人乳腺癌裸鼠移植瘤的体外抗生素诱导基因治疗.doc

人乳腺癌裸鼠移植瘤的体外抗生素诱导基因
治疗

作者：曾赵军，胡维新，李子博，罗赛群

【摘要】 目的 探讨 Tet 调控下体外抗生素诱导基因治疗人乳腺

癌裸鼠移植瘤的可行性。 方法 构建人乳腺癌 BALB/C 裸鼠移植瘤模型,

制备有感染活性的重组逆转录病毒 RevTRE/HSVtk 与 RevTet On。观

察体外强力霉素（Dox）诱导, 丙氧鸟苷（GCV）和逆转录病毒作用后

移植瘤生长的变化及组织病理改变, 分析其对乳腺癌裸鼠移植瘤的调

控性治疗作用。结果 乳腺癌裸鼠治疗后，肿瘤体积明显减小，生长受

抑，生存周期延长, 组间比较有显著性差异（P<0.05） 。瘤体 HE

染色显示治疗组肿瘤局部有炎性细胞浸润和强嗜酸性细胞。RT PCR

结果显示 Dox 诱导后瘤体组织 HSVtk 表达较明显。 论 通过逆转录病 结

毒介导 Tet 调控，可以在体外抗生素 Dox 诱导下对人乳腺癌裸鼠移植

瘤模型进行基因治疗，杀伤肿瘤细胞。

【关键词】 乳腺癌；基因治疗；裸鼠；逆转录病毒；基因调控

基金项目：美国中华医学会（CMB）基金资助项目（# 99 698）

Key words：Breast cancer ；Gene Therapy；BALB/C mice；

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Retrovirus；Antibiotic

自杀基因治疗是近年来肿瘤治疗研究的热点之一。 单纯疱疹病毒

胸苷激酶(HSVtk)在体细胞内能将无毒的药物前体 GCV 代谢为有毒物

质，诱导靶细胞产生"自杀"效应，从而清除肿瘤［1］ 。本实验用含

有调控因子 Tet On 和 HSVtk 基因的重组逆转录病毒与底物 GCV 处理

后,在体外强力霉素作用下观察对人乳腺癌 BALB/C 裸鼠移植瘤模型肿

瘤生长、瘤体大小以及肿瘤组织病理学等改变,分析肿瘤组织内 HSVtk

基因表达的变化。以探讨在体外抗生素诱导下, 自杀基因对乳腺癌细

胞株 MCF 7 移植的乳腺癌裸鼠的体外调控性治疗作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞与动物 人乳腺癌细胞株 MCF 7、PA317、NIH3T3

来自中南大学湘雅医学院细胞中心。年龄 4 周的雌性 BALB/c 裸鼠（nu

/ nu ）购于中国医学科学院上海实验动物中心。

1.1.2 主要试剂和质粒 质粒载体 pRevTRE、pRevTet On 购自

美国 Clontech 公司， 粒 pGEM7Z 质 tk 由中南大学湘雅医学院肿瘤研

究所曹亚教授惠赠。pRevTRE/HSVtk 由本中心构建［2］ ，含有四环素

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反应元件（TRE）和自杀基因 HSVtk。限制性内切酶购自 Roche 公司和

Promega 公司。G418、潮霉素、DMEM、0.25%胰蛋白酶、RNA TRIzol

试剂盒均购自 Gibco BRL 公司。GCV、Dox 购自美国 Sigma 公司。其余

试剂购自 Sigma 公司。

1.2 逆转录病毒的制备、纯化与滴度测定

通过改进的"微乒乓感染法"将质粒逆转录病毒载体导入包装细

胞 PA317 中，以潮霉素 B 或 G418 筛选克隆细胞，浓缩克隆细胞上清

制备重组逆转录病毒［3］ 。得到病毒后纯化并测定其滴度。

1.3 BALB/c 裸鼠移植瘤模型的建立、分组和干预方法

模型的构建：取对数生长期的 MCF 7 细胞，0.25%胰蛋白酶消

化，用 PBS 洗 2 遍，离心 1 000r/min 4min，无血清的 DMEM 培养基重

悬细胞，细胞计数使细胞密度达 2×106/ml，以 0.2ml 细胞悬液注射

接种于 BALB/c 裸鼠左侧近前腋处皮下并作好标记。细胞接种后，观测

裸鼠生长状况。

动物分组和干预：待裸鼠皮下肿瘤长至 0.7～0.8cm 后，按随机

数字表法将裸鼠随机分为 4 组， 培养基 DMEM 组、 病毒组、
即 GCV+ GCV+Dox

组、Dox+GCV+病毒治疗组，每组 8 只，苦味酸标记。 GCV+病毒组、

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