SN∕T 3484-2013 绵羊肺腺瘤病检疫技术规范(出入境检验检疫).pdf

书书书?中华人民共和国出入境检验检疫行业标准? ? ? ? ? ? ? ?绵羊肺腺瘤病检疫技术规范? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?发布? ? ? ? ? ? ? ? ? ?实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发 布书书书前?言?本标准按照? ? ? ? ? ?给出的规则起草?本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口?本标准起草单位? 中华人民共和国黑龙江出入境检验检疫局?本标准主要起草人? 张子群? 吴永生? 徐义刚? 谢晓峰? 由轩? 胡晓亮? ? ? ? ? ? ? ?绵羊肺腺瘤病检疫技术规范?范围本标准规定了绵羊肺腺瘤病的临床诊断和荧光? ? ?检测方法?本标准适用于绵羊肺腺瘤病的检疫?规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的? 凡是注日期的引用文件? 仅注日期的版本适用于本文件?凡是不注日期的引用文件? 其最新版本? 包括所有的修改单? 适用于本文件? ? ? ? ?基因检验实验室技术要求? ? ? ? ?出入境动物检疫实验样品采集? 运输和保存规范?缩略语下列缩略语适用于本文件? ?值? 荧光信号量达到设定的阈值时所经历的循环数? ? ? 乙二胺四乙酸钠? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 绵羊肺腺瘤病毒? ? ? 绵羊肺腺瘤病? ? ? 聚合酶链式反应? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 实时荧光? ? ? ? ? ? ? ?聚合酶? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?临床诊断? ?临床症状主要症状是渐进性呼吸障碍? 尤其是在运动之后? 呼吸困难明显?症状严重程度反应肺部肿瘤发展程度?呼吸道积液是 ? ? ? 最典型的症状? 通过听诊很容易检查到湿罗音?将病羊后肢抬起? 低头? 鼻孔流出大量泡沫样黏液? 这就是典型的? 小推车试验? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 这一特征具有典型诊断意义?病程早期? 咳嗽和厌食不常见? 但一旦出现明显的临床症状? 体重呈渐进性下降?病程数周或数月后? 常因伴发细菌性肺炎死亡? 特别是溶血性曼氏杆菌? 以前称为巴氏杆菌? ?部分临床患病动物出现外周淋巴细胞减少症? 主要是? ?和 ?淋巴细胞及相应的嗜中性粒细胞减少? 现象? 这一点可能有助于临床诊断? ?病理变化? ? ?尸体剖检多数病例的 ? ? ? 病变局限于肺部? 但也可发生于胸腔内? 外? 转移到淋巴结和其他组织?典型病? ? ? ? ? ? ? ?例? 病羊的肺肿大? 由于感染后大部分肺组织? 尤其是在肺的尖叶? 心叶和膈叶? 广泛存在大量灰白 ? 浅黄褐色结节和灰色坚硬病变?结节直径? ? ? 外形呈圆形? 质地坚实? 密集的结节发生融合? 形成大小不一? 形态不规则的大结节?病羊的肺脏比正常大?倍?倍?病变通常存在于两个肺叶? 两边的严重程度不一样?肿块坚硬? 灰色或浅紫色? 有光泽? 半透明? 并经常以狭窄的气肿带与正常的肺组织分开?在呼吸道内存在清亮泡沫状白色液体是特征病症? 甚至在病变只有几毫米时? 此症状也是明显的?在病变严重的情况下? 当切断气管或将气管下垂时? 即可从气管内流出这种液体?切开肿瘤可见多量液体渗出? 细支气管周围淋巴结增生和显著增大?肿瘤表面上方的胸膜炎明显? 某些病例的中间存在脓肿?非典型 ? ? ? 的肿瘤由单个的或聚集的白色结节组成?表面干燥? 切开肿瘤? 渗出液较少? 并与周围组织有明显的分界? ? ?组织病理学变化组织学病变的主要特征是?型肺细胞增生? 末端细支气管非纤毛状上皮细胞也可能受影响?立方形的或圆柱状肿瘤细胞取代正常的薄的肺泡细胞?有时形成乳头状生长深入肺泡? 也可能存在支气管内增生?终末细支气管和呼吸性支气管黏膜也同时形成乳头状突起? 并和肺泡内的肿瘤细胞混合起来?腺瘤灶周围的肺泡腔内充满巨噬细胞?特征性病变是在临近瘤病变的肺泡中有大量肺泡巨噬细胞积聚?腺瘤灶在生长过程中? 逐步侵犯大区域肺组织? 腺瘤间质增多? 出现大量幼稚黏液组织和纤维组织?疾病晚期可能发生广泛性的纤维变性? 偶尔在黏多糖物质内可能存在松散的结缔组织结节?在并发梅迪?维斯纳病的部位? 可能发生明显的血管周围? 细支气管周围和间质淋巴浸润?非典型? ? ?的组织学特征基本上与典型? ? ?类似? 但有炎症反应? 出现大量淋巴细胞和浆细胞?和纤维变性? ?流行病学? ? ?潜伏期较长? 多在半年以上? 甚至长达几年?自然条件下? ? ?可通过接触? 飞沫传播? 也可经人工感染诱发?主要经呼吸道传染? 病羊咳嗽时排出的飞沫和深度气喘时呼出的气雾中含有带病毒的细胞和细胞碎屑? 健康羊吸入后感染? ? ? 一般只感染绵羊? 偶尔也见于山羊? ? ? 主要见于成年羊? 感染羊多见于?岁以下?岁?岁为发病高峰期? 但新生羔羊可诱发此病?我国许多品种的绵羊均敏感? 发病羊多为?岁?岁的成年羊? ? ?在不同国家和地区发生方式具有明显差异? 主要有暴发? 地方性流行和散发几种流行发生方式? 但多数呈地方散在性流行? 在多年流行地区? 发病率较低? ? ? 流行具有季节性? 一般冬季后期和早春是流行高峰期?北半球冬季羊群一般实行圈养? 寒冷时? 羊群团缩成一团? 增加病毒感染机会? 促成? ? ? 的发生?自然发生的 ? ? ? 常与其他病原体如梅迪 ? 维斯纳病毒同时感染? 二者具有协同作用? 感染 ? ? ? 的绵羊更易发生梅迪 ? 维斯纳病毒的横向传播?发病后常伴发细菌性肺炎? 甚至引起死亡?其他资料参见附录?实时荧光? ? ?试验? ?仪器和器材? ? ?荧光? ? ?仪? ? ?高速冷冻离心机? ? ?生物安全柜? ? ?恒温水浴箱? ? ? ? ? ? ? ? ? ?冰箱和? ?低温冰箱? ? ?纯水或超纯水器? ? ?旋涡混合器? ? ?组织研磨器或手持式均质器? ? ?无菌离心管? ? ? 和可调微量移液器? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 离心管和吸头? 用? ? ? ?水处理后高压灭菌备用? 处理方法参见附录? ? ?样品肺脏样品? 全血? ? ? 做抗凝剂? 或血凝块?按照? ? ? ? ?进行样品采集? 运输和保存? ?病毒? ? ?提取使用商品化血液及组织 ? ? 提取试剂盒提取? ? ?实验应在符合? ? ? ? ?的实验室进行? ?引物与探针根据绵羊肺腺瘤病毒的? ? ?基因序列设计合成一对特异性引物?上游引物? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?下游引物? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?探针? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?对照设置检测过程中分别设置阳性? 阴性对照组?阳性? 阴性对照由指定单位提供? 空白对照除用灭菌双蒸水代替模板外? 测定步骤相同? ?荧光? ? ?反应体系? ? ? ?缓冲液? 无? ? ? ? ?酶? ? ? ? ? ?等商品化试剂?荧光? ? ?反应体系见表?表?荧光? ? ?反应体系成?分用?量? ? ? ?缓冲液? 无? ? ? ? ?酶? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?上游引物 ? ? ? ? ? ?下游引物 ? ? ? ? ? ? ? ?探针? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?无 ? ?酶的灭菌二级水? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?体系总体积为? ? 盖紧? ? ?反应管管盖后? 用涡旋混合器进行混匀? 瞬间离心备用? ?实时荧光? ? ?反应参数将? ?中加样后的? ? ?反应管放入实时荧光? ? ?仪内? 记录样本摆放顺序?反应参数设置? ? ?第一阶段? ? ? ? ? ?第二阶段? ? ? ? ?个循环? 荧光收集设置在第二阶段每次循环的退火延伸时进行? ?结果判定? ? ?结果分析条件设定读取检测结果?阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线的最高点? 不同仪器可根据仪器噪音情况进行调整? ? ?质控标准阴性对照和空白对照无? ?值并且无扩增曲线? 阳性对照的? ?值应? ? 并出现典型的扩增曲线?如阴性对照? 空白对照和阳性对照条件不满足以上条件? 此次实验视为无效? ? ?结果描述及判定? ? ? ?阴性无? ?值并且无扩增曲线? 表明样品中无绵羊肺腺瘤病毒核酸? ? ? ?阳性? ?值? ? 并出现典型的扩增曲线? 表示样本中存在绵羊肺腺瘤病毒核酸?结果综合评价采用实时荧光? ? ?方法检出阳性? 表示绵羊肺腺瘤病毒核酸阳性? 再结合流行病学资料? 在临床病史? 临床检查? 尸体剖检和组织病理学检查的基础上才能最终判定是否发生绵羊肺腺瘤病? ? ? ? ? ? ? ?附?录? 资料性附录?绵羊肺腺瘤病概述?绵羊肺腺瘤病? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 又称绵羊肺腺癌病? 羊慢性进行性肺炎? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 非洲语意为? 驱赶病? ? 和羊肺瘤? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 是由绵羊肺腺瘤病毒? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 引起的绵羊的一种接触传染性肿瘤病? 山羊很少发生? ? ? ?属反转录病毒科?型反转录病毒属? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 一般也称为乙型反转录病毒属? 基因组? ?为线性单股正链? ? 全长? ? ? ? ? ? ?的? ?进入细胞后? 在病毒反转录酶的作用下?以病毒? ?为模板? 完成反转录过程? 该病毒的? ?成为前病毒?历史上? ? ?的病原体是疱疹病毒的观点曾一度占优势? 尽管已经从? ? ?的肿瘤中分离到羊疱疹病毒?型? ? ? ? ? ? 但流行病学研究和人工实验感染没有证实 ? ? ? ? ?具有 ? ? ? 致病作用?羊疱疹病毒?型? ? ? ? ? 可引起绵羊的恶性卡他热? 但与 ? ? ? 没有任何关系?在 ? ? ? 肿瘤中也曾多次分离到羊慢病毒? 但这些病毒均没有? ? ?致病作用? ? ? ?不能做组织培养? 主要原因是缺乏体外适合病毒繁殖的细胞培养体系? 并且在感染绵羊体内又缺乏该病毒的抗体? 尚无特异性血清学方法用于 ? ? ? 的活体诊断? 因此难以确认该病毒是病原体?然而? 随着分子生物学技术的进步? 从 ? ? ? 感染绵羊或虽然没有感染但有群交接触史的未感染绵羊的肺液? 肿瘤? 外周血液和淋巴样组织中检测到? ? ? ? 但无肿瘤病史的未感染绵羊中从未检测到? ? ? ?最近? 已从 ? ? ? 肿瘤? ? 中获得? ? ? ? 全长前病毒克隆? 用这个克隆短暂转染的细胞系制备的? ? ? ?病毒粒子气管内接种新生羔羊? 诱发出? ? ?肿瘤? 由此证明? ? ? ?是? ? ?的病原体? ? ?是最常见的绵羊肺肿瘤病? ? ? ?年最早在南非发现? 人们在驱赶有此病的羊群时? 发现病羊呼吸非常困难? 于是当时用荷兰语命名这种未知疾病为? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 即? 驱赶病? ?目前? ? ?在世界很多国家都有发生? 主要发生于欧洲? 美洲? 非洲? 东南亚等地区? 几乎所有养羊业发达的国家和地区? 包括我国新疆? 内蒙古等地区都有该病的发生和流行? 严重影响世界范围内养羊业的发展?澳大利亚和新西兰由于地理位置的隔绝从未有 ? ? ? 报道? 冰岛在? ? ? ? 年采用严格扑杀病羊的方法? 人为消灭了 ? ? ?由于还不能在体外培养繁殖? ? ?反转录病毒? 因此像病毒分离之类的常规诊断方法不适用于? ? ? 的诊断?感染绵羊的血清中检测不到病毒特异性抗体? 所以还没有诊断活动物 ? ? ? 的血清学试验方法?目前主要依靠临床和病理学检查? 结合流行病学资料? 作出诊断?还可以采用? ? ?检测肿瘤?引流淋巴结和外周血单核细胞中病毒的 ? ? 和 ? ? 进行确诊? ? ? ? ? ? ? ?附?录? 规范性附录?试剂配制? ?焦碳酸二乙酯? ? ? ? 双蒸水双蒸馏水? ? ? ? ? ?室温放置? ?以上? ? ? ? ?蒸汽高压灭菌? ? ? ?或室温保存? ?离心管? 吸头处理方法离心管? 吸头应放在? ? ? ? ?水中浸泡? ?以上? 取出烘干 ? ? ? ?水后? 在? ? ? ? ?蒸汽高压灭菌? ? ? ? 晾干后使用? ? ? ? ? ? ? ?书书书?中华人民共和国出入境检验检疫行?业?标?准绵羊肺腺瘤病检疫技术规范? ? ? ? ? ? ? ?中 国 标 准 出 版 社 出 版北京市朝阳区和平里西街甲?号? ? ? ? ? ?北京市西城区三里河北街? ?号? ? ? ? ? ?总编室? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?网址? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷?开本? ? ? ? ? ? ? ?印张? ? ?字数? ?千字? ? ? ?年?月第一版? ? ? ?年?月第一次印刷印数? ? ?书号? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?定价 ? ? ? ? 元