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第三章 基因工程的常规技术
第一节 凝胶电泳技术
凝胶电泳 它是一种分析鉴定重组DNA分子及蛋白质与核酸相互作用的重要实验手段，同时也是分子生物学研究方法的技术基础。
用琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶等作为支持介质的区带电泳法称为凝胶电泳。
本节主要介绍琼脂糖凝胶电泳技术。
一、DNA的琼脂糖凝胶电泳检测
仪器
电泳仪、电泳槽、凝胶成像系统、移液枪
药品
Agarose、 TAE buffer、EB（溴化乙锭）
上样缓冲液（6X）
0.25% 溴酚蓝、0.25%二甲苯氰醇、40%蔗糖；水溶液4℃保存。
二、琼脂糖凝胶电泳基本原理
在电场的作用下，带有负电荷的DNA或RNA核苷酸链，依靠无反应活性的稳定的介质（琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶）和缓冲液，以一定的迁移率从负极移向正极。根据核酸分子大小不同、构型或形状的差异，以及所带电荷的不同，可以通过电泳将其混合物中的不同成分彼此分开。
DNA分子的迁移速度与其分子质量的对数值成反比关系。
当用EB对DNA样品染色时，加入的EB就插入DNA分子中形成荧光结合物，荧光的强度与DNA含量成正比，如果用DNA片段的标准品作电泳对照，就可以估计出待测样品的分子量大小和浓度。
三、琼脂糖凝胶电泳的影响因素
除样品DNA本身的大小外，琼脂糖凝胶电泳的分辨能力与胶的浓度、缓冲液、电压等有很大关系。
琼脂糖凝胶电泳的参数
缓冲液：TAE（醋酸缓冲液）、TBE （硼酸盐缓冲液）
凝胶的含量：根据检测的DNA大小
加DNA样品：<1μg，指示剂
电泳条件：大片断低电压长时间，小片段高电压短时间
染色和观察：溴化乙锭（ethidium bromide，EB）染色，在300nm波长的紫外下观察（凝胶成像仪）。
能看到0.05 μg的微量DNA
DNA的片断大小与荧光强度成正比。
第二节 分子杂交技术
所依据的原理是，带有互补的特定核苷酸序列的单链DNA或RNA，当它们混合在一起时，其相应的同源区段将会退火形成双链的结构。
核酸杂交技术主要有Southern杂交、Northern杂交和菌落原位杂交等。
一、探针与探针标记
• 杂交的主要目的是为了检测出同源DNA序列，而为了达到这一目的，必需要有标记的探针。
• 带有能检测的标记物的DNA或RNA叫探针。
• 使DNA或RNA带有可检测的标记物的过程叫探针标记。
1.切口平移标记
• 用一定浓度的DNaseI在双链DNA的一条链的有限位置上打开切口。
• 利用DNA聚合酶I的5’ →3’的核酸外切酶活性将DNA一条链上的核苷酸一个一个的切除，同时暴露出另一条单链DNA。
• 以这条单链DNA为模板，利用DNA聚合酶I的5’ →3’的DNA聚合功能把一个一个带有标记的dNTP合成上去。
2.随机引物标记
• 能与任何DNA模板的多个位点配对互补的多个不均一序列寡聚核苷酸DNA片段叫随机引物。
• DNA聚合酶Klenow大片段能在随机引物的引导下以带有标记的dNTP为原料合成新的与模板DNA互补的探针。
二、Southern杂交
是根据毛细管作用的原理，使在电泳凝胶中分离的DNA片段转移并结合在适当的滤膜上，然后通过同标记的单链DNA或 RNA探针的杂交作用检测这些被转移的DNA片段，这种实验方法叫做DNA印迹杂交技术。由于它是由E.Southern于1975年首先设计出来的，故又叫Southern DNA 印迹转移技术。
杂交步骤：
1.酶切
2.电泳
3.转膜
4.杂交
5.显影
三、Northern杂交
1979年，J.C.Alwine等人发展而来，是将RNA分子从电泳凝胶转移到硝酸纤维素滤膜或其他化学修饰的活性滤纸上，进行核酸杂交的一种实验方法。由于这种方法与Southern印迹杂交技术十分类似，所以叫做Northern印迹技术（Northern blotting）。
Southern杂交和Northern杂交的主要差别：
1.对象不同（DNA/RNA）
2.DNA在凝胶电泳分离后，用碱处理变性，形成单链。
RNA一般是进行变性电泳，在分离RNA的同时消除二级结构。
RNA变性电泳方法主要有甲醛变性电泳、羧甲基变性电泳和乙二醛变性电泳三种。
四、Western杂交
Western blotting是用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质，然后将蛋白质从电泳凝胶中转移到硝酸纤维素膜或其它支持物上，然后同放射性同位素标记的特定蛋白质之抗体进行反应，这种技术广泛用于基因在蛋白质水平上的表达研究。
五、菌落原位杂交
也叫原位杂交，是指把菌落或噬菌斑转移到硝酸纤维素膜上，使溶菌的DNA同滤膜原位结合，带有DNA的滤膜烘干后，与放射性同位素标记特异的DNA或RNA探针杂交。
是直接菌落或噬菌斑为对象来检测重组子的技术。

第三节 PCR技术
聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）的方法始于20世纪70年代早期，由Khorana和他的同事最先提出的建义。
在1983年，美国Cetus公司人类遗传研究室的科学家K.B.Mullis发明的。
PCR是一种在体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法，有称之为体外扩增法。
一、PCR技术的基本成分
PCR的成分包括：待扩增的模板、引物、DNA聚合酶、四种脱氧核苷酸的混合物以及反应缓冲液。
模板：模板是含有待扩增序列的DNA或从mRNA反转录来的cDNA。
PCR的引物：是指与待扩增的靶DNA区段两端序列互补的人工合成的寡核苷酸片断。
引物的设计原则：
1.引物碱基G＋C含量以45%－55%为宜。
2.其长度通常在15~30个核苷酸之间。
3.Tm值应高于55℃。
4.PCR扩增的长度一般：<2kb。
5.引物3’端碱基要求严格配对。
6.尽量减少自身配对。
7.避免两条引物互补。
8.引物要特异。
9.可以在引物的5’端加上合适的酶切位点。
二、PCR技术的原理和过程
1.PCR反应的温度循环周期
PCR 反应的每一个温度循环周期都是由DNA变性、引物退火和反应延伸三个步骤完成的。图中设定的反应参数是94℃变性1min， 60 ℃退火1min， 72 ℃延伸1.5min。如此周而复始，重复进行，直至扩增产物的数量满足实验需求为止。
PCR反应体系的确立
2.20uL反应体系中各成分的母液浓度及加入量
Water
Buffer（10×）
Mg++（25mM）
dNTPs（10mM）
Primer1（10uM）
Primer2（10uM）
Taq（5U/uL）
Templets
12.8
2
1.6
0.4
1
1
0.2
1
3.PCR扩增程序举例
Tem.
94℃
94℃
60℃
72℃
72℃
Time
00:08:00
00:00:30
00:00:40
00:01:00
00:07:00
Cycles
――
30
――
三、荧光定量PCR
是通过荧光染料或荧光标记的特异性探针，对PCR产物进行标记跟踪，实时在线监控反应过程结合相应软件可以对产物进行分析，计算待测样品的初始模板量。
荧光定量PCR仪是一种带有激发光源和荧光信号检测系统的PCR仪，通常配有电脑系统及相应的软件。
标记方法主要有：内插染料 、双标记探针、分子信标等。
荧光定量PCR的优点
1.全封闭的PCR过程，无需跑胶。
2.采用dUTP－UNG酶防污染，有效降低污染机会。
3.对样品扩增的整个过程进行实时监控。
4.使用引物和荧光探针同时与模板特异性结合，提高了PCR反应的特异性。
5.在样品扩增反应的最佳阶段进行数据采集，增加了定量的精确性。
6.线性关系直接。
7.结果分析更加快捷方便。
第四节 生物芯片
美国《财富》杂志载文指出，在20世纪科技史上有两件事影响深远，一是微电子芯片，它是计算机和许多家电的心脏，它改变了我们的经济和文化生活，并已进入每一个家庭；另一件事就是生物芯片，它将改变生命科学的研究方式，革新医学诊断和治疗，极大地提高人口素质和健康水平。
生物芯片就是在一块指甲大小的玻片、硅片、尼龙膜等材料上放上生物样品，然后由一种仪器收集信号，用计算机分析数据结果。目前制备芯片的固相材料有玻片、硅片、金属片、尼龙膜等。
生物芯片主要分为基因芯片和蛋白芯片。
一、基因芯片
• 基因芯片技术是指将大量寡核苷酸或DNA探针（与核酸分子杂交相反，亦称靶基因）按特定的排列方式固化在固相支持物表面，按碱基互补配对的原则，与标记的特异的单链DNA或RNA（待测样品）分子杂交形成双链，通过对杂交信号的检测分析，即可得出样品分子的数量和序列信息。
• 由于基因芯片上固定的探针可以是cDNA、寡核苷酸或来自基因组的基因片段，且这些探针固化于芯片上形成基因探针阵列，故基因芯片又被称为DNA芯片、DNA阵列、cDNA芯片、寡核苷酸阵列等 。
• DNA芯片技术工作流程主要包括：芯片的制备、样品的准备与标记、杂交、信号检测和数据分析处理，其中最关键的是芯片的制备。
• DNA芯片基本应用可分为两个主要方面：定量分析（主要指测序和突变检测）与定性分析（主要指对基因表达的研究）。
如： 1.DNA序列测定
2.突变及多肽性分析
3.基因表达分析
4.基因组研究
5.基因诊断
6.药物研究与开发
二、蛋白芯片
蛋白芯片是以蛋白质代替DNA作为检测对象。
其原理是将各种蛋白质有序的固定于某种介质的载体上成为检测的芯片，然后用标记了有特定荧光物质的抗体与芯片作用，与芯片上的蛋白质相匹配的抗体将与其对于的蛋白质结合，在将未与芯片上的蛋白质互补的抗体洗去之后利用荧光扫描仪或激光共聚焦扫描技术，检测芯片上各点的荧光强度，在通过计算机分析蛋白质之间的相互关系以及基因表达功能等。
第五节 基因文库构建
基因文库的基本概念
从特定生物个体中分离的全部基因，这些基因以克隆的形式存在（人工构建）。
根据构建方法的不同，基因文库分为：
基因组文库（含有全部基因）
cDNA文库（含有全部蛋白质编码的结构基因）
一、基因组文库
基本步骤:
1.分离基因组 DNA
2.DNA 的断裂
物理剪切 (包括吹吸、振荡和超声波）和限制性酶解
3.DNA 片断的分离与连接
4.包装，转染或者转化
二、cDNA 文库的构建

• 基本步骤：
• 1) mRNA 分离、纯化和分级 分离 2) cDNA的合成
• 3) 与载体的连接
• 4) 转化

第六节 酵母双杂交系统
一、酵母双杂交系统的原理
酵母双杂交技术作为发现和研究在活细胞体内的蛋白质与蛋白质之间的相互作用的技术平台，在近几年来得到了广泛运用。
酵母双杂交技术既可以用来研究哺乳动物基因组编码的蛋白质之间的互作，也可以用来研究高等植物基因组编码的蛋白质之间的互作。因此，它在许多的研究领域中有着广泛的应用。
酵母双杂交系统的建立是基于对真核生物调控转录起始过程的认识。细胞起始基因转录需要有反式转录激活因子的参与。反式转录激活因子，例如酵母转录因子GAL4在结构上是组件式的（modular），往往由两个或两个以上结构上可以分开，功能上相互独立的结构域（domain）构成，其中有DNA结合功能域(DNA binding domain,DNA-BD)和转录激活结构域（activation domain，DNA-AD）。这两个结构域将它们分开时仍分别具有功能，但不能激活转录，只有当被分开的两者通过适当的途径在空间上较为接近时，才能重新呈现完整的GAL4转录因子活性，并可激活上游激活序列（upstream activating sequence, UAS）的下游启动子，使启动子下游基因得到转录。
根据这个特性，将编码DNA-BD的基因与已知蛋白质Bait protein的基因构建在同一个表达载体上，在酵母中表达两者的融合蛋白BD-Bait protein。将编码AD的基因和cDNA文库的基因构建在AD-LIBRARY表达载体上。同时将上述两种载体转化改造后的酵母，这种改造后的酵母细胞的基因组中既不能产生GAL4，又不能合成LEU、TRP、HIS、ADE，因此，酵母在缺乏这些营养的培养基上无法正常生长。当上述两种载体所表达的融合蛋白能够相互作用时，功能重建的反式作用因子能够激活酵母基因组中的报告基因HIS、ADE、LACZ、MEL1，从而通过功能互补和显色反应筛选到阳性菌落。将阳性反应的酵母菌株中的AD-LIBRARY载体提取分离出来，从而对载体中插入的文库基因进行测序和分析工作。
二、酵母双杂交系统的应用
• 1、利用酵母双杂交发现新的蛋白质和蛋白质的新功能
• 2、利用酵母双杂交在细胞体内研究抗原和抗体的相互作用
• 3、利用酵母双杂交筛选药物的作用位点以及药 物对蛋白质之间相互作用的影响
• 4、鉴定不同突变子与靶蛋白的反应能力。
• 5、筛选特异克隆。
第七节 DNA测序
一、.Sanger双脱氧链终止法DNA序列分析
在用DNA聚合酶复制核苷酸链时，如果在反应物中加入一定量的某一种2’，3’-双脱氧核苷酸, 如ddTTP，就会在应当掺入dT的位置掺入ddT。由于ddT核苷酸的3’碳原子不含有羟基而不能和下一个核苷酸的5’碳原子上的磷酸根结合形成磷酸二脂键，所以DNA链就不能继续向后延伸。
Sanger据上述原理设计了DNA测序的链终止法。测序时要进行4个独立的反应，每个反应中有一种dNTP用32P标记，并且在4个反应中分别加入一定比例的ddATP, ddTTP, ddGTP和ddCTP。 这样反应一段时间后，每个反应中都会生成一系列由对应的那种ddNTP结尾的长短不一的DNA片段，而且这些片段的5’端序列是相同的。最后，将反应物变性后用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，经放射自显影后就可以读出DNA的碱基顺序。
二、.Maxam-Gilbert化学分析法
1977年由美国大学A.M.Maxam和W.Gilbertf发明。
其原理是用化学试剂处理末端放射性标记的DNA片断，造成碱基的特异性切割。由此产生的一组具有不同长度的DNA链的反应混合物，经凝胶电泳按大小分离和放射自显影之后，便可根据x光底片上所显示的相应谱带，直接读出待测DNA片断的核苷酸序列。
肼：
又叫联氨（NH2.NH2），在碱性条件下，与胸腺嘧啶（T）和胞嘧啶（ C ）作用。再通过六氢吡啶的作用，使两个磷酸分子从糖片断上释放出来，从而导致在核苷酸位置上发生DNA的断裂。
盐存在的条件下，联氨同胸腺嘧啶（T）的反应便会被抑制，最终只发生胞嘧啶碱基特异的切割反应。
由此来区别C和C+T这两种化学反应
硫酸二甲酯（(CH3O)2SO4）是一种碱性的化学试剂。
在它的作用下，DNA碱基环中的氮原子会发生甲基化反应，在中性的PH值环境中，可导致配糖键发生水解，使去碱基的糖-磷酸键十分微弱，在碱性条件下磷酸分子就能从DNA链上脱落，造成链的断裂。
鸟嘌呤（G）的N7>腺嘌呤(A)的N3 4～10倍
在六氢吡啶的作用下，从脱氧核糖上移去2个磷酸分子，使DNA链在甲基化的鸟嘌呤G位点断裂。
化学修饰法的优点：
1. 不需要体外酶切；
2. 只要有末端标记，无论单双链都可用来测序。
至少能测出250个bp
限制因素：测序胶的分辨率
三、DNA测序分析的自动化
用四甲基若丹明（tetramethylrhodamine）作荧光剂，预先标记M13引物DNA5’-末端，按标准的双脱氧链终止法同引物进行反应，用聚丙烯酰胺电泳分析。在电泳过程中，用激光激发电泳的片断产生荧光，被荧光感受器接受，最终转换成电信号，被计算机读出，或打印出来。