大孔树脂纯化青蒿多酚的工艺设计及其体外抗病毒活性研究.pdf

山 东 农 业 科 学():./.收稿日期:基金项目:山东省自然科学基金项目()新疆维吾尔自治区自然科学基金项目()作者简介:王云雨()女山东商河人硕士研究生研究方向为药物新剂型与新制剂:.王健()男山东周村人硕士研究生研究方向为药物新剂型与新制剂:.*同为第一作者通信作者:周长征()男山东定陶人教授硕士生导师研究方向为药物新剂型与新制剂:.大孔树脂纯化青蒿多酚的工艺设计及其体外抗病毒活性研究王云雨王健*张丽万新焕牛凤菊周长征(.山东中医药大学药学院山东 济南.新疆医科大学第五附属医院药学部新疆 乌鲁木齐)摘要:本试验比较了、及 六种大孔树脂对青蒿总多酚的纯化效果筛选出富集青蒿多酚的最佳大孔树脂型号为 采用单因素试验确定其最佳工艺参数:上样液 值为.质量浓度为 /上样量为 静态吸附 洗脱液是体积分数为 乙醇溶液用量为 纯化后的青蒿总多酚纯度较纯化前增加了.倍 纯化后的青蒿总多酚对、和 均表现出显著的体外抗病毒活性而对 未表现出较好的抑制效果关键词:大孔树脂青蒿多酚抗病毒活性中图分类号:.文献标识号:文章编号:().(.).:./.青蒿又名“方溃”“草蒿”“荻”和“菣”等为黄花蒿(.)的干燥地上部位属一年生型菊科蒿属的清热解毒草本植物 青蒿作为一种医食两用植物除富含多糖、蛋白质、萜类等有机活性成分之外还含有抗氧化、抗病毒、抗疟、抗肿瘤、防治心血管疾病等活性的“健康卫士”多酚类化合物 多酚类物质的提取方式通常包括溶剂萃取法、超临界萃取法、超声波辅助提取法、生物酶提取法等其分离纯化方法则有配位沉淀法、分子筛层析分离法、大孔吸附树脂分离法及膜分离法等目前对多酚类化合物的体外活性研究主要集中于其抗氧化活性且研究表明其具有一定的抗病毒活性 人呼吸道合胞病毒()作为肺炎链球菌科的一种包膜病毒是引起免疫低下人群下呼吸道感染最常见的病原菌之一且目前尚无批准的疫苗或特异性药物来对抗其感染近年来以干扰素和病毒唑治疗 等病毒感染性疾病的研究屡见不鲜但因其临床效果不太理想且价格昂贵所以仍存在较大的争议 单纯疱疹病毒()是 疱疹病毒亚科的病原体一般在外周组织中增殖继而于三叉神经节的神经元细胞核中以双链()片段体的形式建立潜伏期被激活后可到达神经末梢感染邻近的周围上皮组织如口腔、生殖器黏膜和眼上皮等 研究表明青蒿提取物可在分子水平上发挥抗 抗体的活性故猜测其具有抑制潜伏期 的活性 传统抗病毒药物多为化药一般对机体刺激性较大且极易产生耐药性故可能给患者带来二次伤害 我国传统中草药因分布广泛易得、药效温和且可避免耐药性的产生等优点或将成为研制抗病毒制剂的“新星”本研究旨在筛选适宜的大孔树脂型号及最优提纯工艺以提高青蒿中多酚类化合物的提取纯度并采用体外试验对其抗病毒活性加以验证及进一步的研究以期为青蒿资源的开发与应用提供一定的依据 材料与方法.材料与试剂青蒿安徽省亳州市 细胞山东省第一医科大学微生物研究所呼吸道合胞病毒()、单纯疱疹病毒()、肠道病毒 型()中国疾病预防控制中心病毒病研究所流感病毒研究室福林酚()试剂、胰酶、青链霉素混合液()双抗、(二 苯 基 四 氮 唑 溴 盐)、大 孔 树 脂(、)北京索莱宝科技有限公司二甲亚砜天津富宇精细化工有限公司 培养基胎牛血清、美国 公司利巴韦林注射液(产品批号:)山东鲁抗辰欣药业有限公司阿昔洛韦(号:)上海皓鸿生物医药科技有限公司没食子酸、无水乙醇、无水碳酸钠、浓盐酸、氢氧化钠等均为国产分析纯.试验仪器 型超声波清洗器北京六一生物科技有限公司微型中药粉碎机邢台润联科技开发有限公司()循环水式真空泵郑州巩义市英峪予华仪器厂离心机长沙湘智离心机仪器有限公司 电子天平上海精密科学仪器有限公司旋转蒸发仪上海亚荣生化仪器厂冷冻干燥机北京博医康实验仪器有限公司水浴振荡器上海博迅医疗生物仪器股份有限公司紫外可见分光光度计 型上海元析仪器有限公司 酸度计山东欧莱博仪器有限公司恒温培养箱日本三洋公司生物安全柜 公司倒置显微镜日本 公司超低温冰箱中科美菱低温科技股份有限公司细胞培养瓶、孔细胞培养板美国 公司酶标仪美国 仪器有限公司.试验方法.粗青蒿多酚样品的制备 称取洗净、烘干()后的粗碎青蒿 粉碎后过.筛精确称取.粉末于圆底烧瓶中以固液比为(/)、乙醇浸泡 后于功率、条件下水浴超声提取 次每次 提取液以 层纱布过滤合并滤液 将滤液抽滤 /离心 后以 减压浓缩至含生药量 /按照样品无水乙醇()为.、.、依次加入相应体积的无水乙醇以除去粗提液中的部分多糖及蛋白质静置 后以 /离心 取上清液进行减压浓缩()至无醇味将浓缩液保存于 冰箱中后进行冷冻干燥冻干后的粗品置于 条件下备用.提取液中多酚含量的测定 采用福林酚 山 东 农 业 科 学 第 卷比色法 精密称取没食子酸标准品().于 容量瓶中以纯水溶解并定容摇匀即得质量浓度为./的没食子酸标准品溶液 分别移取标准品溶液、.、.、.、.、.于 棕色容量瓶中后分别加入.福林酚试剂、质量浓度为 的碳酸钠溶液.并以纯水定容摇匀后避光反应 测定 波长处的吸光度值得到没食子酸标准曲线回归方程:.相关系数.式中 为没食子酸标准溶液的质量浓度(/)为吸光度值 标准曲线见图 移取样品溶液.于 棕色容量瓶中加入.福林酚试剂与 碳酸钠溶液.后以纯水定容摇匀后避光反应 测定 波长处的吸光度值并代入回归方程得其多酚质量浓度图 没食子酸标准曲线.大孔树脂的预处理 分别取.、大孔树脂以体积分数为 乙醇活化 搅拌均匀放出气泡后以纯水洗至无醇味以 倍柱体积的 浸泡 后以纯水洗至中性以相同体积 浸泡 后以纯水洗至中性最终以大量纯水浸泡备用.大孔树脂型号的筛选取预处理的 种湿树脂各.于 具塞锥形瓶中各加入.质量浓度为 /的青蒿多酚粗提液吸附 后置于、/水浴恒温振荡仪上振荡吸附 并收集其上清液(./)自收集的各组(以./收集的单个样品为一组)上清液中分别取样以测定多酚浓度 同时测定初始提取液的多酚浓度 将吸附饱和的树脂进行抽滤并以 纯水润洗 次至表面无明显残留的多酚溶液 加入.体积分数为 乙醇后再次置于摇床上相同条件下恒温振荡 并收集上清液(./)测其多酚浓度 将所得数据代入公式()()以计算各树脂的吸附量(/)、吸附率及解吸率()即可筛选出最佳型号 吸附量(/)()/()吸附率()()/()解吸率()/()()式中 为湿树脂质量 为上样液体积.树脂的静态吸附动力学分析分别取.中 树脂静态吸附过程中每小时所得样液按.中的测定方式得其多酚浓度计算吸附率并绘制吸附曲线.上样液质量浓度对吸附率的影响取.预处理的 湿树脂 份加入质量浓度分别为、/的青蒿多酚粗提液各.密封置于 水浴恒温振荡仪上以 /振荡吸附 并收集其上清液(./)测其多酚浓度并按公式()计算吸附率.上样液 值对吸附率的影响 取.预处理的 湿树脂 份加入 值分别为、的青蒿多酚粗提液(质量浓度为 /)各.密封置于 水浴恒温振荡仪上以 /振荡吸附 并收集上清液(./)测其多酚浓度并按公式()计算吸附率.乙醇体积分数对解吸率的影响 取.预处理的 湿树脂 份加入质量浓度为/、值为.的青蒿多酚粗提液各.密封置于 水浴恒温振荡仪上以/振荡吸附 加入体积分数分别为、的乙醇洗脱液各.密封置于 水浴摇床上以/振荡 并收集其上清液(./)测其多酚浓度并按公式()计算解吸率.树脂的动态吸附与解吸()动态吸附曲线的绘制:取.预处理的 湿树脂 份以湿法装柱的方式装入半径为 第 期 王云雨等:大孔树脂纯化青蒿多酚的工艺设计及其体外抗病毒活性研究.的层析柱以纯水平衡 后加入质量浓度为 /、值为.的青蒿多酚粗提液以 /(.)的流速过柱并测定每 流出液中的总多酚浓度 当其达到泄漏点流出液的总多酚含量()开始不低于上样液中总多酚含量()时的上样体积停止上样并绘制动态吸附曲线()洗脱曲线的绘制:按.()中的方式装柱并将质量浓度为 /、值为.的青蒿多酚粗提液以 /的流速上样 经 纯水洗脱除杂后以体积分数为 乙醇洗脱至无紫外吸收()每.收集一次洗脱液并测定其总多酚浓度绘制洗脱曲线将含总多酚的洗脱液进行减压浓缩至无醇味冷冻干燥后测定多酚纯度(混合物中总多酚的质量占其总质量的百分比).青蒿多酚抗病毒活性的研究()细胞复苏:将保存于液氮中的 细胞取出并置于条件下融化后将其放入离心机中以 /离心 弃去上清液后以 细胞生长液(培养基)吹打后移入细胞培养瓶补加培养液使瓶内液体容积达 标记后置于 、培养箱中培养并定时镜检(检 次)()细胞传代:待 细胞长成单层且在细胞培养瓶瓶底覆盖率约 时弃去原培养液并以 冲洗 次后向瓶中加入 .胰酶细胞消化液(含)轻轻晃动使其覆盖瓶底置于培养箱中消化 轻轻拍打培养瓶使贴壁细胞脱落立即加入 终止消化吹打均匀后以 传 的方式进行传代标记后继续培养()病毒毒力的测定:将冻存于 冰箱中的、和 病毒“三冻三融”之后在 /条件下离心 并收集上清液将其进行 倍比稀释()后依次加入 于被单层 细胞覆盖的 孔板中每孔平行 次并设置细胞对照组标记后置于培养箱中静待 终止培养后弃去原培养液以 冲洗两遍后以 在避光条件下染色处理 之后弃去 并以 进行脱色在气浴恒温振荡器中振荡 后于酶标仪中测定 采用 两氏法即式()计算病毒的半数细胞感染量 细胞存活率()试验组 值/对照组 值 细胞病变率()细胞存活率 细胞比距()(高于 的细胞病变率)/(高于 的细胞病变率低于 的细胞病变率)()()式中 为高于 病变率时的首个稀释度为倍比稀释系数()药物毒性的测定:将所得冻干青蒿多酚样品以 配制成 /药物后过.无菌微孔滤膜除菌除杂取 以 倍比稀释()加入长好单层 细胞的 孔板中设置细胞对照()、病毒对照(病毒)和同浓度阳性药(与 以利巴韦林为阳性药 以阿昔洛韦为阳性药 阳性药 )标记培养 待病毒组病变达 时终止培养并弃去原培养液以 冲洗 遍后依次进行染色、脱色处理脱色后振荡 并于酶标仪中测定 依据式()计算药物的半数中毒浓度()(高于 细胞病变率的药物稀释度的值)药物首孔()式中 药物首孔表示 孔板中首列药物的浓度即/()青蒿多酚体外抗病毒试验:将青蒿多酚药物的最大无毒浓度设置为初始浓度以 依次进行 倍比稀释()并各加入 于长好 细胞的 孔板中同时设置对照组同.()的处理方式 标记后置于培养箱中待病毒组病变程度约为 时进行染色、脱色处理经振荡后以酶标仪测定 并采用 两氏法即式()()计算药物的半数有效浓度()和治疗指数(值)其中值为判定药物是否具有抗病毒效果的主要指标(高于 细胞存活率药物稀释度的值)药物首孔()/()山 东 农 业 科 学 第 卷.数据整理及分析采用 .对试验数据进行显著性分析以 与 作图 结果与分析.六种大孔树脂性能的比较相关研究表明树脂的主要功能基(极性)及其孔径、孔隙率、比表面积等因素是影响其性能的关键所在而被吸附化合物的分子量也是影响大孔树脂“去粗取精”不可忽略的因素 如表 所示一般来说酚类化合物应在极性树脂上具有较好的性能但本试验结果表明 的性能并不出众推测青蒿多酚的化合物分子量偏小即影响其吸附、解吸效果的主要是孔容、比表面积等空间因素 在这 种树脂中的平均孔径最小且平均孔容和比表面积最大故其吸附青蒿多酚的纯度最高且解吸性能最佳 种树脂的吸附率不存在较大差异但 的解吸率优于其他 种树脂 综合考虑 是纯化青蒿多酚的最适树脂 表 六种大孔树脂空间结构、吸附与解吸性能等的比较型号极性平均孔径/平均孔容/(/)比表面积/(/)吸附量/(/)吸附率/解吸率/弱极性.极性.非极性.弱极性.非极性.非极性.树脂的静态吸附饱和曲线如图 所示自吸附开始的.内青蒿多酚被迅速吸附至 树脂内部使其吸附率迅速升至.至 后达到饱和状态此后吸附率几乎不再变化 故选择 为青蒿总多酚的 最佳吸附时间图 树脂的静态吸附饱和曲线.上样液质量浓度对吸附率的影响如图 所示当青蒿多酚上样液的质量浓度为 /时其在 树脂上的吸附率明显优于其他浓度 低于该浓度时吸附率较小的主要原因是树脂上的吸附位点仍有剩余从而降低了树脂的利用率 当质量浓度高于 /时化合物堵塞引起传质阻力增大进而影响物质的扩散和吸附造成多酚化合物的损失 故确定/是其最佳上样浓度图 上样液质量浓度对吸附率的影响.上样液 值对吸附率的影响如图 所示当上样液的 值为 时多酚吸附质主要以分子状态存在此时其在 树脂上的吸附率高于 且不存在显著性差异(.)上样液的 值不低于 时青蒿多酚主要以离子态分布此时不易被树脂所吸附 当 值为 或 时部分苷键发生断裂形成了苷元和糖 一方面糖类化合物占领了部分吸附位点造成了多酚的损失另一方面多酚苷元释放后被吸附导致此时多酚吸附率较中性条件时更高 故认为 .时青蒿多酚在 第 期 王云雨等:大孔树脂纯化青蒿多酚的工艺设计及其体外抗病毒活性研究 树脂上的吸附效果最佳图 上样液 值对吸附率的影响.洗脱液体积分数对解吸率的影响如图 所示当乙醇洗脱液体积分数为 时青蒿多酚的解吸率随乙醇体积分数的升高而增大 推测其原因为青蒿多酚提取液成分复杂随乙醇体积分数增大避免了极性较大的杂质被洗脱下来并增大了树脂的溶胀程度而使多酚类化合物更易被洗脱 当体积分数继续增大时解吸率反 而 降 低 但 均 高 于 乙 醇 的 解 吸 率(.)其原因可能是青蒿多酚极性高于该体积分数下的乙醇极性而使其溶解度降低所致 故认为乙醇洗脱液的最适体积分数为 图 洗脱液体积分数对解吸率的影响.树脂的动态吸附与解吸.动态吸附曲线大孔吸附树脂的纯化性能是其大分子功能基团的吸附性及其孔隙的筛分性相结合的结果 当吸附目标物的浓度高于限定值时会因吸附位点不足或孔隙堵塞等造成目标物质的泄露且自其泄漏量开始高于上样液中目标物含量的 时认定吸附物在目标树脂上达到了泄漏点 如图 所示以、质量浓度为 /的青蒿总多酚提取物上样当上样液为 时其流出液中总多酚浓度开始达初始浓度的(.)继续上样发现流出液中多酚浓度迅速升高使树脂利用率显著降低 故青蒿多酚的最大上样体积为 图 青蒿多酚在 树脂上的吸附饱和曲线.动态洗脱曲线 如图 所示以 乙醇溶液对青蒿多酚进行洗脱当洗脱液体积为.时流出液总多酚质量浓度达到最大(./)继续洗脱至流出液在 处无明显紫外吸收()即认为此时多酚已被完全洗出故认为洗脱液的最佳用量为 图 青蒿多酚在 树脂上的洗脱曲线.青蒿多酚纯度分别将最佳条件(树脂上样:.、质量浓度为 /、洗脱:乙醇、)下所得的洗脱液与粗提液减压浓缩后进行冷冻干燥测其多酚含量以计算纯度 结果如表 所示此条件下青蒿多酚纯化后的纯度较纯化前增加.倍 表 树脂纯化前后青蒿多酚纯度组别多酚纯度/纯化前.纯化后.山 东 农 业 科 学 第 卷.青蒿多酚抗病毒活性.病毒 的测定根据式()计算得、的 分别为.、.、.、.试 验 用 倍作为病毒液浓度.药物 的测定 /青蒿多酚溶液(纯化后)自加入 后在显微镜下可见 细胞明显破裂(约)加药 后细胞破裂率可达 以上 胞中颗粒物增多且形态改变随药物浓度降低对细胞毒性减小 而对照组细胞排列紧凑且无颗粒物出现细胞形态完整 药物与阳性药对细胞的 见表 表 青蒿多酚与利巴韦林、阿昔洛韦对细胞的 值比较组别/(/)青蒿多酚.利巴韦林.阿昔洛韦.青蒿多酚体外抗病毒试验()青蒿多酚抗:如表 所示青蒿多酚溶液对 的抑制效果显著强于阳性对照药表明其具有显著的抗病毒效果 推测其原因可能是提取物中的成分多样且各物质间可协同发挥作用值得推广用于制备相应抗 制剂 表 青蒿多酚与利巴韦林对 的与 值的比较组别/(/)青蒿多酚.利巴韦林.注:表示两处理在.水平差异显著 表示在.水平差异显著下同 ()青蒿多酚抗:由表、表 可知青蒿总多酚提取物对 与 均具有一定的灭活作用且对 的抑制作用较强两者效果均优于阳性对照与张军峰等的研究结果无明显差别 故可确定青蒿总多酚也具备抗 的生物活性 表 青蒿多酚与阿昔洛韦对 的与 值的比较组别/(/)青蒿多酚.阿昔洛韦.表 青蒿多酚与阿昔洛韦对 的与 值的比较组别/(/)青蒿多酚.阿昔洛韦.()青蒿多酚抗:如表 所示青蒿多酚对 不存在明显的体外抑制活性 表 青蒿多酚与利巴韦林对 的与 值的比较组别/(/)青蒿多酚.利巴韦林.讨论与结论本试验探究了 种不同型号的大孔树脂对青蒿多酚的静、动态吸附与解吸效果并以单因素试验对纯化树脂的最佳纯化条件进行了研究 结果表明 吸附树脂对青蒿总多酚的纯化效果最优其最佳纯化工艺参数为静态吸附液 值为.、质量浓度为 /、吸附时间为 最佳洗脱液的体积分数为 动态吸附时其最佳上样量为 洗脱液最佳用量为 在此条件下青蒿多酚的纯度较纯化前增加了.倍 纯化后的青蒿总多酚可表现出对、及 的显著抑制活性对 不存在灭活作用 王乐乐研究发现青蒿中存在猫眼草酚 等多酚类物质可协同青蒿素等物质发挥抗疟、抗肿瘤活性 后续可对青蒿总多酚的活性成分、体内抗病毒效果及其作用机制进行深入研究以期为其资源的开发与应用提供更加充分的理论基础参 考 文 献:谭俊杰 万锋 谭昌恒.青蒿药用食用历史考略.亚太传统医药 ():.肖立皓 李海波 黄玉欣 等.青蒿的化学成分研究.中国中药杂志 ():.陈金娥 赵金玲 张海容.青蒿中黄酮、多酚和 含量测定及抗氧化性研究.食品研究与开发 ():.张春梅 陈朝银 赵声兰 等.大孔吸附树脂纯化核桃内种皮总多酚的工艺优选.中国实验方剂学杂志 ():.第 期 王云雨等:大孔树脂纯化青蒿多酚的工艺设计及其体外抗病毒活性研究 张军峰 谭健 蒲蔷 等.青蒿提取物抗单纯疱疹病毒活性研究.天然产物研究与开发():.:.蔡雪君 关文达 马钦海 等.青蒿素及其衍生物的抗病毒作用机制研究进展.现代药物与临床 ():.王振宇 孔子浩 孔令华 等.天然多酚提取、分离及鉴定方法的研究进展.保鲜与加工 ():.():.:.():.():.():.薛美娟 黄俊霞 杨骥.双氢青蒿素对/狼疮鼠的治疗作用及其对滤泡辅助性 细胞的调控作用.中国临床医学 ():.樊兵 吴云锋 袁耀锋 等.植物源抗病毒活性物质的初步筛选.西北农林科技大学学报(自然科学版)():.张春梅 陈朝银 赵声兰 等.核桃内种皮多酚提取工艺及其体外抗氧化活性的初步研究.中国酿造 ():.徐小燕 潘林梅.影响大孔树脂吸附分离的因素及其在中药制备工艺中的应用.中国药房 ():.梁杏 张旭 陈朝银 等.核桃饼粕多酚纯化工艺及其抗氧化活性的研究.中国酿造 ():.王俐 付文焕 施孝金.大孔吸附树脂分离技术在现代中药中的适宜性.中国医药指南 ():.张军峰 郑鸿燕 谭健 等.青蒿鞣质抗单纯疱疹病毒机理初探.江苏药学与临床研究():.王乐乐.中药粉防己青蒿和地榆的化学成分及其活性研究.天津:南开大学.罗世琼 林爱兰 姚永红.野生黄花蒿抗氧化成分与植株养分的相关性分析.西南农业学报 ():.山 东 农 业 科 学 第 卷