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奶粉中蛋白质含量测定

1.前言：在蛋白质研究领域中，用一种快速准确的方法来检测蛋白浓度是必不可少的。与双缩脲法、紫外吸收法相比，新建立的考马斯亮蓝法在许多情况下已成为定量检测蛋白浓度的首选方法。同时，与传统的Lowry法相比，该法具备更易操作，更快，更灵敏以及受其它试剂和非蛋白成分干扰较小等优势。其检测原理是基于染料考马斯蓝G250和蛋白质之间可以形成特异性结合。详细的研究表明[1]，该染料可以自由存在于四种不同的离子形式中。相比之下，染料更多的阴离子形式与蛋白质结合且结合后显蓝色，在590 nm左右具有最大吸收。因此通过测定染料中蓝色离子的量就可以折算出蛋白质的量，这通常可以在595 nm处测定吸光度获得。
2.实验方案及原理：
（1）①实验流程：
前期原料配备
前期原料配备

标准曲线绘制

样品测定

②实验前期准备：
Ⅰ、称取奶粉样品，配制成5mg/ml的溶液。再取0.3ml该溶液于试管，再加入0.7ml去离子水，9ml考马斯亮蓝G-250，配制成奶粉含量为150μg/ml的样品溶液；
Ⅱ、配制浓度为0.4mg/ml的标准牛血清蛋白（BSA）溶液,选用五个点绘制标准曲线，这五点BSA溶液体积分别为0.1，0.2，0.4，0.6，0.8ml，同时相应地加入9ml考马斯亮蓝G-250和水，每份配制成体积为10ml的溶液，即每份含BSA的量为40，80，160，240，320μg。浓度分别为4，8，16，24，32μg/ml。配制相同两组，分别记为A组和B组。如下表：
溶液序号
0
1
2
3
4
5
标准牛血清蛋白（BSA）/ml
0
0.1
0.2
0.4
0.6
0.8
去离子水/ml
1
0.9
0.8
0.6
0.4
0.2
考马斯亮蓝G-250/ml
9
9
9
9
9
9
③ 做紫外分光光度测试，得每份试剂蛋白质-色素结合物在595nm波长下的最大光吸收A。因其光吸收值与蛋白质含量成正比，所以可用于蛋白质的定量测定；
④ 根据所测数据，通过作图得直线A=aC+d(A为蛋白质-色素结合物在595nm波长下的最大光吸收,C为溶液浓度)。再对样品做紫外分光光度测试，得其最大光吸收A'，则样品中：
Ⅲ、蛋白质浓度为C'=（A'－d）/a
Ⅳ、样品蛋白质含量计算公式为10C'/1500×100%。
3.主要试剂和仪器：
考马斯亮蓝G-250，去离子水，标准牛血清蛋白（BSA）
移液管20ml两支，50ml一支，15个25ml比色管，石英比色皿一对，日本岛津UV—vis紫外分光光度仪等。
4.实验结果与数据分析：
（1）通过实验测出每份试剂蛋白质-色素结合物在595nm波长下的最大光吸收A，设计表格如下：
序 号
1
2
3
4
5
A/ L·g-1·cm-1

B/ L·g-1·cm-1

平均值

（2）通过紫外分光光度计测得样品中蛋白质-色素结合物在595nm波长下的最大光吸收A'，设计表格如下：

1
2
3
平均值
A'/ L·g-1·cm-1

（3）通过对上述数据利用Origin 8.0软件进行处理得标准曲线，同时对曲线进行拟合，得其函数表达式，并与之前实验步骤中A=aC+d有关量一一对应，最后根据公式C'=（A'－d）/a得蛋白质浓度C'，再
根据公式10C'/1500×100%得样品蛋白质含量。
（4）对上述实验结果及整个实验过程，包括实验方案和实验误差进行分析、总结，撰写实验报告。
5.参考文献（实验方案设计过程）：
［1］Zuo,S.-S.and Lundahl,P.A micro-Bradford membrane pro-
tein assay[J].Analyt.Biochem,2005,284:162-164.
[2]宁正祥.食品成分分析手册[M].北京:中国轻工业出版
社, 1997: 72-81.
[3]许家喜.蛋白质的检测方法与乳制品中蛋白含量测定
[4].武汉大学分析化学, 2009, 24(1): 66-69