在活细胞的某种结构上而显色。活体染料之因此能固定、 堆积在细胞内某些特殊的部分, 主要是靠染料的”电化学”特性。碱性染料的胶粒表面带阳离子, 酸性染料的胶粒表面带有阴离子, 而被染的部分本身也是具有阴离子或阳离子, 这样, 它们彼此之间就发生了吸引作用。但并非任何染料均可用于活体染色, 理论上应选择那些对细胞无毒性或毒性极小的染料, 且使用时需要配成稀淡的溶液。一般说来, 最为适用的是碱性染料, 这可能是因为它具有溶解在类脂质(如卵磷脂、 胆固醇等)的特性, 易于被细胞吸收。詹纳斯绿B(Janus green B)和中性红(neutral red)两种碱性染料是活体染色剂中最重要的染料, 对于线粒体和液泡系的染色分别具有专一性。
1．实 验 目 的
⑴ 观察动、 植物活细胞内线粒体、 液泡系的形态、 数量与分布;
⑵ 学习一些细胞器的超活染色技术。
2．实 验 原 理   
线粒体是细胞内一种重要细胞器, 是细胞进行呼吸作用的场所。细胞的各项活动所需要的能量, 主要是经过线粒体呼吸作用来提供的。活体染色是应用无毒或毒性较小的染色剂真实地显示活细胞内某些结构而又很少影响细胞生命活动的一种染色方法。詹纳斯绿 B是线粒体的专一性活体染色剂。线粒体中细胞色素氧化酶使染料保持氧化状态(即有色状态)呈蓝绿色, 而在周围的细胞质中染料被还原, 成为无色状态。
中性红为弱碱性染料, 对液泡系(即高尔基体)的染色有专一性, 只将活细胞中的液泡系染成红色, 细胞核与细胞质完全不着色, 这可能是与液泡中某些蛋白质有关。
3．实 验 用 品
⑴ 器材
    显微镜、 恒温水浴锅、 解剖盘、 剪刀、 镊子、 双面刀片、 解剖盘．载玻片、 凹面载玻片、 盖玻片、 表面皿、 吸管、 牙签、 吸水纸。
⑵ 试剂
① Ringer溶液:
氯化钠 0.85g (变温动物用0.65g)
氯化钾 0.25g
氯化钙 0.03g
蒸馏水 100ml
② 10%、 1/3000中性红溶液:
    称取0.5g中性红溶于50ml Ringer液, 稍加热 (30-40℃)使之很快溶解, 用滤纸过滤, 装入棕色瓶于暗处保存, 否则易氧化沉淀, 失去染色能力。临用前, 取已配制的1%中性红溶液1ml, 加入29ml Ringer溶液混匀, 装入棕色瓶备用。
③ 1%、 1/5000詹纳斯绿B溶液
称取50mg詹纳斯绿B溶于5ml Ringer溶液中, 稍加微热(30-40℃), 使之溶解, 用滤纸过滤后, 即为1%原液。取1%原液l ml加入49ml Ringer溶液, 即成1/5000工作液装入瓶中备用。最好现用现配, 以保持它的充分氧化能力。
⑶ 材料
人口腔上皮细胞, 洋葱鳞茎内表皮, 黄豆( 拟南芥) 幼根根尖。
4．实 验 方 法
4．1 人口腔粘膜上皮细胞线粒体的超活染色与观察
⑴ 清洁载玻片放在37℃恒温水浴锅的金属板上。
⑵ 滴2滴1/5000詹纳斯绿B染液。
⑶ 用牙签口腔颊粘膜处稍用力刮取上皮细胞。
⑷ 刮下的粘液状物放大载玻片的染液滴中。
⑸ 染色10-l5min(注意不可使染液干燥, 必要时可再加滴染液)。
⑹ 盖上盖玻片,显微镜下观察。
注意:
A、 实验者用牙签宽头在自己口腔颊粘膜处稍用力刮取上皮细胞, 将刮下的粘液状物放入载玻片的染液滴中, 染色10-15min(注意不可染液干燥, 必要时可再加滴染液), 盖上盖玻片, 用吸水纸吸去四周溢了的染液, 置显微镜下观察。
B、 在低倍镜下, 选择平展的口腔上皮细胞, 换高倍镜或油镜进行观察。可见扁平状上皮细胞的核周围胞质中, 分布着一些被染成蓝绿色的颗粒状或短棒状的结构, 即是线粒体。

4．2洋葱鳞茎表皮细胞线粒体的超活染色观察
⑴ 用吸管吸取1/5000詹纳斯绿B染液, 滴1-2滴于干净的载玻片上, 然后, 撕取一小片洋葱鳞茎内表皮, 置于染液中, 染色10-15min.
⑵ 用吸管吸去染液, 加一滴Ringer液, 注意使内表皮组织展平, 盖上盖玻片进行观察。
⑶ 在高倍镜下, 可见洋葱表皮细胞中央被一大液泡所占据, 细胞核被挤至一侧贴细胞壁处．仔细观察细胞质中线粒体的形态与分布。
4．3 植物细胞液泡系的超活染色与观察 ( 附加实验)
取豆芽的根尖
⑴ 用刀片纵切根尖, 放入中性红染液滴中, 染色5-10min。
⑵ 吸去染液, 滴一滴Ringer液。
⑶ 盖上盖玻片进行镜检(镊子轻轻地下压盖玻片, 使根尖压扁, 利于观察。
⑷ 在高倍镜下, 先观察根尖部分的生长点的细胞, 可见细胞质中散在很多大小不等的染成玫瑰红色的圆形小泡, 这是初生的幼小液泡。然后, 由生长点向延长区观察, 在一些已分化长大的细胞内, 液泡的染色较浅, 体积增大, 数目变少。在成热区细胞中, 一般只有一个淡红色的巨大液泡, 占据细胞的绝大部分, 将细胞核挤到细胞一侧贴近细胞壁处。
⑸ 从以上的观察结果, 想想标题物细胞液泡系的形态演进情况。
5．实 验 结 果
6．实验报告
绘口腔上皮细胞示线粒体的形态与分布。
实验三 线粒体的分离与观察
1．实验目的
用差速离心法分离动、 植物细胞线粒体。
2．实验原理
线粒体( mitochondria) 是真核细胞特有的, 是能量转换的重要细胞器。细胞中能源物质--脂肪、 糖、 部分氨基酸在此进行最终的氧化, 并经过耦联磷酸化生成ATP, 供给细胞生理活动之需。对线粒体结构与功能的研究一般是在离体的线粒体上进行的。
制备线粒体采用组织匀浆在悬浮介质中进行差迷离心的方法。在一给定的离心场中(对于所使用的离心机, 就是选用一定的转速), 球形颗粒的沉降速度取决于它的密度、 半径和悬浮介质的粘度。在一均匀悬浮介质中离心一定时间内, 组织匀浆中的各种细胞器及其它内含物由于沉降速度不同将停留在高低不同的位置。依次增加离心力和离心时间, 就能够使这些颗粒按其大小、 轻重分批沉降在离心管底部, 从而分批收集。细胞器中最先沉淀的是细胞核, 其次是线粒体, 其它更轻的细胞器和大分子可依次再分离。
悬浮介质一般见缓冲的蔗糖溶液, 它比较接近细胞质的分散相, 在一定程度上能保持细胞器的结构和酶的活性, 在pH7．2的条件下, 亚细胞组分不容易重新聚集, 有利于分离。整个操作过程应注意使样品保持4℃, 避免酶失活。
线粒体的鉴定用詹纳斯绿活染法。詹纳斯绿B(JanusgreenB)是对线粒体专一的活细胞染料, 毒性很小, 属于碱性染料, 解离后带正电, 由电性吸引堆积在线粒体膜上。线粒体的细胞色素氧化酶使该染料保持在氧化状态呈现蓝绿色从而使线粒体显色, 而胞质中的染料被还原成无色。
本实验介绍大鼠肝和玉米线粒体的分离。

Ⅰ、 大鼠肝线粒体的分离
Ⅰ-1.实验用品
㈠　材料:大鼠肝脏
㈡　试剂
⑴　生理盐水。
⑵　1％詹纳斯绿B染液, 用生理盐水配制。
⑶　0．25mol／L蔗糖+0．01 mol／L Tris-盐酸缓冲液(pH7．4):
0．1 mol／L三羟甲基氨基甲烷(Tris) 10ml
0．1 mol／L盐酸 8.4ml
加重蒸水到 100ml
加蔗糖到0．25 mol／L。蔗糖为密度梯度离心用D(+)蔗糖
⑷　0．34mol／L蔗糖+0．01 mol／Ltris-盐酸缓冲液(pH7．4)
⑸　固定液: 甲醇-冰醋酸(9: 1)
⑹　姬姆萨染液: Giemsa粉0.5克, 甘油33ml, 纯甲醇33ml。先往Giemsa粉中加少量甘油在研钵中研磨至无颗粒, 在将剩余甘油倒入混匀, 56℃, 左右保温2小时令其充分溶解, 最后加甲醇混匀, 成为姬姆萨原液, 保存于棕色瓶。用时吸出少量用1/15mol/L磷酸盐缓冲液作10-20倍稀释。
1／15mol／L磷酸盐缓冲液(pH6．8):
1／15 mol／L KH2P04 50ml
1／15 mol／LNa2HP04 50ml
㈢　器材
高速离心机、 解剖刀剪、 小烧杯、 冰浴、 漏斗、 尼龙织物、 玻璃匀浆器。
Ⅰ-2.实验方法
⑴ 制备大鼠肝细胞匀浆。实验前大鼠空腹12h, 击头处死, 剖腹取肝, 迅速用生理盐水洗净血水, 用滤纸吸干。称取肝组织2g, 剪碎, 用预冷到0-4℃的0．25mol儿缓冲蔗糖溶液洗涤数次。然后在0-4℃条件下, 按每克肝加9ml冷的0．25 mol儿缓冲蔗糖溶液将肝组织匀浆化, 蔗糖溶液应分数次添加, 匀浆用双层尼龙织物过滤备用。注意尽可能先充分剪碎肝组织, 缩短匀浆时间, 整个分离过程不宜过长, 以保持组分生理活性。
⑵ 差速离心。先将9ml 0．34mol／L缓冲蔗糖溶液放人离心管, 然后沿管壁小心地加入9ml肝匀浆使其覆盖于上层。用冷冻控温高速离心机按图1顺序进行差速离心。
⑶ 分离物鉴定。
① 细胞核: 取细胞核沉淀一滴涂片, 人甲醇-冰醋酸液固定15min, 充分吹干, 滴姬姆萨染液(原液10-20倍稀释)染色10min。自来水冲洗, 吹干, 镜检。结果: 细胞核紫红色, 上面附着的少量胞质为浅蓝色碎片。
② 线粒体: 取线粒体沉淀涂片(注意勿太浓密), 不待干即滴加1％詹纳斯绿B染液染20min, 覆上盖玻片, 镜检。线粒体蓝绿色, 呈小棒状或哑铃状。
实验注意事项
如果使用不带冷冻控温的普通高速离心机操作, 应尽量缩短操作时间、 注意样品的冷冻, 保持其生理活性。
Ⅰ-3.作 业
将线粒体沉淀作一涂片, 用姬姆萨染色, 检查是否混杂细胞核和胞质碎片, 估计分离所得线粒体的纯度。根据你的实际体会, 写出操作注意事项及改进方法。
Ⅰ-4.思 考 题
1.分离介质0．25mol／L及0．34mol/L缓冲蔗糖溶液哪一种在下层?有什么作用?
2.分离出的线粒体立即用詹纳斯绿B染色和放置室温2h后再染色, 比较二者着色的差异。

Ⅱ．玉米线粒体的分离
从植物细胞分离线粒体, 除了作线粒体功能测定外, 在植物细胞遗传工程中, 常见于分离核外基因--线粒体DNA等目的。
分离线粒体的方法仍采用均匀介质中的差速离心。介质中0.25mol／L蔗糖也能够用0.3mol／L甘露醇代替。EDTA整合二价阳离子, Ca2+除去后细胞间粘着解体, 促使组织分散成单个细胞。牛血清白蛋白(BSA)能包在细胞外面, 并作为竞争性底物削弱蛋白酶的作用。
Ⅱ-1.实验用品
㈠ 材料
玉米黄化幼苗(水稻、 高粱等幼苗均可)。
㈡ 试剂
⑴ 分离介质: 0．25 mol／L蔗糖, 50 mmol／l的Tris-盐酸缓冲液(pH7．4) , 3 mmol／L EDTA, 0．75mg／ml牛血清白蛋白(BSA)。
50 mmol／L的Tris-Hcl缓冲液(pH7．4)配法: 50ml 0．1 mol／L三羟甲基氨基甲烷(Tris)溶液与42ml 0．1 mol儿盐酸混匀后, 加水稀释至100ml。
⑵ 保存液: 0．3mol／L甘露醇(pH7．4)。
⑶ 20％次氯酸钠(NaCl0)溶液。

鼠肝匀浆700g×离心10min
沉淀
上清液
洗涤
10ml预冷的0.25mol/L缓冲蔗糖溶液2次, 每次1000×g离心15min

上清液
合并
10000×g离心10min
上清液
沉淀
( 线粒体)
洗涤
加10ml预冷的0.25mol/L缓冲蔗糖溶液2次, 每次10000×g离心15min
沉淀
上清液
( 纯化的线粒体)
图1 差速离心顺序图

⑷ 1％詹纳斯绿B染液, 用生理盐水配制。
㈢ 器材
温箱、 冰箱、 纱布、 瓷研钵、 冷冻控温高速离心机
Ⅱ-2.实验方法
⑴ 玉米种子用20％次氯酸钠溶液浸泡10min消毒, 清水冲洗30min, 再浸泡清水15h。将种子平铺在放有湿纱布的盘内, 保持湿度, 置温箱28℃于暗处培肓2-3d。待芽长到1-2cm长时剪下约15g, 放0-4℃1h。
⑵ 加3倍体积分离介质, 在瓷研钵内快速研磨成匀浆。
⑶ 用多层纱布过滤, 滤液经700×g离心10min。除去核和杂质沉淀。
⑷ 取上清液10 000×g离心lOmin, 沉淀为线粒体。再同上离心洗涤一次。
⑸ 沉淀为线粒体, 可存于0．3mol／L甘露醇中。注意以上匀浆化及离心均控制在0-4℃进行。
Ⅱ-3.实验结果
线粒体的观察: 取线粒体沉淀涂在清洁的载玻片上, 不待干立即滴加1％詹纳斯绿B染色20min, 放上盖玻片, 用显微镜观察, 线粒体是蓝绿色圆形颗粒。

实验四 水稻悬浮细胞的培养
1．实验目的
深入了解水稻细胞在离体条件下的生长特性, 掌握植物细胞悬浮系的建立以及种细胞的筛选方法。
2．实验原理
利用固体琼脂培养基对植物的离体组织进行培养的方法在植物遗传实验中已经得到广泛的应用。但这种方法在某些方面还存在一些缺点, 比如在培养过程中, 植物的愈伤组织在生长过程中的营养成分、 植物组织产生的代谢物质呈现一个梯度分布, 而且琼脂本身也有一些不明的物质成分可能对培养物产生影响, 从而导致植物组织生长发育过程中代谢的改变而利用液体培养基则能够克服这一缺点, 当植物的组织在液体培养基中生长时, 我们能够经过薄层震荡培养或向培养基中通气用以改进培养基中氧气的供应。植物细胞的悬浮培养是指将植物细胞或较小的细胞团悬浮在液体培养基中进行培养, 在培养过程中能够保持良好的分散状态。这些小的细胞聚合体一般来自植物的愈伤组织。
一般的操作过程是把未分化的愈伤组织转移到液体培养基中进行培养。在培养过程中不断进行旋转震荡, 一般可用100-12Or/min 的速度进行。由于液体培养基的旋转和震荡, 使得愈伤组织上分裂的细胞不断游离下来。在液体培养基中的培养物是混杂的, 既有游离的单个细胞, 也有较大的细胞团块, 还有接种物的死细胞残渣。
在液体悬浮培养过程中应注意及时进行细胞继代培养, 因为当培养物生长到一定时期将进入分裂的静止期。对于多数悬浮培养物来说, 细胞在培养到第18-25d 时达到最大的密度, 此时应进行第一次继代培养。在继代培养时, 应将较大的细胞团块和接种物残渣除去。若从植物器官或组织开始建立细胞悬浮培养体系, 就包括愈伤组织的诱导、 继代培养、 单细胞分离和悬浮培养。当前这项技术已经广泛应用于细胞的形态、 生理、 遗传、 凋亡等研究工作, 特别是为基因工程在植物细胞水平上的操作提供了理想的材料和途径。经过转化的植物细胞再经过诱导分化形成植株, 即可获得携带有目标基因的个体。
悬浮培养是指将单个游离细胞或小细胞团在液体培养基中进行培养增殖的技术。
⑴ 起始培养物的建立
· 选择适宜的外植体: 幼胚、 胚轴、 子叶是最常使用的外植体。
· 选择适宜的培养基: 较高浓度激素浓度; 必要的附加物质。
· 愈伤组织的要求: 松散性好、 增殖快、 再生能力强
⑵ 悬浮系的建立
⑶ 悬浮细胞的生长与增殖
悬浮培养与固体培养比较有三个优点: 一是增加培养细胞与培养液的接触面, 改进营养供应; 二是在振荡条件下可避免细胞代谢产生的有害物质在局部积累而对细胞自身产生毒害; 三是振荡培养能够适当改进气体的交换。
⑷ 影响悬浮细胞生长的因素
·起始愈伤组织的质量
· 接种细胞密度
· 培养条件: 方式、 温度
· 继代周期

3．实验用品
超净工作台、 高压蒸汽灭菌器、 恒温培养箱、 磁力搅拌器、 恒温空气摇床、 镊子、 锥形瓶、 水稻种子
4．实验方法
4.1配制培养基
(1) 用于诱导水稻愈伤组织的培养基(N6), 见表3－1。
(2) 用于水稻悬浮培养的液体培养基, 见表3－2。
按照培养基配方取各种药品, 最后用蒸馏水定容到所需体积。所配制的培养基经高压蒸汽灭菌后备用, 固体琼脂培养基分装在250ml 的锥形瓶内, 每瓶约分装30ml。
4.2水稻种子的消毒
⑴将种子置于无菌的培养皿内, 以体积分数95％的酒精消毒1-2min。
⑵取出后用无菌水冲洗2-3 遍。
⑶将种子放入25.0g/L 的次氯酸钠溶液中轻轻摇动后, 浸泡60min 。
⑷取出后用无菌水冲洗, 将次氯酸钠溶液充分洗净。
4.3 接种
在超净工作台内, 将灭菌后的水稻种子接到诱导愈伤组织的固体培养基上, 每个培养瓶接5-10 粒种子。接种完毕后用封口膜将培养瓶封好, 放在26℃的恒温培养箱中进行黑暗培养。
5.实验结果
成功的悬浮细胞培养体系必须满足三个条件:
·悬浮培养物分散性良好, 细胞团较小, 一般在30-50个细胞以下, 在实际培养中很少有完全由单细胞组成的植物细胞悬浮系。
·均一性好, 细胞形状和细胞团大小大致相同。悬浮系外观为大小均一的小颗粒, 培养基清澈透亮, 细胞色泽呈鲜艳的乳白或淡黄色。
·细胞生长迅速, 悬浮细胞的生长量一般2-3天甚至更短时间便可增加一倍。

思 考 题
1. 一个好的悬浮细胞系有哪些特征? 用于建立悬浮细胞系的愈伤组织有何要求?
2．建立悬浮细胞系的关键技术有哪些?

表3－1 用于诱导水稻愈伤组织的培养基

表3－2 用于水稻悬浮培养的液体培养基

按照培养基配方取各种药品, 最后用蒸馏水定容到所需体积。所配制的培养基经高压蒸汽灭菌后备用, 固体琼脂培养基分装在250ml 的锥形瓶内, 每瓶约分装30ml。
实验五 聚乙二醇诱导鸡血细胞融合
1. 实验目的
细胞融合是指两个或两个以上的细胞合并成为一个细胞的过程。在自然情况下, 体内和体外培养的细胞均能发生自发融合现象。人工方法诱导细胞融合开始于50年, 现在这项技术已成为研究细胞遗传、 细胞免疫, 肿瘤及细胞工程的重要手段。经过实验, 了解细胞融合的原理, 掌握细胞融合的基本方法。
2. 实验原理
在诱导物( 如仙台病毒, 聚乙二醇) 作用下, 相互融合的细胞发生凝集, 随后在质膜接触处发生质膜成份的一系列变化, 主要是某些化学键的断裂与重排, 最后打通两质膜, 形成双核或多核细胞( 此时称同核体或异核体) 。经过有丝分裂, 细胞核便发生融合, 形成杂种细胞。
3. 实验用品
⑴ 器具: 显微镜 离心机 天平 离心管 注射器 细滴管 载片、 盖片。
⑵ 试剂:
① 50%聚乙二醇(PEG): 称取一定量的PEG(MW=4000)放入刻度试管, 在酒精灯火或沸水中加热溶化。待冷至50℃时, 加入等体积并预热至50℃的GKN液混匀。
② Alsver液: 葡萄糖2.05g 柠檬酸钠0.8g NaCl 0.42g, 加重蒸水至100ml。
GKN 液: NaCl 8g, KCl 0.4g, Na2HPO4.2H2O 1.77g, NaH2PO4.2H2O 0.69g, 葡萄糖2g, 酚红0.01g, 溶于1000ml重蒸水中。
③ 0.85%NaCl液
⑶ 材料: 一龄公鸡静脉血
4. 实验内容及方法
⑴　用注射器取2ml Alsver液, 再从翼下静脉取鸡血2ml, 注入试管内, 再加6ml Alsver液, 混匀后置4℃冰箱中可备作3-4天用。
⑵　实验时取”1”液1ml于离心管中, 加入4ml 0.85%的NaCl液, 混匀平衡后以1200r/min离心5分钟。
⑶　去上清液。再重复”2”两次, 最后一次离心10分钟。
⑷ 在沉降血球中加入1mlGKN液, 混匀使之成为细胞悬液。( 可加GKN液调节稀释使每立方毫米含红细胞3-4万个) 。
⑸ 在”4”液中加入6-8滴( 约0.5ml) 50%的PEG液, 迅速混匀, 常温下2~3min滴片镜检。
观察时注意不同程度的融合现象。一般分为五个阶段。①两细胞膜接触, 粘连; ②细胞膜形成穿孔; ③两细胞的细胞质连通; ④通道扩大, 两细胞连成一体; ⑤细胞完全合并, 形成一个含有两个或多个核的圆形细胞。
⑹ 计算融合率:
融合率=融合细胞数/总细胞数
5. 实验报告
1. 简述动物细胞融合的基本过程。
2. 选一理想视野, 根据镜下结果绘图, 并以图列式计算融合率。

实验六 动物细胞原代培养
1.目的要求
⑴学习动物细胞原代培养的一般方法与步骤。学习培养细胞的观察方法。
⑵掌握无菌操作技术。
2.实验原理
细胞培养是把生物体内的细胞取出, 模拟体内生理环境, 在无菌、 适当温度和一定营养条件下, 使其生存、 生长, 繁殖, 借以观察研究细胞的各种生命现象。细胞培养是一种操作繁琐而又要求十分严谨的实验技术。要使细胞能在体外长期生长, 必须满足两个基本要求: 一是供给细胞存活所必须的条件, 如适量的水、 无机盐、 氨基酸、 维生素、 葡萄糖及其有关的生长因子、 氧气、 适宜的温度, 注意外环境酸碱度与渗透压的调节。二是严格控制无菌条件。
细胞培养可分为原代培养和传代培养。原代培养是指直接从有机体获取细胞立即进行培养。任何动物细胞的培养均需从原代细胞培养做起。动物很多组织的细胞, 如动物的肾、 肺、 卵巢、 精巢等组织的细胞较易培养, 而神经细胞等较难培养。
3.实验用品
⑴材料: 孕鼠或新生乳鼠。
⑵器材: 超净工作台, 眼科剪, 眼科镊, 平养皿, 试管, 培养方瓶, 滴管, 橡皮头, 橡皮塞, 恒温箱, 倒置显微镜。
⑶试剂: 1640培养基, 青霉素溶液100单位／m1, 0.25％胰酶溶液, Hank's液, 75％酒精。
3.实验方法
在操作之前, 各种用品需严格消毒, 以保证清洁无菌, 超净工作台需紫外线照射20-30分钟。操作者需用肥皂洗净手, 并用75％酒精擦试。整个操作过程应在超净工作台内酒精灯火焰旁进行, 以减少污染的可能性。
⑴ 取材: 取新生乳鼠一只, 浸入75％酒精中浸泡5秒钟左右, 携入超净工作台内, 置于消毒培养皿中, 用Hank's液洗涤2次, 再剖开胸腹腔, 剪取黄豆大小的肺、 肾、 心、 肝、 皮肤等组织, 分别置于无菌平皿中。
⑵ 清洗: 用含双抗的Hank's液洗涤二次, 并剔除脂肪、 血液等。
⑶ 剪切: 组织块移入无菌短试管或青霉素瓶中, 用眼科剪将组织块剪成lmm3大小的碎
块, 再用Hank's液洗涤2次, 自然沉淀, 弃去带血的上清液。
⑷ 消化: 加入0.25％胰蛋白酶液0.2ml, 消化5-10分钟, 吸去消化液, 用Hank's液洗一次; 再用培养液洗一次。
⑸ 接种: 用吸管将组织块吸入方形培养瓶内, 均匀分散于底壁上, 将此面(有标本的面)朝上, 加入2-3ml培养液, 塞好瓶塞, 做好标记, 置37°C温箱中培养。
⑹培养: 4-5小时后将培养瓶翻转, 使有标本的瓶底壁朝下, 使培养液浸泡组织块, 继续置37°C温箱中培养。
4.实验结果
组织块培养2-3天后开始, 每天小心取出培养瓶置于倒置显微镜下进行观察, 一般最先”长出”的是形态不规则的游走细胞, 接着”长”出成纤维细胞或上皮细胞, 后逐渐出现细胞分裂, 细胞数量增多, 在组织块周围形成较大生长晕, 随之细胞生长较快, 可根据培养液颜色变化, 补加和更换培养液。如细胞生长良好, 约10-15天可长成致密单层, 这时可进行传代培养。
5.思考题
⑴ 简述细胞原代培养法的主要步骤。
⑵ 在细胞培养中怎样防止污染?
实验七、 人类染色体核仁组织区银染技术
1．目的要求
了解银染显示核仁形成区的原理和方法, 加深理解核仁形成区的特性及其与核仁形成、 核糖体产生的关系。 掌握人类染色体核仁形成区的银染技术。
2．实验原理
成熟核糖体大小亚基中的28S、 18S rRNA和5．8S rRNA是由处在核仁中的RNA基因( rDNA) 转录合成后加工而成。当细胞进入分裂期时, 28S+18S rRNA基因所在的DNA分子参与组装人类的5对近端着丝粒染色体( 13、 14、 15、 21、 22号) 的着丝粒区。当细胞分裂进入间期时, 位于这些部位的rRNA基因参与核仁的形成, 故将染色体上与核仁形成有关的节段称为核仁形成区( NOR) 。由于具转录活性或已转录过的rRNA基因往往伴有丰富的酸性蛋白质, 而且这类蛋自质含有一SH基团和二硫键, 易将硝酸银中的Ag+还原成Ag颗粒, 故有活性的核仁形成区常被硝酸银镀上银颗粒而呈现黑色。无转录活性的NOR则不被着色。利用硝酸银( AgNO3) 可将具转录活性的核仁形成区( rRNA基因) 特异性地染成黑色, 人们将这种银染阳性的核仁形成区称为Ag一NOR, 它是具有转录活性的18S rRNA和28S rRNA基因所在的部位。
利用银染核仁形成区技术还能准确地判断人体细胞中是否存在近端着丝粒染色体随体的联合( Ag-AA) , 这种联合可能是造成近端着丝粒染色体不分离、 断裂和易位的原因。利用银染技术可清楚地看到发生联合的染色体间有银染物质相连, 故可将其作为近端着丝粒染色体随体联合的客观标准。Ag-NOR的频率是细胞中有转录活性的rRNA基因数的量值, 而Ag-AA的频率则是rRNA基因活性大小的量值。
3．材料用品
⑴ 器材: 光学显微镜、 恒温水浴箱、 培养皿、 盖玻片
⑵ 标本: 未染色的人类染色体标本( 片龄一周以内)
⑶ 试剂: 50%硝酸银溶液、 明胶显影液
4．操作过程
⑴ 取一张片龄在一周内的染色体玻片标本( 新鲜的标本片染色效果更好) , 在片上滴加2滴明胶显影液, 然后加4滴50%硝酸银溶液, 轻摇标本片, 使两液混匀后, 即盖上盖玻片。
⑵ 将标本片放在68~70°C恒温水浴箱的金属板上, 当片子上的液体出现大量气泡时轻摇片子, 使染色均匀。这时, 可见混合物很快变黄, 待1．5~2分钟后即呈棕色。
⑶ 取下标本片, 用蒸馏水冲去盖玻片及多余染液, 自然晾干。
⑷ 观察分析: 在显微镜下可见间期核和中期分裂相的染色体被染成黄色, 核仁被染成黑色, 某些染色体上有银染黑点, 即核仁形成区。
① Ag-NOR的计数: 选择银染着色良好且D组和G组染色体数目完整的中期分裂相, 统计D组的6个和G组的4个近端着丝粒染色体的Ag-NOR数目。凡是NOR处有银染点的近端着丝粒染色体, 无论是单侧或双侧, 都计数为一个Ag-ROR。
② Ag-AA的计数: 凡近端着丝粒染色体之间有银染物质相连或连丝的, 均计为Ag-AA。而近端着丝粒染色体之间虽然非常接近, 但无银染物质相连或连丝的, 均不计为Ag-AA。涉及两条近端着丝粒染色体的联合, 计作1个Ag-AA; 涉及3条近端着丝粒染色体的联合, 如未形成闭环, 计为2个Ag-AA; 3条近端着丝粒染色体联合且形成闭环者, 计为3个Ag-AA, 余类推。在分析Ag-AA时, 应区分是D-D、 D-G, 还是G-G联合。
5．作业与思考
1．计数10个人类染色体中期分裂相中Ag-AA和Ag-NOR的数目。
2．绘一个油镜下中期分裂相, 注明Ag-NOR的位置、 数目和形态。
实验八．植物愈伤组织的诱导和分化
1.实验目的
了解培养基的配制过程; 掌握植物外植体的选择和表面消毒方法; 掌握无菌条件下愈伤组织的诱导操作方法; 了解植物组织脱分化过程中的形态变化特点。
2.实验原理
根据植物细胞的全能性, 利用植物激素中的生长素和细胞分裂素等两类重要激素的不同配比, 人为控制细胞的分裂和分化方向, 实现对植物细胞和组织的脱分化、 再分化和生根等。本实验以烟草叶片为外植体, 进行愈伤组织的诱导, 即叶片组织的脱分化实验, 以便掌握基本的植物组织培养实验操作方法。
另外, 自1973年基因工程诞生以来, 烟草易于进行组织培养、 容易得到转化植株而成为典型的基因工程模式植物, 加之由于其蛋白含量高, 被普遍认为是理想的生物反应器受体植物。经过组织培养烟草将具有重要意义。
3.实验材料,仪器和试剂
⑴　实验材料
自然生长的烟草苗。
⑵ 实验器具
高压蒸汽灭菌锅、 超净工作台、 光照培养箱、 酒精灯、 镊子、 脱脂棉、 打火机、 量筒、 移液管、 锥形瓶( 灭菌) 、 培养皿( 灭菌) 、 无菌滤纸、 封口膜、 橡皮筋、 分析天平。
⑶ 实验药品和试剂
70%酒精、 20% NaClO、 无菌水, 培养基配制用药品见附件。
4.实验步骤
⑴ MS培养基的配置
烟草愈伤组织诱导培养基: MS + 6-BA 2 mg/L + NAA 2 mg/L + 蔗糖 30g/L + 琼脂 8 mg/L。
烟草愈伤组织诱导所用的培养基为MS基本培养基。各种MS母液和激素母液均按附件中的配方配制。
烟草愈伤组织诱导培养基按下表配制:
试剂
用量( 1000 ml)
MS无机大量元素( 20×)
50 ml
MS无机微量元素( 1000×)
1 ml
MS铜钴母液( ×)
0.5 ml
MS 有机( 200×)
5 ml
铁盐( 200×)
5 ml
蔗糖
30 g
水解酪蛋白
1 g
6-BA( 0.2 mg/ml)
10 ml
NAA (0.2 mg/ml)
10 ml
定容至1 L, 调pH为5.8, 后在加入
琼脂
8 g
高压蒸汽灭菌20分钟。同时应该对锥形瓶、 培养皿和滤纸进行灭菌。
灭菌完后, 待培养基冷却至60-70 ℃左右, 在超净工作台上将培养基分装至灭菌锥形瓶中, 每瓶约40 ml。然后置于平整的台面上让培养基凝固备用。
⑵ 外植体的选择和灭菌
选取幼嫩的烟草叶片, 撕成较小的碎片, 置于70%酒精中浸泡1-2min, 再置于20% NaClO中灭菌7-10 min。然后在超净工作台上用无菌水冲洗4-5次, 除去残留的消毒液。将烟草叶片置于无菌滤纸上吸干水分, 再用医用手术刀将叶片切成1 -2 cm2左右的小块, 接种于诱导培养基中。经过3周的诱导培养后, 即可挑取活力较好的愈伤组织用于继代培养。
⑶ 愈伤组织的诱导
将接种有烟草叶片的诱导培养基放至光照培养箱中培养。培养条件为26 ℃, 12小时光照/12小时黑暗。大约2-3天后能够见到烟草叶片增厚卷曲。5-6天后能够见到叶片边缘膨大开始出现愈伤组织。大约10天后愈伤组织比较明显。3周后能够得到很好的胚性愈伤组织, 也能够挑取活力较好的愈伤组织用于继代培养或其它后续操作, 如原生质体的培养和转基因等。
⑷ 实验数据的记录和分析
仔细观察植物细胞和组织脱分化的过程, 并拍照保存图片。统计叶片愈伤组织的诱导率。
5．思考题
⑴ 详细描述植物细胞和组织脱分化的过程, 并附上图片。
⑵ 简述植物组织培养的关键步骤。

附件:

附件1. MS 无机大量元素 (20×, g/L)
KNO3
38 g
NH4NO3
33 g
MgSO4·7H2O
7.4 g
CaCL2·2H2O
8.8 g(CaCL2,6.64 g)
KH2PO4
3.4 g

附件2. MS无机微量元素 (1000×, g/L)
MnSO4·4H2O
22.3 g (MnSO4·H2O,16.9 g)
ZnSO4·7H20
8.6 g
H3BO3
6.2 g

附件3. MS铜钴母液 ( ×,g/L)
CuSO4·5H2O
0.05 g
CoCL2·6H2O
0.05 g
KI
1.66 g
Na2MoO4·2H2O
0.5 g