大亚湾表层沉积物碳水化合物活性酶基因分布特征.pdf

热带海洋学报 JOURNAL OF TROPICAL OCEANOGRAPHY 2023 年 第 42 卷 第 5 期:7691 doi:10.11978/2022216 http:/ 大亚湾表层沉积物碳水化合物活性酶基因分布特征 孙翠慈1,2,岳维忠3,4,赵文杰1,5,王友绍1,2 1.热带海洋环境国家重点实验室(中国科学院南海海洋研究所),广东 广州 510301;2.大亚湾海洋生物综合实验站(中国科学院南海海洋研究所),广东 深圳 518121;3.海洋环境工程中心(中国科学院南海海洋研究所),广东 广州 510301;4.阳江海上风电实验室,广东 阳江 529500;5.中国科学院大学,北京 100049 摘要:微生物的碳水化合物活性酶(carbohydrate active enzymes,CAZymes)是海洋沉积物有机碳降解过程中的关键。文章基于大亚湾 2020 年春季表层沉积物的宏基因组数据,分析鉴定编码 CAZymes 序列种类及其在微生物中的分布,并预测了微生物群落对不同结构聚糖的利用。结果表明,表层沉积物微生物群落对不同结构聚糖的利用能力不同。-变形菌纲是编码降解肽聚糖和几丁质相关酶类序列的最大贡献者;-变形菌纲、拟杆菌门和浮霉菌门具有最高的 CAZymes 家族的-生态多样性(香浓指数),是编码降解结构复杂多糖(岩藻聚糖、昆布多糖、纤维素等)的 CAZymes 基因优势种群;酸杆菌是编码裂解寡聚半乳糖醛酸多糖酶序列的优势菌群。古菌对大部分 CAZymes 贡献低于 1%,但对编码降解纤维素和半纤维素的碳水化合物酯酶(carbohydrate esterase,CE)序列、结合模块(carbohydrate binding module,CBM)基因序列贡献较突出(贡献介于 2.18%11.1%)。CAZymes的底物主要源自于湾内自生的有机碎屑,降解藻源有机碎屑的 CAZymes序列的相对丰度于湾口高于湾东北部。与木质素降解相关的辅助活性家族(auxiliary activity families,AAs)序列相对丰度在湾东北部最高,主导的 AAs可能有助于增加木质纤维素的溶解度,进而提高糖苷酶对木质纤维素的生物利用度。大亚湾表层沉积物中微生物及其 CAZymes 序列组成主要与上层水体有机颗粒沉降以及水深相关。关键词:微生物;碳水化合物活性酶基因;沉积物;宏基因组;大亚湾 中图分类号:P735.4 文献标识码:A 文章编号:1009-5470(2023)05-0076-16 Distribution of the microbial Carbohydrate-Active enzymes genes in the surface sediment of the Daya Bay,China SUN Cuici1,2,YUE Weizhong3,4,ZHAO Wenjie1,5,WANGYoushao 1,2 1.State Key Laboratory of Tropical Oceanography(South China Sea Institute of Oceanology,Chinese Academy of Sciences),Guangzhou 510301,China;2.Daya Bay Marine Biology Research Station(Chinese Academy of Sciences),Shenzhen 518121,China;3.Marine Environmental Center(South China Sea Institute of Oceanology,Chinese Academy of Sciences),Guangzhou 510301,China;4.Yangjiang Offshore Wind Power Laboratory,Yangjiang 529500,China;5.University of Chinese Academy of Sciences,Beijing 100049,China Abstract:The microbial carbohydrate active enzymes(CAZymes)are important in the process of carbohydrate mineralization in marine sediment.In this study,metagenomic analysis is used to identify microbial CAZymes genes and predict glycan utilization in the surface sediments from the Daya Bay in spring.The microbial communities showed specific utilization for the different structure 收稿日期：2022-10-10;修订日期：2022-11-22。殷波编辑 基金项目：国家自然科学基金项目(42073078、U1901211);广东省基础与应用基础研究基金项目(2020A1515011137);国家重点研发计划项目(2017FY100700)作者简介：孙翠慈(1977),女,河北省辛集市人,副研究员,博士,从事海洋环境生态研究。email: 通信作者：王友绍。email: Received date:2022-10-10;Revised date:2022-11-22.Editor:YIN Bo Foundation item:National Natural Science Foundation of China(42073078,U1901211);Guangdong Basic and Applied Basic Research Foundation(2020A1515011137);National Key Research and Development Program of China(2017FY100707)Corresponding author:WANG Youshao.email: 孙翠慈等:大亚湾表层沉积物碳水化合物活性酶基因分布特征 77 1 glycans.Delta-proteobacteria were dominant for encoding CAZymes genes for the degradation of peptidoglycan and chitin.Gammaproteobacteria,Bacteroides and Planctomycetes were the dominant groups encoding CAZymes genes for the degradation of complex polysaccharides(fucoidan,laminarin,cellulose and hemicellulose),which was associated with their highest Shannon diversity of CAZymes families.Acidobacter was the primary contributors of CAZymes genes for cleaving oligo-galacturonic acid.The contributions of Archaea to most CAZymes genes were less than 1%,while their contributions of genes encoding carbohydrate esterase,binding module relating cellulose and hemicellulose degradation ranged from 2.18%to11.1%.According to the functional of glycoside hydrolases,the substrate of CAZymes were mostly derived from autochthonous debris,i.e.,bacterial sugars(peptidoglycans and-glucan),algal cell wall(fucoidan and laminarin)and chitin.The relative abundances of CAZymes genes in the mouth for the algal derived organic debris with complex chemical structure were higher than those in the east-northern of the bay.The relative abundances of Auxiliary Activity families(AAs)genes related to lignin degradation were the highest in the east-northern of the bay,and their dominant AAs may help to increase lignocellulose solubility and subsequently enhance the bioavailability of GHs to lignocellulose.The compositions of CAZymes genes were mainly related to the particulate organic matter deposition from water columns and the depth of water body.Key words:microbial community;carbohydrate-active enzymes genes;sediment;metagenome;Daya Bay 近岸海湾海域生产力高,沉降作用导致上层水体中富含各类多糖的藻类植物和动物残骸、有机碎屑以及陆源有机输入在沉积物中富集,为沉积物中的微生物提供了重要的有机碳源(Orsi et al,2018;Zheng et al,2021)。海洋微生物在碳水化合物的分解与合成过程中发挥关键作用,该过程受作用于各种糖复合物、寡糖和多糖等碳水化合物活性酶(carbohydrate-active enzymes,CAZymes)介导(Zhang et al,2018)。海洋中微生物群落产生的多糖水解酶的酶谱(针对底物)和酶活速率随空间分布和深度而变化,并且可以在聚集体形成等过程中发生变化(Balmonte et al,2021)。水体中参与多糖降解的微生物群落包括异养-变形菌(快速生长的机会主义者),能够迅速适应不断变化的可利用底物;拟杆菌门成员在自然水华发生过程中以及实验室培养浮游植物爆发期迅速增殖(Teeling et al,2012;Ben Francis et al,2021)。另外在-变形菌中,具有代谢多样性的玫瑰杆菌群落在近岸水域特别丰富,通常在浮游植物和颗粒物中丰度较高(Arnosti et al,2021)。在富含有机物的海洋沉积物中,底栖细菌的系统发育组成和生理代谢与水体中差异较大,底栖群落更适应于广泛的厌氧碳降解途径,可有效协同降解复杂的有机底物(Hoshino et al,2020)。近年来研究人员采用“组学”技术对 CAZymes 数据深度挖掘,在破译胞外聚合分泌物与微生物相互关系方面有了新的突破(Teeling et al,2012;Xing et al,2015;Smits et al,2017)。不同菌群对糖的代谢能力和途径存在差异,在水华不同发育期中 CAZymes 组成表现出类指纹模式(Teeling et al,2012;Teeling et al,2016),表现出独特的“糖生态位”(Francis et al,2021)。Silvia Vidal-Melgosa 等(2021)结合组学分析和糖基微阵列糖芯片技术,追踪大西洋北海硅藻赤潮爆发期间,不同化学组成糖类以及微生物 CAZymes 变化,发现CAZymes 中参与昆布多糖降解酶丰度远高于参与岩藻聚糖降解酶,导致岩藻聚糖大量富集,该研究验证了岩藻聚糖为惰性很强的多糖种类。岩藻聚糖多具有硫酸分支而具有黏性,是透明胞外聚合颗粒物的主要化学成分之一,可以通过凝集与吸附颗粒物增加海洋有机碳沉降通量,促进上层初级生产的有机碳向深层输运(Burd et al,2009),因此在沉积物中可能有大量岩藻聚糖富集,并对增加碳储存具有潜在作用。Sichert 等(2020)在 褐 藻 栖 息 地 收 集 到 的 一 株 疣 菌 门(Verrucomicrobiae)细菌 Lentimonas sp.,根据基因组数据分析参与岩藻聚糖降解的 CAZymes 酶高达 284 种(包括糖苷水解酶和碳水化合物酯酶和硫酸酯酶)。虽然近些年人们对海洋微 CAZymes 功能认知不断加深(Xing et al,2015;Koch et al,2019;Sichert et al,2020),但野外环境中 CAZymes 仍有很多未知或未被表征,特别是与上层水体中类似的研究相比,海洋沉积物中细菌 CAZymes 的生态多样性组成相关研究较少(Andrade et al,2017;Orsi et al,2018;Arnosti et al,2021)。本研究选取大亚湾海域沉积物为研究对象,开展微生物(细菌和古菌)碳水化合物活性酶生态多样性研究,确定 CAZymes 酶类组成及其在不同群落中的分布特征,对于理解微生物内部复杂的生态相互作用具有重要意义,同时有助于厘清对近海沉积物中复杂的78 热 带 海 洋 学 报 Vol.42,No.5/Sep.,2023 1 碳循环过程。1 材料与方法 1.1 调查海域及站位 大亚湾是我国典型的亚热带半封闭海湾,是南海北部向陆地延伸最深的海湾。本研究于 2020 年 4 月30 日在大亚湾海域设置 3 个采样点,站点经纬度见表1,其中 S1 站点设于受外海和珠江冲淡水影响明显的湾口;S5 站点设于大亚湾中部核电站附近海域;S11站点设于水动力较弱且沿岸有红树林分布的湾东北部。调查船为粤海渔 11094 号,现场使用抓斗采泥器采集表层沉积物,一部分样品(约 100g)立即放置18冰箱冷冻,后期用于环境参数分析,另一部分样品(约15g)用液氮保存用于宏基因组分析。表 1 调查期间大亚湾 3 个站位理化因子 Tab.1 Physical parameters during the sampling time 站位 S1 S5 S11 经度 1143759.88E 1143342.12E 114430.12E 纬度 223159.88N 223535.88N 22460.12N 水深/m 19.5 13.5 8.0 含水率/%38.2 35.1 62.4 砂土百分比/%13.4 5.9 0 粉砂土百分比/%64.9 71.9 62.7 黏土百分比/%21.7 22.2 37.54 平均粒径/m 6.4 6.4 7.59 中值粒径/m 6.6 6.3 7.49 总有机碳(TOC)/(%g1)0.500.02 0.470.01 1.630.05 硫化物含量/(g g1)33.411.12 81.82.37 218.75.49 总磷(TP)/(mgkg1)160.58.27 130.75.18 142.46.76 总氮(TN)/(mgkg1)214.58.1 248.89.3 441.612.8 TOC:TN 27.3 22.0 43.1 水体叶绿素浓度/(gL1)1.47 1.51 1.76 1.2 理化性质分析 环境理化参数包括沉积物含水率、粒径、总有机碳(total organic carbon,TOC)、总氮(total nitrogen,TN)、总磷(total phosphorus,TP)、硫化物和水体叶绿素含量。叶绿素、TN/TP、TOC、硫化物以及含水率测定分别采用海洋监测规范(GB17378.52007)(中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局和中国国家标准化管理委员会,2007)中的丙酮提取法、过硫酸钾消化法、重铬酸钾氧化还原容量法、亚甲基蓝分光光度法和重量法。粒度分析采用英国马尔文公司astersizer2000型激光衍射粒度分析仪。1.3 宏基因组数据分析 使 用DNA提 取 试 剂 盒(MP Biomedical,Cleveland,美 国)进 行 沉 积 物 DNA 提 取,使 用NanoDrop 2000 分光光度计评估 DNA 提取物的质量和完整性;采用 Illumina HiSeq 2500 高通量测序平台进行 PE150 测序,该序列在国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information,NCBI)库的登录号为:PRJNA884008。筛选拼接长度在500bp 以 上 的Scaftigs 进 行 后 续 分 析。采 用MetaGeneMark来预测开放阅读框(open reading frame,ORF),评 估预测 ORFs 的 数目、长度 等。采用FASTQC v0.11.8 和 Trimmomatic 对序列进行质控和评价(Davis et al,2013;Bolger et al,2014)。采用Linclust 软件进行基因聚类及去冗余。将非冗余基因集的序列与 NCBI-NR 数据库比对进行物种注释,获得物种注释信息,并结合基因丰度表获得各个分类层级 的 物 种 组 成 和 丰 度 信 息。使 用 dbCAN2 中HMMER 软件基于隐马尔科夫模型注释 CAZymes(Zhang et al,2018)。使用 BLASTP 将已注释获得的CAZymes 基因序列重新比对 NR 数据库(阈值为1105),使用物种注释软件 Metagenome Analyzer(MEGAN)对 上 述比 对结果 进行物 种注释,获取CAZymes 序列在不同物种中分布信息(Andrade et al,2017)。根据底物进行 CAZymes 功能分类,参照CAZy 库(http:/www.cazy.org)和 文 献 Cantarel 等(2012)、Orsi 等(2018)。计算每千碱基每百万的读取数值 RPKM(reads per kilobase per million mapped reads),RPKM=106(映射的读取数/千碱基对中的基因长度)/样本中的读取数,估计单个基因家族的归一化相对丰度。CAZymes 的-多 样 性 以 香 浓 指 数(Shannon 孙翠慈等:大亚湾表层沉积物碳水化合物活性酶基因分布特征 79 1 diversity)来表示(Baltar et al,2021)。采用限制性主 坐 标 分 析(constrained principal coordinate analysis,CPCoA)方法分析 CAZymes 家族在不同群落中的分布差异。2 结果 2.1 环境特征 大亚湾采样站点表层沉积物环境参数以及水体中叶绿素浓度的结果列于表 1。沉积物中总氮(TN)含量介 于214.5441.6mgkg1之 间,平 均 含 量 为301.6mgkg1;沉积物中总有机碳(TOC)含量在每克干重的 0.47%1.63%之间,平均含量为 0.87%;S11 站TOC、TN、硫化物以及含水量最高,TOC:TN 亦高于其他两站。大亚湾表层沉积物以粉砂与黏土质为主,中值粒径小。3 个站位间的水体叶绿素浓度介于 1.471.76gL1之间,分布较均匀。2.2 物种组成 通过宏基因组数据分析发现,调查期间细菌和古菌的物种比例分别为 80%和 2%,真核生物(主要为真菌)约占 1%。图 1 为不同微生物群落在原核微生物古菌、细菌和病毒(archaea,bacteria,and virus,ABV中所占比例分布图。变形菌门在细菌中占主导地位,平均占原核微生物的 53.37%,在纲级别上,-变形菌纲(Deltaproteobacteria,24.90%)和-变 形 菌 纲(Gammaproteobacteria,22.17%)占据最大优势(图 1),在目分类级别上,属于-变形菌纲的脱硫杆菌科(Desulfobacteraceae)为最大优势菌群,占原核微生物群落 的 14%。另 外 超 过 1%的 类 群 有 绿 弯 菌 门(Chloroflexi,5.74%)、酸 杆 菌 门(Acidobacteria,5.24%)、浮霉菌门(Planctomycetes,2.87%)、拟杆菌门(Bacteroidetes,1.53%)、硝化螺旋菌门(Nitrospirae,1.21%)和 芽 单 胞 菌 门(Gemmatimonadetes,1.15%)(图 1)。虽然 3 个站点具有相似的群落组成,但-变形菌纲在硫化物和有机质丰富的 S11站位具有较高的相对丰度,而-变形菌纲和绿弯菌门的分布呈湾外向湾内逐渐降低趋势。图 1 细菌门微生物群落在原核微生物中的百分比分布 Fig.1 The compositions of bacterial communities in the surface sediment of the Daya Bay in the phylum level 2.3 CAZymes 种类组成 直接参与碳水化合物降解的酶包括糖苷水解酶类(glycoside hydrolase,GHs)、多 糖 裂 解 酶 类(polysaccharide lyases,PLs)和碳水化合物酯酶类(carbohydrate esterases,CEs),此次调查编码三者的基因序列在 CAZymes 序列总丰度中占比分别为26.54%、2.40%和 16.92%。一般而言,CAZymes 中碳水化合物结合模块(carbohydrate-binding modules,CBMs)附加在糖苷水解酶上可增强糖苷酶催化活性,虽然 CBM 本身不具催化活性,但在大亚湾沉积物中占 有 相 当 比 例,为 总 CAZymes 基 因 总 丰 度 的16.75%。PLs 主要功能为裂解含酸性基团(糖醛酸或硫酸基团)的多糖,然而编码 PLs 基因的相对丰度比GHs、CBMs 和 CEs 序列低一个数量级。此外,80 热 带 海 洋 学 报 Vol.42,No.5/Sep.,2023 1 CAZymes 中涉及碳水化合物合成的酶类被归为糖基转移酶类(glycosyltransferases,GTs),此次调查 GTs序列占比 31.10%。辅助模块酶类(auxiliary activities associated with polysaccharide and lignin degradation,AAs)功能为参与各种氧化还原转化反应,该类序列在沉积物中的占比较小为 6.29%。与糖类 降 解 直 接 相 关 的 大 类 之 和(GHs+CBMs+CEs+PLs)在宏基因组中频率平均为 0.66%。用dbCAN 中 hmmer 软件对大亚湾沉积物微生物的碳水 化 合 物 酶(CAZymes)注 释 后,共 获 得 275 个CAZymes 家族种类,其中包含 100 种糖苷水解酶(GHs),68 种糖基转移酶(GTs),65 种碳水化合物结合模块(CBMs),18 种多糖裂解酶(PLs),16 种碳水化合物酯酶(CEs)和 8 种辅助模块酶类(AAs)。从整体来看,CAZymes 大类上的分布在站位间较一致。图 2 为 CAZymes 序列的相对丰度值 RPKM(在CAZymes 总丰度中占比超 0.5%以上的种类),其中大部分 GTs 酶类和 AAs 序列的 RPKM 表现为 S11站 位 最 高,而 编 码 糖 苷 水 解 酶 GH13、GH3、GH29、GH33、GH16、GH78 以及碳水化合物酯酶序列的相对丰度表现为湾口高于湾顶部的趋势(CAZymes 酶的主要功能见补充表 S1)。图 2 大亚湾沉积物中优势 CAZymes种类的基因序列相对丰度(RPKM)优势 CAZymes种类指总丰度占比大于 0.5%的 CAZymes序列 Fig.2 The relative abundances(RPKM)of the TOP CAZymes genes(0.5%)以序列相对丰度占糖苷水解酶 GHs 序列总丰度2%来划分,糖苷水解酶家族中占据优势的水解酶序列丰度从大到小依次排序为 GH23、GH13、GH3、GH29、GH33、GH109、GH130、GH16、GH5、GH77、GH103 和 GH78(图 3a)。丰度最高的糖苷水解酶 GH23 和 GH103 与肽聚糖(细菌细胞壁主要成分)代谢相关,两者序列丰度在所有 GHs 丰度中百分比分别为 16.7%和 2.3%(图 3a)。GH13(-1,4-D葡萄糖苷酶)在 GHs 中占 10.9%(图 3a),其底物主要来源于细菌体内储存的-1,4-D-葡聚糖。GH3(寡聚-葡萄糖苷酶)、GH16(长链-葡萄糖苷酶)和 GH5都涉及-葡聚糖降解(如昆布多糖和纤维素等),三者序列丰度在总 GHs 基因序列中占比 6.7%、3.3%和2.8%(图 3a),昆布多糖属于海洋水体中最为丰富的多糖之一,多来源硅藻。编码 GH29(外切-L-岩藻糖苷酶)、GH78(鼠李糖苷酶)和 GH130(-甘露聚糖酶)的序列丰度在 GHs 总丰度中百分比依次为 5.2%、3.0%及 1.9%(图 3a),三者水解酶参与降解的藻类细胞壁和细菌胞外分泌物主要存在于透明胞外聚合颗粒物(transparent exopolymer particles,TEP)和海洋雪中。另外本研究发现 GH107(岩藻聚糖内切酶)的序列存在于沉积物样品中,但丰度远低于 GH29 和GH95,在 S11、S5 和 S3 站位中编码 GH107 序列丰度在总 GHs 中百分比分别为 0.012%、0.025%和0.025%。GH109 为 N-乙酰氨基己糖苷酶,其底物为细菌细胞壁成分或几丁质寡聚糖,作用于 N-乙酰-D-己糖胺末端非还原 N-乙酰-D-己糖胺残基的水解,另外 GH33 主要功能为乙酰神经氨酸(唾液酸)水解孙翠慈等:大亚湾表层沉积物碳水化合物活性酶基因分布特征 81 1 酶,负责寡糖、糖蛋白、糖脂、多香酸等底物中末端唾液酸残基-(23)-、-(26)-、-(28)-糖苷键的水解,其底物多来源于富含黏多糖的动物,如胶质类浮游动物和鱼类等,在沉积物中丰富的 GH33 反映了上层浮游动物或底栖动物等有机碳来源对表层沉积物 CAZymes 组成影响明显。图 3 参与碳水化合物降解的优势 CAZymes序列组成分布 a.糖苷水解酶基因(GHs);b.碳水化合物酯酶基因(CEs);c.多糖裂解酶基因(PLs);d.碳水化合物结合模块基因(CBMs);e.辅助模块酶类基因(AAs)Fig.3 Compositions of the dominant CAZymes genes in the surface sediment of the Daya Bay.(a)GHs;(b)CEs;(c)PLs;(d)CBMs;(e)AAs 82 热 带 海 洋 学 报 Vol.42,No.5/Sep.,2023 1 碳水化合物酯酶序列的丰度依次为 CE1、CE10、CE4、CE14、CE7、CE3、CE6 及 CE11(图 3b)。这些家族包含许多酶功能,包括肽聚糖、木聚糖、几丁质和硫酸岩藻聚糖等多糖的脱乙酰化。另外 CE1 还 包 含 了 降 解多 聚 物 如 聚 羟 基 丁 酸 酯(polyhydroxybutyrate,PHB)解聚酯酶(图 3b)。多糖裂解酶家族中编码 PL22(底物为寡聚半乳糖醛酸,为果胶降解产物)序列丰度最高(图 3c),占据 PLs 序列总丰度的 42.2%,其次为编码 PL9、PL1、PL12、PL15、PL14和 PL6。PL22、PL9和 PL1都涉及果胶裂解,三者之和占总 PLs 丰度的 72.9%(图 3c),而 PL15、PL14和 PL6为海藻酸裂解酶,PL12为肝素裂解酶。由此可知,调查期间大亚湾表层沉积物中酸性多糖是以带半乳糖醛酸基团的果胶类酸性多糖为主,而海藻酸多糖含量较低。碳水化合物结合模块(CBMs)附加在糖苷水解酶上可以增强糖苷酶催化活性,CBMs 丰度排序依次为 CBM50、CBM44、CBM48、CBM40、CBM9和 CBM66(图 3d),其指示意义包含了与肽聚糖结合的 CBM50(对应的水解酶为 GH23、GH73)、与GH13 的结合模块 CBM48、涉及昆布糖、纤维素和半纤维素(-葡聚糖和木聚糖)降解的结合模块 CBM44和 CMB9、与 GH33 结合的 CBM40 等。因此沉积物中 CBMs 的组成与糖苷水解酶家族优势种类组成在功能分布上具有吻合特征。辅助模块酶类(AAs)类目前包括木质素分解酶家族和分解多糖单加氧酶家族。它们不会直接作用于碳水化合物,但由于其始终与植物细胞壁中的碳水化合物(纤维素和半纤维素)密切相关,因此 CAZy 数据库根据氨基酸序列相似性对这些酶在家族和亚家族中进行了分类,旨在反映结构特征并促进基因组注释。此次调查发现在总 CAZymes 占比超过 1%的 3 种 AAs类序列有 AA6、AA2 和 AA7(低聚葡萄糖氧化酶),其次是 AA4(香草醛醇氧化酶)。AA6(31.9%)、AA2(28.7%)和 AA4(11.1%)都参与了木质素降解。AA2家族是锰过氧化物酶,是参加木质素降解的主要酶类之一(图 3e)。木质素的结构是芳香族的高分子化合物,芳香环基团被过氧化开环后会形成较多的苯醌基团,AA6 家族酶的特征为 1,4-苯醌还原酶,催化由烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate,NADPH)介导的对苯醌转化为对苯二酚,中间过程产生过氧化物促进长链有机分子的氧化裂解,可增加不可溶的木质素和纤维素等大分子在水体中的溶解性,为纤维素水解酶提供更多的作用位点,从而提高木质纤维素的降解效率。2.4 CAZymes 基因序列在微生物群落中的分布特征 图 4 为 CAZymes 家族在不同微生物群落(细菌和古菌)中的差异分布。根据 CAZymes 家族在不同群落中的香浓指数来表示其-多样性,结果表明 CAZymes的-生态多样性从高到低依次为浮霉菌门、拟杆菌门、-变形菌门、绿弯菌门、疣菌门、螺旋体门、-变形菌门、厚壁菌门及酸杆菌门(图 4a),且上述群落的-生态多样性指数显著高于古菌、放线菌门和蓝细菌门等群落(p 中部(S5)湾口(S1)的变化趋势,而-变形菌纲则正好 相反。图 6 编码 GH(23,13,3,29,109,33,16,78)、CBM(40,44,48,50)、CE1和 PL22的基因序列在微生物群落中分布 Fig.6 Contributions of the microbial communities to GH(23,13,3,29,109,33,16,and 78),CBM(40,44,48,and 50),CE1 and PL22 genes abundances 拟杆菌门和浮霉菌门是 GH29(岩藻聚糖糖苷酶)、GH33(黏多糖水解酶,催化唾液酸与糖蛋白之间糖苷键的水解)和 CBM40(GH33 的辅助模块)、GH109(氨基聚糖水解酶)和 GH78(鼠李糖苷酶)基因序列的主要贡献者。对于 GH29 和 GH78 家族而言,拟杆菌门是其最大来源(图 6),主要由黄杆菌纲Flavobacteriia、拟杆菌纲 Bacteroidia 等组成;其次是Kiritimatiellaeota 门,该门在此次调查尽管 Cazymes 种类多样性非常低,然而对 GH29 和 GH78 序列的贡献占比分别为 15.27%和 13.47%(图 6)。浮霉菌门对孙翠慈等:大亚湾表层沉积物碳水化合物活性酶基因分布特征 85 1 GH33、CBM40、GH29 和 GH109 序列的贡献分别29.23%、33.98%、13.08%和 21.48%(图 6)。对GH109 序列贡献较大的细菌其次为-变形菌门(12.24%,S11 S5 S1)、绿弯菌门(9.17%,S1 S5 S11)、拟杆菌(8.22%,S1 S5 S11)和-变形菌门(5.89%)。上述 CAZymes 是参与岩藻聚糖和几丁质或糖胺黏多糖等具有较强惰性且结构复杂的多糖降解,因此,大亚湾表层沉积物中拟杆菌门、浮霉菌门、-变形菌纲和酸杆菌门是降解结构较复杂多糖的主要贡献者(图 6)。对于涉及含-葡聚糖或木聚糖的纤维素、半纤维素以及昆布多糖的水解酶,-变形菌纲的贡献最高,如参与降解的-葡聚糖 CE1、GH16、GH3 和CBM44在-变形菌纲分布远高于-变形菌纲,贡献值分别为 27.73%、35.62%、28.43%和 17.03%(图 6),-变形菌纲主要由着色菌目(Chromatiales)、纤维弧菌目(Cellvibrionales)、交替单胞菌目(Alteromonadales)和海洋螺菌(Oceanospirillales)等组成。其次拟杆菌和-变形菌纲对 GH16、GH3 和 CE1 的也具有一定程度的 贡 献。特 殊 之 处 在 交 替 单 胞 菌 目 下 发 现Mangrovitalea sediminis,这表明大亚湾底层降解有机碳的微生物可能来源于周围红树林。对于丰度远高于其他多糖裂解酶的 PL22,酸杆菌门是寡聚半乳糖醛酸裂解酶 PL22 的主要贡献者(34.8%)(图 6),体现出其适应酸性有机底物的特性。此次发现古菌对大部分 CAZymes 种类的贡献值基本都小于 1%,但以深古菌(Bathyarchaeota)为代表的古菌对 CBM和 CE 中的优势种类贡献较为突出,分别为 CE1(2.18%)(图 6)、CBM40(5.29%,与 GH33 结合)(图 6)和 CBM44(11.40%,与 GH16 等纤维素或木聚糖水解酶结合)(图 6)。对糖苷水解酶贡献较显著的为 GH31(2.83%)和 GH33(2.74%)(图 6),其他的糖苷水 解 酶 类 包 含 GH10、GH20、GH24、GH29、GH109、GH106、GH74 和 GH43 等在内共计 21 种糖苷水解酶,这些酶类功能主要包括对纤维素、半纤维素(木聚糖)和氨基糖(溶菌酶和几丁质降解产物)的水解。大亚湾表层沉积物病毒 CAZymes 序列反映了病毒侵染特性。一般而言,噬菌体病毒侵染寄主首先吸附在寄主细胞壁上,通过溶菌酶的作用在细菌的细胞壁上打开一个缺口然后进行“侵入”。因此表层沉积物中 病 毒 CAZymes 序 列 以 编 码 溶 菌 酶(GH104、GH23、GH19、GH24 和 GH73)或神经氨酸酶 GH33及其相关的 CBM40为主。从区域分布来看,湾顶部 S11 样品中的-变形菌纲在群落组成中百分比最高,而绿弯菌门在 S11 中百分比最低(图 1),这两个门包含的 CAZymes 序列同样呈现相似的分布规律,如 GH23 和 CBM50 在-变形菌纲中的分布在 S11最高(图 6),而针对编码-葡聚糖降解的酶基因序列而言,绿弯菌门则在 S11 中百分比最低(图 6)。3 讨论 与以往大亚湾沉积物调查相比,本次调查总有机碳与以往研究结果含量水平相当,而总氮与总磷含