大竹米酒滋味品质与细菌类群的关联性分析.pdf

生物工程 食品科学 2023,Vol.44,No.18 231大竹米酒滋味品质与细菌类群的关联性分析向凡舒1,2，蔡文超1,2，郭 壮2，刘慧杰3，余海燕4，单春会1,*（1.石河子大学食品学院，新疆特色果蔬贮藏加工教育部工程研究中心，新疆 石河子 832000；2.湖北文理学院 湖北省食品配料工程技术研究中心，湖北 襄阳 441053；3.北京忠和房县生物食品有限公司，湖北 十堰 442100；4.湖北庐陵王酒业有限责任公司，湖北 十堰 442100）摘 要：为揭示大竹米酒滋味品质与细菌类群的关联性，在采用电子舌对其各滋味指标进行数字化评价的基础上，进一步对有机酸和氨基酸的种类及含量进行解析，同时对其蕴含的乳酸菌类群进行分离鉴定，并采用MiSeq高通量测序技术对其细菌类群进行了揭示和功能预测，最后对各滋味指标与细菌类群的相关性进行计算。结果显示，大竹米酒在咸味、酸味和苦味指标上的差异较大，米酒中含有7 种有机酸和15 种氨基酸，其中有机酸以乳酸（8.82 mg/g）和乙酸（6.27 mg/g）为主，氨基酸以谷氨酸（8.06 mg/g）、亮氨酸（4.10 mg/g）和天冬氨酸（3.94 mg/g）为主。通过纯培养共分离出14 株乳酸菌，鉴定为5 个种，分别为发酵乳杆菌（Limosilactobacillus fermentum，4 株）、戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus，4 株）、副干酪乳杆菌（Lacticaseibacillus paracasei，2 株）、植物乳杆菌（Lactiplantibacillus plantarum，2 株）和假肠膜明串珠菌（Leuconostoc pseudomesenteroides，2 株）。高通量测序结果表明，厚壁菌门（Firmicutes）和变形菌门（Proteobacteria）为平均相对含量大于1.0%的细菌门，累计含量达96.93%；乳酸杆菌属（Lactobacillus）、片球菌属（Pediococcus）、魏斯氏菌属（Weissella）、乳球菌属（Lactococcus）、明串珠菌属（Leuconostoc）和不动杆菌属（Acinetobacter）为平均相对含量大于1.0%的细菌属，累计含量达89.43%。相关性分析表明，Weissella与后味A、涩味和苦味等滋味指标存在显著负相关（P0.05）。由此可见，大竹米酒中有机酸以乳酸和乙酸为主，氨基酸以谷氨酸、亮氨酸和天冬氨酸为主，细菌类群以Lactobacillus、Pediococcus和Weissella等乳酸菌为主，且Weissella对米酒品质的形成具有积极意义。关键词：米酒；电子舌；有机酸；氨基酸；细菌类群Correlation between Taste Quality and Bacterial Community of Dazhu Rice WineXIANG Fanshu1,2,CAI Wenchao1,2,GUO Zhuang2,LIU Huijie3,YU Haiyan4,SHAN Chunhui1,*(1.Engineering Research Center for Storage and Processing of Xinjiang Characteristic Fruits and Vegetables,Ministry of Education,College of Food Science,Shihezi University,Shihezi 832000,China;2.Hubei Provincial Engineering and Technology Research Center for Food Ingredients,Hubei University of Arts and Science,Xiangyang 441053,China;3.Beijing Zhonghe Fangxian Bio-Food Co.Ltd.,Shiyan 442100,China;4.Hubei Lulingwang Wine Industry Co.Ltd.,Shiyan 442100,China)Abstract:This study was undertaken to reveal the correlation between the taste quality and bacterial community of Dazhu rice wine.Taste attributes were measured using an electronic tongue,the types and contents of organic acids and amino acids were analyzed,and lactic acid bacteria were isolated and identified from the rice wine.Moreover,analysis and functional prediction of its bacterial community were carried out using MiSeq high-throughput sequencing technology.Finally,the correlation between various taste attributes and bacterial community was calculated.The results showed that Dazhu rice wine varied widely in terms of saltiness,sourness and bitterness.The rice wine contained seven organic acids and 15 amino acids,the predominant organic acids being lactic acid(8.82 mg/g)and acetic acid(6.27 mg/g),and the predominant amino acids being glutamic acid(8.06 mg/g),leucine(4.10 mg/g)and aspartic acid(3.94 mg/g).A total of 14 lactic acid bacteria were isolated by pure culture and identified as five species,namely Limosilactobacillus fermentum(four strains),收稿日期：2022-08-29基金项目：新疆建设兵团中青年领军人才项目（2020CB025）；南疆重点产业支撑计划项目（2018DB002）；湖北文理学院教师科研能力培育基金“科技创新团队”项目（2020kypytd009）第一作者简介：向凡舒（1998）（ORCID:0000-0002-7151-5672），女，硕士研究生，研究方向为农产品加工。E-mail:*通信作者简介：单春会（1978）（ORCID:0000-0003-1896-3502），男，教授，博士，研究方向为农产品加工。E-mail:sch_232 2023,Vol.44,No.18 食品科学 生物工程Pediococcus pentosaceus(four strains),Lacticaseibacillus paracasei(two strains),Lactiplantibacillus plantarum(two strains)and Leuconostoc pseudomesenteroides(two strains).High-throughput sequencing results showed that the average relative contents of Firmicutes and Proteobacteria were greater than 1.0%,with a cumulative content of 96.93%;the relative contents of Lactobacillus,Pediococcus,Weissella,Lactococcus,Leuconostoc and Acinetobacter were greater than 1.0%,with a cumulative content of 89.43%.Correlation analysis showed a significant negative correlation(P 0.05)between Weissella and taste indicators such as aftertaste A,astringency and bitterness.These findings showed that the major organic acids in Dazhu rice wine were lactic acid and acetic acid,that the major amino acids were glutamic acid,leucine and aspartic acid,and that bacterial community was dominated by lactic acid bacteria such as Lactobacillus,Pediococcus and Weissella.Weissella could have a positive significance on the formation of rice wine quality.Keywords:rice wine;electronic tongue;organic acids;amino acids;bacterial community structureDOI:10.7506/spkx1002-6630-20220829-347中图分类号：TS201.3 文献标志码：A 文章编号：1002-6630（2023）18-0231-08引文格式：向凡舒,蔡文超,郭壮,等.大竹米酒滋味品质与细菌类群的关联性分析J.食品科学,2023,44(18):231-238.DOI:10.7506/spkx1002-6630-20220829-347.http:/XIANG Fanshu,CAI Wenchao,GUO Zhuang,et al.Correlation between taste quality and bacterial community of Dazhu rice wineJ.Food Science,2023,44(18):231-238.(in Chinese with English abstract)DOI:10.7506/spkx1002-6630-20220829-347.http:/米酒，又称醪糟，其作为国酒的起源，酿造历史源远流长1，因酒香浓郁、口感甘甜和营养丰富，深受中国和日本等亚洲国家人群的喜爱2。在米酒的发展历程中，相关从业人员对其酿造工艺进行了许多创新，例如在米酒制作中添加其他原料，增添营养组分或提升风味3；使用酵母和酶制剂代替传统米酒曲进行纯种发酵，减少能耗，提高效率4。除了酿造工艺，微生物对米酒品质的形成亦发挥了关键作用5，因而许多科研人员开始解析米酒和米酒曲中的微生物群系。通过比较江苏苏州与湖北宜昌地区米酒的微生物类群，Lu Yucai等6发现苏州米酒中的真菌以扣囊覆膜酵母（Saccharomycopsis fibuligera）和米根霉（Rhizopus oryzae）为主，宜昌米酒以米根霉和异常威克汉姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）为主；两个地区米酒中的细菌均以柠檬酸杆菌属（Citrobacter）和微小杆菌属（Exiguobacterium）为主，且细菌多样性要显著大于真菌多样性。Zhao Xinxin等7对湖北、四川和广西地区米酒曲的细菌群落结构进行解析，结果发现它们的细菌组成较为相似，均以魏斯氏菌属（Weissella）为主，但在细菌结构上，湖北和四川地区的米酒曲更为相似，广西地区较为不同。此外，日本的一项研究发现，即便在使用以酵母为主的发酵剂发酵时，米酒中仍存在着较多的细菌类群8。上述研究表明米酒和米酒曲中的微生物形成可能受到了原料来源、地域环境和发酵过程等多重因素的影响，且细菌在米酒的发酵过程中发挥了不可或缺的作用。我国四川省大竹县拥有“醪糟之乡”的美誉，当地米酒被列入在我国国家地理标志产品名列之中。然而目前针对大竹米酒的研究还鲜见报道，因而全面解析大竹米酒的品质以及细菌群落结构十分必要。随着技术的不断更新，电子舌等一系列仿生设备凭借其检测快速和数据实时监测等特点逐渐取代了冗长而费力的常规检测方法，在食品质量检测领域占据了极大的优势9。Illumina MiSeq是实现测序高效、准确且低成本的理想平台，亦是使用最为广泛的第二代测序平台之一，在医学、生物和农业领域均被广泛应用10。目前也作为解析大曲11、泡菜12和黄酒13等众多发酵食品微生物类群的主要方法之一。本研究在使用电子舌对大竹米酒滋味品质实现数字化评价的基础上，对其有机酸和游离氨基酸种类及含量进行测定，采用纯培养法对其中的乳酸菌进行分离鉴定和保藏，结合MiSeq高通量测序技术解析其细菌群落结构，并对细菌菌群与滋味品质间的关联性进行探究，最后将大竹米酒与恩施米酒的细菌群落结构及菌群功能进行比较分析，以期为推动当地米酒的产业化发展提供一定的理论参考依据，对农产品推广起到一定的积极影响。1 材料与方法1.1 材料与试剂米 酒 于 2 0 2 1 年 5 月 采 集 自 四 川 省 大 竹 县（E1065910732，N30203100）西门综合市场和兴光农贸市场。M R S 合 成 培 养 基 青 岛 海 博 生 物 技 术 有 限公司；宏基因组DNA提取试剂盒 德国QIAGEN生物工程 食品科学 2023,Vol.44,No.18 233公司；10Buffer、dNTP缓冲液、Taq DNA聚合酶 和 T 载 体 宝 生 物 工 程（大 连）有 限 公 司；正/反向引物338F/806R（正向引物序列338F：5-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3；反向引物序列806R：5-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3）上海桑尼生物科技有限公司。1.2 仪器与设备SA402B电子舌（配备传感器CA0、C00、AE1、CT0、AAE、GL1和2 个参比电极）日本Insent公司；PHS-3C数显台式酸度计 上海越平科学仪器有限公司；LC-20ADXR高效液相色谱仪 日本岛津公司；Biochrom 30全自动氨基酸分析仪 英国Biochrom公司；Vetiri梯度基因扩增仪 美国AB公司；UVPCDS8000凝胶成像分析系统 美国Bio-Rad公司；R930机架式服务器 美国Dell公司；MiSeq高通量测序平台 美国Illumina公司。1.3 方法1.3.1 样品采集及处理从四川大竹县西门综合市场和兴光农贸市场共采集米酒样品7 份，编号为DZ1DZ7。所采集的样品均为当地农户家庭制作，制作步骤如下：首先将糯米浸泡6 h，然后进行蒸饭、摊凉和淋饭，待其温度降至32 时加入研磨成粉的米酒曲拌匀，之后将米饭装入容器中铺平并轻轻压实，中心处挖一个洞，接着在容器口盖上纱布，最后用棉被包裹整个容器保温发酵23 d。当米酒发酵好后，中心的洞会盛有汁水。将采集到的样品分别装入无菌采样袋中低温下运送回实验室，置于40 冰箱中备用。1.3.2 米酒滋味品质的数字化评价样品预处理：称取30 g米酒样品于烧杯中，加入120 mL纯水，搅拌均匀后转移至200 mL离心杯，5 000 r/min离心10 min，取上清液进行抽滤，将收集到的滤液置于40 备用。之后参照王玉荣等14方法使用电子舌对米酒的滋味指标进行测定。1.3.3 米酒pH值和有机酸组分及其含量测定参照酸度计使用说明书，使用pH 6.86和pH 4.00的标定液对酸度计进行两点标定，继而测定米酒的pH值。有机酸含量测定样品前处理：称取10.0 g米酒样品置于研钵中研碎后，将其转移至50 mL容量瓶中，使用流动相（0.01 mol/L K2HPO4溶液）定容，充分混匀后吸取1.5 mL匀液至2 mL EP管中，12 000 r/min离心3 min，取上清液使用0.22 m滤膜过滤备用。参照王丹丹等15的方法制备7 种有机酸（草酸、酒石酸、苹果酸、乳酸、乙酸、柠檬酸和琥珀酸）的标准溶液，并采用高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）法对有机酸组分及含量进行测定。1.3.4 氨基酸组分及其含量测定样品前处理方法参照GB 5009.1242016食品中氨基酸的测定，预处理完成后参照马佳佳等16的方法将样品上机检测。1.3.5 乳酸菌分离、纯化和鉴定参照张振东等17的方法对米酒中乳酸菌菌株进行初步筛分并保藏，提取疑似乳酸菌菌株DNA，对序列进行聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）扩增、产物清洁和连接转化，最后挑取阳性克隆子送至上海桑尼生物科技有限公司进行测序。将测序返回的序列上传至NCBI网站（https:/blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）进行序列比对确定其物种信息。1.3.6 样品宏基因组DNA提取、PCR扩增及测序使用试剂盒提取米酒中细菌的宏基因组DNA，提取的DNA置于20 备用。在对序列进行PCR扩增前，先在引物中添加核苷酸标签（barcode），之后参照王玉荣等18的方法对总DNA的16S rRNA V3V4区域进行扩增，将检测合格的PCR产物寄至上海美吉生物医药科技有限公司完成测序。1.3.7 生物信息学分析本研究采用QIIME平台（v1.9.0）进行生物信息学分析。首先将测序返回的双端序列进行拼接和归并，剔除错配率0.2、引物碱基错配数2 bp或barcode碱基有错配的低质量序列19，使用UCLUST两步法对有效序列按照100%和97%相似度构建可操作分类单元（operational taxonomic units，OTU）20，删除含有嵌合体的OTU21，选取代表性序列在数据库22-24中进行比对并确立其生物分类学地位；计算各样品中细菌类群的多样性指数，基于非加权的UniFrac距离解析大竹米酒与恩施米酒细菌类群的多样性；采用PICRUSt（phylogenetic investigation of communities by reconstruction of unobserved states）软件对大竹米酒与恩施米酒的细菌基因功能进行预测25。1.4 数据处理与分析使用R软件（v 4.1.1）绘制小提琴图、气泡图、热图和哑铃图；使用MAGE7软件构建乳酸菌菌株系统发育树；使用Origin 2019软件制作主坐标分析（principal co-ordinates analysis，PCoA）散点图和主成分分析（principal component analysis，PCA）得分图；使用SAS（v8）软件计算优势细菌与滋味品质间的相关性系数，并使用Cytoscape（v3.7.2）软件绘制相关性网络图；利用在线作图网站（http:/huttenhower.sph.harvard.edu/galaxy/）制作LEfSe图；采用Mood-median检验法计算显著性。234 2023,Vol.44,No.18 食品科学 生物工程2 结果与分析2.1 大竹米酒滋味品质评价及有机酸和氨基酸种类和含量分析首先利用电子舌对大竹米酒的滋味品质进行数字化评价，继而对其有机酸及游离氨基酸含量进行测定。由图1A可知，大竹米酒在咸味、酸味和苦味指标上的差异较大，而在后味A、后味B和丰味指标上的差异较小。由图1B可知，大竹米酒的pH值在3.594.06之间；乳酸是大竹米酒中含量最丰富的有机酸，平均含量达8.82 mg/g，其次为乙酸、琥珀酸和柠檬酸，平均含量分别为6.27、3.75 mg/g和2.63 mg/g，而苹果酸和草酸含量较低。由图1C可知，在7 份米酒中共检测出15 种氨基酸，平均氨基酸总量达39.6 mg/g。其中包含7 种必需氨基酸，累计平均含量为14.5 mg/g，非必需氨基酸累计平均含量为25.1 mg/g；谷氨酸是大竹米酒中含量最高的氨基酸（8.06 mg/g），其次为亮氨酸（4.10 mg/g）和天冬氨酸（3.94 mg/g）等，缬氨酸含量最低（0.576 mg/g）。?2030A20100?10?A?B?520B151050pH?/?mg/g?pH?DZ1DZ2DZ3DZ4DZ5DZ6DZ7C?*?*?*?*?*?*?*?/?mg/g?0.250.500.751.00A、B小提琴方框中黑色实线代表平均值，小提琴中黑色实心点代表异常值，下同；C中*为必需氨基酸。图 1 大竹米酒各滋味指标相对强度（A）、有机酸（B）和 氨基酸（C）含量分析Fig.1 Relative intensity of taste attributes(A),and organic acid(B)and amino acid(C)contents of Dazhu rice wine2.2 基于纯培养技术大竹米酒中乳酸菌的分离和鉴定本研究进一步对大竹米酒中的乳酸菌进行分离，并对菌株进行纯化保藏和鉴定。从7 份大竹米酒中共分离出14 株疑似乳酸菌菌株，样品DZ1DZ7中分别分离出1、1、3、4、1、2 株和2 株。选取了其中3 株分离株的菌落形态和镜检形态进行呈现，并依据所有分离株的鉴定序列构建了系统发育树。由图2A可知，米酒中的分离株菌落颜色均为白色，表面光滑且湿润，但形状各异。菌株DZ2-1菌落呈圆形，较扁平，周围透明圈较大；菌株DZ3-3菌落呈圆形，较隆起，周围透明圈较小；菌株DZ4-4菌落呈水滴形，较隆起，周围无明显透明圈。由图2B可知，菌株DZ2-1细胞形态为球形，菌株DZ3-3为短杆状，而菌株DZ4-4为短棒状。由图2C系统发育树可知，14 株分离株共鉴定到5 个种，2 株被鉴定为副干酪乳杆菌（Lacticaseibacillus paracasei），2 株被鉴定为植物乳杆菌（Lactiplantibacillus plantarum），4 株被鉴定为发酵黏液乳杆菌（Limosilactobacillus fermentum），2 株被鉴定为假肠膜明串珠菌（Leuconostoc pseudomesenteroides），4 株被鉴定为戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus），均属于乳酸菌类群。A1A2A3B1B2B30.0573CDZ7-1DZ3-1DZ3-3DZ4-2DZ4-4DZ5-1DZ6-2DZ2-1DZ6-1DZ7-2DZ1-1DZ3-2DZ4-3DZ4-1L.paracasei R094?NR025880?L.plantarum JCM1149?LC064896?L.fermentum NBRC15885?NR113335?L.pseudomesenteroides JCM9696?LC096220?P.pentosaceus DSM20336T?KX886792?954810097495792578696975661下标1、2、3分别为菌株DZ2-1、DZ3-3和DZ4-4。图 2 大竹米酒中乳酸菌菌落形态（A）、显微镜形态（B）及 系统发育树（C）Fig.2 Colony morphology(A),microscopic morphology(B)and phylogenetic tree(C)of lactic acid bacteria in Dazhu rice wine生物工程 食品科学 2023,Vol.44,No.18 2352.3 基于MiSeq技术大竹米酒细菌类群解析在对大竹米酒中乳酸菌进行了初步分析后，进一步采用MiSeq高通量测序技术对其细菌群落结构进行解析，7 份米酒样品通过测序共得到345 083 条序列，经质控后去除2 399 条低质量序列，余下342 684 条高质量序列，平均每个样品约含有48 954 条序列。所有高质量序列共鉴定到了14 个门、39 个纲、61 个目、123 个科和194 个属，分别从细菌门和属水平上进行了解析，并将相对含量大于1.0%的细菌门和属定义为优势门和属。由图3A可知，大竹米酒中有2 个优势门，分别为厚壁菌门（Firmicutes，91.65%）和变形菌门（Proteobacteria，5.28%），累计相对含量达96.93%，且Firmicutes为DZ2、DZ6和DZ7样品中唯一优势门。由图3B可知，大竹米酒中有6 个优势属，分别为乳杆菌属（Lactobacillus，66.83%）、Pediococcus（9.23%）、Weissella（5.42%）、乳球菌属（Lactococcus，4.47%）、明串珠菌属（Leuconostoc，2.17%）和不动杆菌属（Acinetobacter，1.31%），累计相对含量达89.43%，但仅有Lactobacillus在所有样品中的相对含量均大于1.0%。除了在样品DZ2中以Pediococcus（56.74%）为含量最高的菌属，其他样品中含量最高的菌属均为Lactobacillus。需要说明的是，Zheng Jinshui等26对Lactobacillus进行重新分类后划分出了23 个新属，其中就包括在2.2节出现的Limosilactobacillus、Lacticaseibacillus和Lactiplantibacillus，然而这些信息目前还未在QIIME分析平台的RDA、Greengenes和SILVA数据库中进行更新，因而本研究基于MiSeq高通量测序注释出的Lactobacillus包含了所有新属。?ProteobacteriaFirmicutesDZ1 DZ2 DZ3 DZ4 DZ5 DZ6 DZ7A25%50%75%?AcinetobacterLeuconostocLactococcusWeissellaPediococcusLactobacillusDZ1 DZ2 DZ3 DZ4 DZ5 DZ6 DZ7B25%50%75%图 3 大竹米酒中优势细菌门（A）和属（B）分布情况及相对含量Fig.3 Distribution and relative content of dominant bacterial phyla(A)and genera(B)in Dazhu rice wine我国湖北省恩施土家族苗族自治州生态环境良好，物种资源丰富，当地传统发酵食品种类众多，例如酱豆27、米酒曲28和米酒19等，因而本研究在MG-RAST数据库中下载了团队此前研究的10 份恩施米酒样品序列19，进一步比较分析大竹地区与恩施地区米酒菌群结构的多样性和多样性。如图4A、B可知，大竹米酒与恩施米酒的平均Chao1指数分别为1 111和506，平均Shannon指数分别为4.18和1.90，两地区米酒Chao1指数差异极显著（P0.001），Shannon指数差异显著（P0.05）。由图4C可知，在非加权UniFrac距离的PCoA，两个地区的米酒在空间排布上呈现出了明显的分离趋势。大竹米酒均分布在横坐标的正半轴上，且大多集中在纵坐标的零点附近，而恩施米酒均分布在横坐标的负半轴和纵坐标的整个坐标轴上。由此可见，大竹米酒在细菌丰度和多样性上差异较大。如图5所示，在线性判别分析（linear discriminant analysis，LDA）阈值得分为3.0时，两个地区米酒中共有9 个菌群类别存在显著差异。大竹米酒中存在5 个差异类群，其生物标志物为Lactobacillus，恩施米酒中存在4 个差异类别，其生物标志物为Pediococcus。?5001 5005001 00002 000Chao1?A*?2.52.55.00.07.5Shannon?B*?0.5?0.3?0.2?0.1 0.00.10.20.30.40.50.60.10.5C0.4?0.20.00.3?0.3?0.10.2?0.4PCo2?13.65%?PCo1?22.00%?ES6ES9ES5ES1ES4ES10ES3ES8ES7ES2DZ6DZ7DZ3DZ5DZ2DZ4DZ1*.差异显著（P0.05）；*.差异极显著（P0.001）。ES.恩施米酒，下同。图 4 大竹和恩施米酒的Chao1指数（A）、Shannon指数（B）及基于非加权的UniFrac距离PCoA（C）比较分析Fig.4 Comparative analysis of Chao1 index(A),Shannon index(B)and PCoA based on unweighted UniFrac distance(C)of Dazhu and Enshi rice wine236 2023,Vol.44,No.18 食品科学 生物工程?6.0?3.6?2.4?4.8?1.2 0.01.22.43.64.86.0PediococcusHerbaspirillumRalstoniaLeuconostocLactococcusLactobacillusBacteriaStreptococcaceaeOxalobacteraceaelgLDA?图 5 LDA图Fig.5 Linear discriminant analysis DZ7DZ2DZ3DZ6DZ5DZ7DZ1DZ4ES8ES6ES9ES2ES5ES1ES10ES4ES3aA6543210BCDEFGHIJKLMNOPQRSTUVZlg?B0.01.02.02.51.50.5GKbJF?106?A.RNA的加工与修饰；B.染色质结构与动力学；C.能量生产和转换；D.细胞周期控制、细胞分裂、染色体分割；E.氨基酸转运与代谢；F.核苷转运与代谢；G.碳水化合物运输和代谢；H.辅酶转运与代谢；I.脂质转运与代谢；J.翻译、核糖体结构与生物发生；K.转录；L.复制、重组和修复；M.细胞壁/膜/包膜生物发生；N.细胞运动；O.翻译后修饰，蛋白质周转，伴侣；P.无机离子运输与代谢；Q.次生代谢产物的合成、转运和分解代谢；R.一般功能预测；S.未知功能；T.信号转导机制；U.细胞内运输，分泌和囊泡运输；V.防御机制；Z.细胞骨架。图 6 大竹和恩施米酒的细菌功能预测（a）及功能差异分析（b）Fig.6 Prediction of bacterial functions(a)and analysis of functional differences(b)between Dazhu and Enshi rice wine在比较了两个地区米酒菌群结构的差异后，对两者细菌菌群的基因功能亦进行了比较分析。将序列上传至PICRUSt软件比对共得到了4 402 个直系同源集（clusters of orthologous groups，COG），所有COG共注释到了23 个功能类别，如图6所示。所有样品中的菌群均在E、G、J、K、L和M功能上有较高的表达，而在A、B、N和Z上的表达量较低。由聚类可知，两个地区的米酒在菌群功能上没有明显的分离趋势。然而，经Mood-median检验发现两个地区的米酒在B、F和J功能上差异显著（P0.05），在G和K功能表达上差异非常显著（P0.01）。2.4 大竹米酒各滋味指标与细菌类群的关联性分析?0.3?0.3?0.2?0.10.00.10.20.30.40.10.5A0.4?0.20.00.3?0.10.2PC2?23.50%?PC1?31.58%?DZ1DZ5DZ4DZ2DZ6DZ3DZ7?0.10?0.10?0.050.000.050.100.150.200.250.050.15B?0.050.000.10PC2?25.40%?PC1?43.34%?DZ1DZ5DZ7DZ6DZ2DZ4DZ3?A?BC?AcinetobacterLeuconostocLactococcusWeissellaPediococcusLactobacillus图C中实线代表正相关；虚线代表负相关；两者间相关性系数越大，其线条颜色越深；粗线条表示相关性显著（P0.05）。图 7 基于OTU水平的非加权UniFrac距离PCoA（A）、基于滋味指标的PCA得分图（B）及优势细菌属与各滋味指标的相关性网络图（C）Fig.7 Unweighted UniFrac distance PCoA based on OTU level(A),PCA score plot based on taste indicators(B)and correlation network plot of dominant bacterial genera with taste indicators(C)进一步针对菌群结构和滋味品质进行了相关性分析。由图7A可知，在基于非加权UniFrac距离的PCA中，7 份米酒样品在整个空间中呈现出了2 个明显的聚类，一个聚类由DZ2、DZ4和DZ5组成，另一个聚类由DZ3、DZ6和DZ7组成，而DZ1距离这2个聚类均较远。由图7B可知，基于滋味指标7 份样品被分成了3 个聚类，一个生物工程 食品科学 2023,Vol.44,No.18 237聚类为样品DZ2、DZ3、DZ6和DZ7，一个聚类为样品DZ1和DZ5，另一个聚类为样品DZ4。结合图7A、B可发现，在基于OTU水平和基于滋味指标的两个空间分布中，样品呈现出的聚类趋势有部分重叠。因而本研究进一步探讨了优势菌属和滋味指标间的相关性。由图7C可知，Lactobacillus和Lactococcus与各项滋味指标更多呈正相关，而Pediococcus和Weissella与滋味指标更多呈负相关，Leuconostoc和Acinetobacter与各项滋味指标的相关性系数均较小。相关性检验结果显示，Weissella与后味A、涩味和苦味指标间呈显著负相关（P0.05）。3 讨论与结论本研究采用电子舌评价了米酒的酸、苦、涩、咸和鲜5 个基本味与后味A、后味B和丰味3 个回味，结果发现大竹米酒在咸味指标上较为突出，而酸味指标较弱。通过Kang等29的研究发现，韩国米酒与大竹米酒有相似的滋味特征。众所周知，有机酸和游离氨基酸是食品中间重要的呈味物质30。因而本研究进一步检测了米酒中的有机酸和游离氨基酸，结果显示有机酸以乳酸和乙酸为主，游离氨基酸以谷氨酸、亮氨酸和天冬氨酸为主。乳酸菌发酵是碳水化合物代谢产生乳酸和乙酸的主要途径31，这间接表明了乳酸菌是米酒发酵过程中较为活跃的细菌类群，然而纳入本研究的米酒其酸味却较弱，这或许是因为米酒的发酵周期通常较短，仅有2 d左右，大部分的糖还未被代谢成酸。此外，谷氨酸和天冬氨酸在酸性食品中可作为鲜味物质的前体物质，而亮氨酸本身呈现苦味，它们或许是构成米酒中鲜味和苦味的原因之一。在 对 米 酒 理 化 指 标 进 行 检 测 的 基 础 上，采用纯培养与高通量测序技术相结合的手段分别解析了大竹米酒中的乳酸菌与细菌类群，结果表明由Firmicutes和Proteobacteria构成了优势菌门；Lactobacillus、Pediococcus和Weissella等乳酸菌类群构成了优势菌属；乳酸菌菌种分别由L.fermentum、Pediococcus pentosaceus、L.paracasei、L.plantarum和L.ps