SN∕T 5387-2021 莴苣花叶病毒检疫鉴定方法(出入境检验检疫).pdf

以正式出版文本为准I C S6 5. 0 2 0. 0 1C C SB1 6中华人民共和国出入境检验检疫行业标准S N/T5 3 8 72 0 2 1 莴苣花叶病毒检疫鉴定方法D e t e c t i o n a n d i d e n t i f i c a t i o n o f L e t t u c e m o s a i c v i r u s2 0 2 1 - 0 6 - 1 8发布2 0 2 2 - 0 1 - 0 1实施中华人民共和国海关总署发 布以正式出版文本为准12027835 T/NS中华人民共和国出入境检验检疫行 业 标 准莴苣花叶病毒检疫鉴定方法S N/T 5 3 8 72 0 2 1*中国海关出版社有限公司出版发行北京市朝阳区东四环南路甲1号(1 0 0 0 2 3)编辑部: (0 1 0)6 5 1 9 4 2 4 2 - 7 5 0 9网址 www. c u s t o m s k b . c o m/b o o k中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷*开本8 8 01 2 3 0 1/1 6 印张1 字数2 5千字2 0 2 1年7月第一版 2 0 2 1年7月第一次印刷印数 15 0 0*书号: 1 5 5 1 7 56 7 9 定价1 6. 0 0元以正式出版文本为准前 言 本文件按照G B/T 1. 12 0 2 0 标准化工作导则 第1部分: 标准化文件的结构和起草规则 的规定起草。本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。 本文件起草单位: 中国检验检疫科学研究院、 兰州海关技术中心、 中华人民共和国吴江海关、 福建省农业科学院果树研究所。本文件主要起草人: 张永江、 文朝慧、 黄洁芳、 谢丽雪、 向均。S N/T5 3 8 72 0 2 1以正式出版文本为准以正式出版文本为准莴苣花叶病毒检疫鉴定方法1 范围本文件规定了莴苣花叶病毒的检疫鉴定方法。本文件适用于莴苣种子、 莴苣、 豌豆、 鹰嘴豆等寄主植株上莴苣花叶病毒的检疫鉴定。2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中, 注日期的引用文件, 仅该日期对应的版本适用于本文件; 不注日期的引用文件, 其最新版本( 包括所有的修改单) 适用于本文件。 G B/T 6 6 8 2 分析实验室用水规格和试验方法S N/T 2 1 2 2 进出境植物及植物 产品检疫抽样S N/T 3 4 5 7 植物病毒分子生物学检测规范3 术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3. 1反转录重组酶聚合酶扩增 r e v e r s e t r a n s c r i p t i o n r e c o m b i n a s e p o l y m e r a s e a m p l i f i c a t i o n;R T - R P A一项等温扩增技术。R P A是在单链D NA结合蛋白(s i n g l e - s t r a n d e d D NA b i n d i n g p r o t e i n, S S B)的作用下, 使模板D NA解链, 并在D NA聚合酶的作用下, 引物与模板正确配对形成复合体, 然后D NA聚合酶延伸引物生成新的D NA互补链, 实现对D NA的特定区域进行指数扩增。R T - R P A 以样品R NA为模板, 先反转录成c D NA, 然后再以c D NA为模板, 进行R P A扩增。4 莴苣花叶病毒基本信息学名:L e t t u c e m o s a i c v i r u s缩写:LMV分类地位: 马铃薯Y病毒科(P o t y v i r i d a e) , 马铃薯Y病毒属(P o t y v i r u s) 。 传播途径: 汁液易于传毒; 莴苣、 昆诺阿藜种子传毒率3%1 3%; 可通过蚜虫传播侵染豌豆, 但豌豆种子不传毒。莴苣花叶病毒的其他信息参见附录A。5 方法原理 LMV的免疫原性和基因组特征是该病毒鉴定的依据。依据LMV与抗体间的特异性反应, 对样品进行双抗体夹心酶联免疫吸附测定(D A S - E L I S A) 和免疫试纸条检测; 依据LMV的基因组特征建立R T - P C R和反转录重组酶聚合酶扩增技术(R T - R P A) 检测方法; 通过这些方法的有效组合, 判断样品是1S N/T5 3 8 72 0 2 1以正式出版文本为准否带有LMV。6 仪器设备、 用具及试剂6. 1 仪器设备 电子天平(1/1 0 0 0 g) 、 小型离心机、 恒温水浴锅、 酶标仪、 台式冷冻机、P C R仪、 电泳仪、 凝胶成像系统、 金属浴、 制冰机、 常规冰箱、 超低温冰箱、 涡旋振荡器等。6. 2 用具 可调移液器(0. 1 L2. 5 L,2 L2 0 L,1 0 L1 0 0 L,2 0 L2 0 0 L,1 0 0 L1 0 0 0 L)和可调移液器头(1 0 L,2 0 L,1 0 0 L,2 0 0 L,1 0 0 0 L) , 研钵, 微型磨杵。6. 3 试剂试验用水应符合G B/T 6 6 8 2的要求。双抗体夹心酶联免疫吸附测定试剂符合附录B要求,R T - P C R试剂符合附录D要求,R T - R P A符合附录E要求。7 样品制备7. 1 莴苣种子 莴苣种子用5倍1 0倍体积(mL) 抽提缓冲液研磨后,3 0 0 0g离心取上清, 进行D A S - E L I S A和免疫试纸条检测, 种子取样量按照S N/T 2 1 2 2进行; 另取3 5 0 L上清液提取核酸或用种子直接提取核酸后进行R T - P C R和R T - R P A检测。7. 2 植物样品 有症状植株( 叶片花叶、 植株矮化) , 每株单独编号并采集症状部位制样; 无症状植株,5株为一组编号并混合制样, 按照S N/T 3 4 5 7进行。按1 g样品加入5 mL1 0 mL抽提缓冲液进行研磨,3 0 0 0g离心取上清, 进行D A S - E L I S A和免疫试纸条检测; 或提取核酸后进行R T - P C R和R T - R P A检测。8 检疫鉴定方法8. 1 双抗体夹心酶联免疫吸附测定(D A S - E L I S A) 把制备的样品上清液加入已包被LMV抗体的酶联板中, 进行D A S - E L I S A检测。每个样品平行加到两个孔中。健康的植物组织作为阴性对照, 感染LMV的植物组织作为阳性对照, 样品提取缓冲液作为空白对照; 其中阴性对照的植物种类和材料( 如叶片) 应尽量与检测样品相一致。具体操作按照附录B执行。8. 2 免疫层析试纸条检测免疫层析试纸条检测的对照设置见8. 1, 具体操作按照附录C执行。8. 3 R T - P C R检测 R T - P C R检测阴性和阳性对照设置见8. 1, 灭菌双蒸水(d d H2O) 作为空白对照。分别提取样品和2S N/T5 3 8 72 0 2 1以正式出版文本为准对照总R NA, 反转录合成c D NA后进行P C R检测, 具体操作按照附录D执行。如采用商品化一步法试剂盒, 则按照试剂盒说明进行。8. 4 R T - R P A检测 R T - R P A检测阴性和阳性对照设置见8. 1, 灭菌双蒸水(d d H2O) 作为空白对照。分别提取样品和对照总R NA, 进行R T - R P A检测, 具体操作按照附录E执行。如采用商品化试剂盒, 则按照试剂盒说明进行。9 结果判定 样品经D A S - E L I S A、 试纸条、R T - P C R或R T - R P A中任一方法的检测, 结果为阴性, 判定样品不带有莴苣花叶病毒。 样品经D A S - E L I S A或试纸条检测结果为阳性, 还需用R T - P C R或R T - R P A进行检测。分子生物学检测结果为阴性, 判定待检样品不带有莴苣花叶病毒; 分子生物学检测结果为阳性, 则判定样品带有莴苣花叶病毒。1 0 结果记录与样品保存1 0. 1 结果记录 记录包括样品来源、 种类、 检测时间、 地点、 方法和结果、 检测人员签字。D A S - E L I S A检测应有酶联反应数值; 免疫层析试纸条检测应有试纸条检测图片;R T - P C R和R T - R P A检测应有电泳图片。1 0. 2 样品保存 阳性样品直接放于-8 0 冰箱或冷冻干燥后放于-8 0 冰箱保存1年, 保存的样品要做好标记和登记工作, 以备复验、 谈判和仲裁。保存期满后, 需经灭活处理。3S N/T5 3 8 72 0 2 1以正式出版文本为准附 录 A ( 资料性) 莴苣花叶病毒其他信息A. 1 寄主范围 自然寄主包括莴苣(L a c t u c a s a t i v a) 、 豌豆(P i s u m s a t i v u m) 、 苣荬菜(S o n c h u s b r a c h y o t u s) 、 鹰嘴豆(C i c e r a r i e t i n u m) 、 野芥(S i n a p i s a r v e n s i s) 、 菠菜(S p i n a c i a o l e r a c e a) 、 红花(C a r t h a m u s t i n c t o r i u s) 、 蓝眼菊属(O s t e o s p e r m u m s p p .) 、 勋章菊属(G a z a n i a s p p .) 、 柴胡(B u p l e u r u m f a l c a t u m) 和耳叶金鸡菊(C o r e o p s i s a u r i c u l a t a) 等。 接种寄主包括莴苣、 豌豆、 鹰嘴豆、 苋色藜(C h e n o p o d i u m a m a r a n t i c o l o r) 、 昆诺阿藜(C h e n o p o d i u m q u i n o a) 、 千日红(G o m p h r e n a g l o b o s a) 、 红花(C a r t h a m u s t i n c t o r i u s) 等。莴苣、 昆诺阿藜种子传毒率为3%1 3%。A. 2 地理分布 亚洲: 阿富汗、 中国、 印度、 伊朗、 伊拉克、 以色列、 日本、 约旦、 黎巴嫩、 马来西亚、 叙利亚、 土耳其、也门。 非洲: 埃及、 加纳、 肯尼亚、 马拉维、 毛里求斯、 摩洛哥、 塞拉利昂、 南非、 坦桑尼亚、 突尼斯、 赞比亚、 津巴布韦。 欧洲: 奥地利、 比利时、 克罗地亚、 丹麦、 芬兰、 法国、 德国、 希腊、 匈牙利、 爱尔兰、 意大利、 荷兰、 挪威、波兰、 葡萄牙、 罗马尼亚、 斯洛文尼亚、 西班牙、 瑞典、 瑞士、 英国。美洲: 加拿大、 墨西哥、 美国、 牙买加、 阿根廷、 巴西、 智利、 厄瓜多尔、 乌拉圭。大洋洲: 澳大利亚、 新西兰。A. 3 危害症状 莴苣: 受侵染的莴苣症状多变, 但通常表现为花叶、 明脉和黄斑驳。常有叶脉坏死并呈古铜色。病株不能包心, 里面的叶片持续短小, 呈丛簇状, 植株严重矮缩。见图A. 1、A. 2。豌豆: 花叶。鹰嘴豆: 叶黄化。 苋色藜: 接种8 d 1 0 d后, 出现淡绿或褪绿色的局部斑, 往往边缘呈淡红色, 特别在冬季呈系统黄脉斑点, 或嫩叶上有黄色网纹。 昆诺阿藜: 比苋色藜敏感, 产生更多的局部病斑, 但无淡红色边缘, 后来随着顶叶的扭曲和矮化显现系统的黄色网脉症状。千日红: 接种4 d 7 d产生灰白色局部坏死斑点, 扩大成红边的病斑, 无系统侵染。本氏烟: 系统花叶。红花: 系统花叶。4S N/T5 3 8 72 0 2 1以正式出版文本为准图A. 1 LMV在莴苣( 左) 和本氏烟( 右) 上引起的系统性轻花叶症状( 图A. 1 引自L i m S, e t a l .)图A. 2 LMV 在莴苣叶片( 左) 和茎秆( 右) 上引起花叶症状( 图A. 2 引自S h a r m a P, e t a l .)A. 4 基因组 病毒粒体线状, 大小约7 5 01 3 n m。基因组核酸为正单链R NA, 组分单一, 约有1 0 0 0 0个核苷酸组成。目前G e n B a n k已登录有LMV全基因组序列, 不同分离物的外壳蛋白的C -端极其保守, 可用于设计特异性引物进行检测。见图A. 3。图A. 3 病毒粒体(3 6 0 0 0)( 图A. 3引自周雪平, 等)5S N/T5 3 8 72 0 2 1以正式出版文本为准附 录 B( 规范性)双抗体夹心酶联免疫吸附测定(D A S - E L I S A)B. 1 试剂B. 1. 1 包被抗体特异性的莴苣花叶病毒抗体, 抗体效价应高于1/1 2 8 0 0 0。B. 1. 2 酶标抗体碱性磷酸酯酶标记的莴苣花叶病毒抗体。B. 1. 3 底物对硝基苯磷酸二钠(pN P P) 。B. 1. 4 1P B S T缓冲液(p H 7. 4)氯化钠(N a C l)8. 0 g磷酸二氢钾(KH2P O4)0. 2 g磷酸氢二钠(N a2HP O4)1. 1 5 g氯化钾(K C l)0. 2 g吐温- 2 0(T w e e n - 2 0)0. 5 mL叠氮钠(N a N3)0. 2 g溶于9 0 0 mL灭菌双蒸水中, 并定容至1 0 0 0 mL,4 储存。B. 1. 5 样品抽提缓冲液(p H 7. 4)亚硫酸钠(N a2S O3)1. 3 g聚乙烯基吡咯烷酮(P V P, MW 2 4 0 0 04 0 0 0 0)2 0. 0 g溶于9 0 0 mL的1P B S T 中, 并定容至1 0 0 0 mL,4 储存。B. 1. 6 包被缓冲液(p H 9. 6)碳酸钠(N a2C O3)1. 5 9 g碳酸氢钠(N a HC O3)2. 9 3 g叠氮钠(N a N3)0. 2 g溶于9 0 0 mL灭菌双蒸水中, 并定容至1 0 0 0 mL,4 储存。B. 1. 7 酶标抗体稀释缓冲液(p H 7. 4)牛血清白蛋白(B S A)2. 0 g聚乙烯基吡咯烷酮(P V P, MW 2 4 0 0 04 0 0 0 0)2 0. 0 g溶于1 0 0 0 mL 1P B S T 缓冲液中,4 储存B. 1. 8 底物缓冲液(p H 9. 8)二乙醇胺9 7 mL6S N/T5 3 8 72 0 2 1以正式出版文本为准氯化镁(M g C l2)0. 1 g叠氮钠(N a N3)0. 2 g溶于8 0 0 mL灭菌双蒸水, 用浓盐酸(HC l) 调p H至9. 8, 定容至1 0 0 0 mL,4 储存。B. 2 实验步骤B. 2. 1 包被抗体 按要求的浓度和需要的体积用包被缓冲液稀释包被抗体, 每孔加1 0 0 L。酶联板加盖或用保鲜膜包好,3 7 孵育2 h。清空孔中溶液, 用1P B S T 加满各孔,3 m i n后倒掉孔中溶液, 在吸水纸上拍干。再重复2次上述洗板过程。B. 2. 2 样品制备与加样 待测样品按第7章样品制备步骤制备。阴性对照、 阳性对照作相应处理或按说明书进行。按1 0 0 L/ 孔分别加入制备好的检测样品、 阴性对照和阳性对照; 酶联板加盖或用保鲜膜包好,4 孵育过夜。酶联板用自来水彻底冲洗, 再用1P B S T 洗涤3次, 每次3 m i n。B. 2. 3 加酶标抗体 用酶标抗体稀释缓冲液按说明将酶标抗体稀释至工作浓度并加入到酶联板中,1 0 0 L/孔, 酶联板加盖或用保鲜膜包好,3 7 孵育4 h。酶联板用自来水彻底冲洗, 再用1P B S T 洗涤3次, 每次3 m i n。B. 2. 4 加底物 将底物p N P P加入到底物缓冲液中使终浓度为1 m g/mL( 现配现用) ,1 0 0 L/孔加入到酶联板中,室温避光孵育。B. 2. 5 读数在不同的时间内如3 0 m i n、6 0 m i n、9 0 m i n、1 2 0 m i n或更长时间, 用酶联仪在4 0 5 n m处读O D值。B. 3 结果判定B. 3. 1 质量控制要求 对照孔的O D4 0 5值( 缓冲液孔、 阴性对照及阳性对照孔) 应在质量控制范围内, 即: 缓冲液孔和阴性对照孔的O D4 0 5值0. 1 5, 当阴性对照孔的O D4 0 5值5; 同一样品的重复性基本一致, 数值差别2,判为阳性; 样品O D4 0 5值/阴性对照O D4 0 5值接近阈值, 判为可疑样品, 需重做一次或用其他方法验证;样品O D4 0 5值/阴性对照O D4 0 5值2, 判为阴性。若不满足B. 3. 1的质量控制要求, 则不能进行结果判断。7S N/T5 3 8 72 0 2 1以正式出版文本为准附 录 C( 规范性)免疫层析试纸条检测C. 1 试剂样品抽提缓冲液配制方法按照B. 1. 5执行。C. 2 试纸条保存试纸条应在2 8 冰箱内密封干燥保存。C. 3 检测步骤C. 3. 1 样品准备 待测样品按第7章样品制备步骤制备( 未离心的样品中存在大颗粒物质, 影响液流上行, 容易导致检测效果不佳) 。每一样品取约2 5 0 L至1. 5 mL的离心管中, 以能走完试纸条为宜。C. 3. 2 样品检测检测前将试纸条恢复至室温。 将试纸条T线一端垂直插入到样品液中, 样品液高度不要超过试纸条上的MAX线。测试观察的时间以3 m i n 6 m i n为宜。对于病毒浓度低的样品时间可适当延长。C. 4 结果判定质控C线显红色, 测试T线显红色, 检测结果为阳性。质控C线显红色, 测试T线未显色, 检测结果为阴性。质控C 线和测试T 线均未显色, 说明试纸条失效, 检测结果无效。C. 5 试纸条是否有效的判断方法用阳性对照进行测试, 测试T 线显红色, 质控C 线显红色, 说明整个系统工作正常。用阳性对照进行测试, 测试T 线显红色, 质控C 线未显色, 说明羊抗兔失效。用阳性对照进行测试, 测试T 线未显色, 质控C 线显红色, 说明测试T 线的特异性抗体失效。用阳性对照进行测试, 若测试T 线未显色, 质控C 线也未显色, 说明整个测试纸条失效。8S N/T5 3 8 72 0 2 1以正式出版文本为准附 录 D( 规范性)R T - P C R 检测D. 1 试剂D. 1. 1 核酸提取试剂T r i z o l或合格的R NA提取试剂盒。D. 1. 2 电泳缓冲液T A E(5 0)三羟甲基氨基甲烷(T r i s)2 4 2 g冰乙酸(C2H4O2)5 7. 1 mL乙二胺四乙酸二钠(N a 2 E D TA2 H2O)3 7. 2 g灭菌双蒸水定容至1 0 0 0 mL, 用时稀释至1TA E 。D. 2 检测步骤D. 2. 1 核酸提取 称取0. 1 g样品加液氮研磨成粉末状, 迅速将其移入灭菌的1. 5 mL离心管中, 或将6. 2制备的上清液3 5 0 L移入1. 5 mL离心管中; 加入1 mL的T r i z o L试剂, 剧烈振荡3 m i n;4 1 2 0 0 0 g离心1 0 m i n; 将上清液移入一新离心管中, 加入0. 5 mL三氯甲烷, 猛烈振荡1 5 s;4 1 2 0 0 0 g离心1 5 m i n; 小心吸取上层无色水相到新离心管中; 加入等体积异丙醇, 混匀; 室温静置1 0 m i n;4 1 2 0 0 0 g离心1 0 m i n, 弃上清; 加入1 mL 7 5%的冷乙醇洗涤沉淀;4 1 0 0 0 0 g离心1 0 m i n, 弃乙醇; 沉淀于室温下充分干燥后溶于3 0 L D E P C - H2O中,-2 0 保存备用。注: 此处以0. 1 g样品为例进行核酸提取, 实际检测时如样品量有变化, 加入的试剂可按比例调整; 或者按照商品化R NA 提取试剂盒进行操作。D. 2. 2 引物序列根据已报道的LMV基因序列, 自行设计引物, 序列如下:正向引物LMV - F:5- C AT C AA C G C AG G G C TA C AT G G TAAA C A C A - 3 ; 反向引物LMV - R:5-T C C C G T T T T C TATA C A C C AAA C C AT C AAT C - 3 。扩增片断长度约2 7 2 b p。D. 2. 3 反转录 反应体系:2 0 L; 在0. 2 mL P C R管中加入总R NA 1 L,d NT P s(1 0 mm o l/L)1 L,D E P C - H2O 1 0 L, 反向引物LMV - R(2 0 m o l/L)2 L,7 0保温5 m i n; 冰上放置5 m i n; 再加入5反转录缓冲液4 L,R N a s i n(4 0 U/L)1 L,M - ML V(2 0 0 U/L)1 L,4 2保温1 h, 得到c D NA后用作P C R的模板。 设置阳性对照、 阴性对照及空白对照。D. 2. 4 P C R扩增P C R扩增体系见表D. 1, 共计2 0 L; 设置阳性对照、 阴性对照及空白对照。9S N/T5 3 8 72 0 2 1以正式出版文本为准表D. 1 P C R扩增体系名称浓度加样量/L1 0P C R b u f f e r( 含M g2+)2d N T P s1 0 mm o l/L0. 6正向引物LMV - F2 0 m o l/L0. 5反向引物LMV - R2 0 m o l/L0. 5T a q D NA聚合酶2 U/L1模板2D E P C - H2O1 3. 4 反应程序:9 5 5 m i n;9 5 4 5 s,5 8 4 5 s,7 2 3 0 s,3 5个循环;7 2 1 0 m i n。注: 如采用商品化一步法R T - P C R试剂盒, 可按照说明书进行操作, 将步骤D. 2. 3和D. 2. 4合并进行。D. 2. 5 琼脂糖凝胶电泳 制备1. 5%的琼脂糖凝胶, 按比例混匀电泳上样缓冲液和P C R扩增产物, 用D NA M a r k e r作为分子量标记, 进行电泳。电泳结束后在凝胶成像仪中观察是否扩增出预期的特异性D NA条带, 并拍摄记录。D. 3 结果判定 如果阴性对照和空白对照未出现条带, 阳性对照出现预期2 7 2 b p的条带, 样品未出现预期大小的条带, 则可判定样品为LMV阴性。 如果阴性对照和空白对照未出现条带, 阳性对照出现预期2 7 2 b p的条带, 样品出现相同大小的条带, 则可判定样品为LMV阳性。01S N/T5 3 8 72 0 2 1以正式出版文本为准附 录 E( 规范性)R T - R P A 检测E. 1 试剂R T - R P A扩增试剂盒。其他试剂按照D. 1执行。E. 2 检测步骤E. 2. 1 核酸提取按照D. 2. 1执行。E. 2. 2 引物序列按照D. 2. 2执行。E. 2. 3 R T - R P A扩增 向含有酶的反应管中分别加入2反应缓冲液2 9. 5 L, 正向引物LMV - F及反向引物LMV - R( 均为2 0 m o l/L) 各1 L, 醋酸镁(2 8 0 mm o l/L)2. 5 L,D E P C - H 2 O 1 4 L,R NA模板2 L; 轻轻吸打混匀, 放置于4 0 金属浴中反应4 0 m i n。E. 2. 4 产物检测 反应结束后向上述R T - R P A扩增产物中加入5 0 L苯酚/三氯甲烷(1:1) 溶液, 充分混匀后1 2 0 0 0 r p m离心2 m i n, 取5 L上清液按比例与电泳上样缓冲液混匀, 用D NA M a r k e r作为分子量标记, 进行电泳1. 5%的琼脂糖凝胶。电泳结束后在凝胶成像仪中观察是否扩增出预期的特异性D NA条带, 并拍摄记录。E. 3 结果判定 如果阴性对照和空白对照未出现条带, 阳性对照出现预期2 7 2 b p的条带, 样品未出现预期大小的条带, 则可判定样品为LMV阴性。 如果阴性对照和空白对照未出现条带, 阳性对照出现预期2 7 2 b p的条带, 样品出现相同大小的条带, 则可判定样品为LMV阳性。11S N/T5 3 8 72 0 2 1以正式出版文本为准参 考 文 献 1 N e w h a l l AG. S e e d t r a n s m i s s i o n o f L e t t u c e m o s a i c . P h y t o p a t h o l o g y,1 9 2 3,1 3(2) :1 0 4 - 1 0 6.2 D i n a n t S,L o t H. L e t t u c e m o s a i c v i r u s . P l a n t P a t h o l o g y,1 9 9 2,4 1(5) :5 2 8 - 5 4 2.3 R e v e r s F,L o t H,S o u c h e S,e t a l . B i o l o g i c a l a n d m o l e c u l a r v a r i a b i l i t y o f l e t t u c e m o s a i c v i r u s i s o l a t e s . P h y t o p a t h o l o g y,1 9 9 7,8 7(4) :3 9 7 - 4 0 3.4 K r a u s e - S a k a t e R,F a k h f a k h H,P e y p e l u t M,e t a l . A n a t u r a l l y o c c u r r i n g r e c o m b i n a n t i s o l a t e o f L e t t u c e m o s a i c v i r u s . A r c h i v e s o f V i r o l o g y,2 0 0 4,1 4 9(1) :1 9 1 - 1 9 7.5 C a n d r e s s e T,L o t H,G e r m a n - R e t a n a S,e t a l . A n a l y s i s o f t h e s e r o l o g i c a l v a r i a b i l i t y o f L e t -t u c e m o s a i c v i r u s u s i n g m o n o c l o n a l a n t i b o d i e s a n d s u r f a c e p l a s m o n r e s o n a n c e t e c h n o l o g y . J o u r n a l o f G e n e r a l V i r o l o g y,2 0 0 7,8 8(9) :2 6 0 5 - 2 6 1 0.6 N a i d u R A,K a r t h i k e y a n G,J a r u g u l a S,e t a l . F i r s t r e p o r t o f t h e n a t u r a l i n f e c t i o n o f C o r e o p s i s a u r i c -u l a t a N a n a w i t h L e t t u c e m o s a i c v i r u s i n t h e U n i t e d S t a t e s . P l a n t D i s e a s e A n I n t e r n a t i o n a l J o u r n a l o -f A p p l i e d P l a n t P a t h o l o g y,2 0 0 8,9 2(3) :4 8 6 - 4 8 6.7 L i m S, Z h a o F M, Y o o R H, e t a l . C h a r a c t e r i s t i c s o f a L e t t u c e m o s a i c v i r u s I s o l a t e I n f e c t -i n g L e t t u c e i n K o r e a . 2 0 1 4,P l a n t P a t h o l . J . 3 0(2) : 1 8 3 - 1 8 7.8 S h a r m a P, S h a r m a S, S i n g h J, e t a l . I n c i d e n c e o f L e t t u c e m o s a i c v i r u s i n l e t t u c e a n d i t s d e -t e c t i o n b y p o l y c l o n a l a n t i b o d i e s p r o d u c e d a g a i n s t r e c o m b i n a n t c o a t p r o t e i n e x p r e s s e d i n E s c h e r i c h i a c o -l i . J o u r n a l o f V i r o l o g i c a l M e t h o d s,2 0 1 6,2 3 0:5 3 - 5 8.9 夏俊强, 严敦余, 王清和, 等.莴苣花叶病毒病的研究病原鉴定.植物病理学报,1 9 8 4(4) :2 4 1 - 2 4 5.1 0 夏俊强, 王清和, 严敦余, 等. 莴苣花叶病毒病的研究病害的分布、 损失、 寄主和传播. 植物病理学报,1 9 8 6(1) :3 7 - 4 0.1 1 周雪平, 濮祖芹. 侵染豌豆的莴苣花叶病毒(LMV) 研究. 江苏农业学报,1 9 9 1,7(2)4 4 - 4 7.1 2 钱荣田, 骆江洪, 龚志强.侵染莴苣的莴苣花叶病毒( LMV) 研究. 浙江农业大学学报,1 9 9 6,2 2( 3) : 3 0 4 - 3 0 7.1 3 郑滔, 陈炯, 陈剑平. 莴苣花叶病毒浙江余杭分离物基因组全序列及其结构分析.病毒学报,2 0 0 2,1 8(1) :6 6 - 7 0.1 4 尚巧霞, 向海英, 韩成贵, 等. 莴苣花叶病毒北京分离物基因组3 末端序列分析.中国农学通报,2 0 0 7,2 3(7) :8 8 - 9 0.21S N/T5 3 8 72 0 2 1