丙型肝炎中P7蛋白.doc

丙型肝炎病毒中p7蛋白的研究
摘要：p7蛋白是一个介于丙型肝炎病毒(HCV) 结构蛋白和非结构蛋白之间的一小蛋白，在脂质膜中形成六聚体阳离子通道，在病毒的自然感染过程中起一定的作用。金刚烷胺和长烷基链的亚氨基糖衍生物可抑制p7形成的阳离子通道，从而对HCV的治疗发挥重要作用。本文就p7 蛋白的基因组结构、合成与功能作一综述。
关键字：丙型肝炎病毒；p7蛋白；
丙型肝炎病毒(hepatitis C virus , HCV)
单股正链的RNA 病毒,全长为916 kb ,包括1 个大的开放阅读框(ORF) 和两侧的5′,3′非编码区(UTRs)。核糖体通过进入HCV 5′UTR 端的内部核糖体进入位点( IRES) ,将HCV基因组翻译成1 个聚蛋白前体. 前体聚蛋白被宿主和病毒的蛋白酶共同切割成为若干个具有独立功能的HCV 蛋白,根据功能的不同分别命名为C、E1、E2、p7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A 和NS5B ,它们不但在HCV 的生活史中发挥着重要的作用,也影响着宿主细胞的信号传导、凋亡及物质代谢等一系列生化过程.
P7蛋白的基因组结构与合成
p7是一个小的疏水性多蛋白，包括36个氨基酸残基，编码基因位于结构蛋白和非结构蛋白之间，是膜相关性的，定位在内质网内。他包括2个跨膜α螺旋，与一小的带电细胞质环相连，其氨基和梭基端尾朝向细胞内质网腔。这一带电环为亲水片段，p7蛋白属于病毒孔道蛋白家族，在细胞膜内其同源寡聚体形成水相孔道，这些蛋白最具特征性的代表是流感A病毒的M2通道p7通过与谷胧甘肤—S—转移酶(GST )在大肠杆菌中的融合可获得高水平 的表达，二者之间被—6组氨(HIS)连接子所分离形成GST—HIS—p7复合结构。通过透射电子显微所成像发现，GST—HIS—p7和裂解的近于天然HIS—p7均呈具有纬度的环状结构.。化学交联数据表明p7形成五聚体或六聚体结构，Griffin et al研究表明在HepG2细胞中,重组的HCV p7可交联成六聚体，在体外大肠杆菌表达的p7亦可形成六聚体。
p7 蛋白的功能
p7 蛋白是膜定位蛋白。在 HCV 基因组中，p7是相对分子质量( Mr) 最小的病毒蛋白。研究证实，HCV 前体蛋白的加工在宿主细胞内膜系统上进行，膜的定位作用对非结构蛋白的加工成熟尤为重要[4]。非结构蛋白 C-末端通过 NS5B C-末端疏水α-螺旋定位在内质网膜上[5]，而 N- 末端则是通过 NS2与p7蛋白结合，直接被定位在内质网膜上。因此，p7 蛋白的膜定位作用很可能是非结构蛋白加工成熟的前提条件。D.Agostino 等人[6]的研究也证实, 包括p7蛋白在内的许多致瘤病毒蛋白都能与细胞内膜相互作用。p7 蛋白14区和9区α- 螺旋结构是膜定位区, 两次跨膜将 p7蛋白锚定在内质网膜上。尽管构成A- 螺旋结构的氨基酸存在广泛的变异性, 但其中个别保守氨基酸对保持跨膜结构的稳定, 起到了重要作用[7]。
15区是3 个氨基酸组成的保守环结构, 具有离子通道活性, 这种活性可被抗病毒药物金刚烷抑制[8]。Griffin 等人[9]的研究证实, 融合表达的 p7 蛋白在HepG2细胞内可以形成六聚体, 六聚体围成了离子通道, 这个离子通道是由单体中 K-G-R 3 个氨基酸的侧链基团围成。同样的结论也在人工生物膜上得到证实。
p7 蛋白还决定病毒的感染力。Sakai 等人[10]用HCV1a/2a 重组的 p7 蛋白病毒感染黑猩猩, 发现这种嵌合病毒丧失了感染性, 因此推测, p7 蛋白在病毒的感染过程中可能与基因组的其他区域发生了特异性作用, 包括 5’-UTR 以及 C、E、NS2 等蛋白。对KGR 基序中的碱性氨基酸突变表明, 突变将导致病毒丧失感染能力。与 HCV 同属的 BVDV 病毒的 p7蛋白研究也发现, p7 蛋白与病毒 RNA 的复制没有相关性, 但用细胞培养系统进行病毒扩增时, p7 蛋白却是不可缺少的[8]。这些现象都说明, p7 蛋白不影响 HCV 基因组的复制, 但参与了 HCV 感染细胞的过程。
丙型肝炎病毒P7 蛋白体外原核表达状况
设计扩增全长HCVP7 基因片段的特异引物，以H/FL 质粒DNA（含HCV1acDNA全长序列）为模板，通过PCR 扩增全长HCVP7 基因，定向克隆到pQE30、pGEX4T- 2、pET32a（+）3 种不同类型的原核表达载体中。将重组后包含HCVP7 基因的原核表达载体转化表达型大肠杆菌BL21（DE3）pLysS 或SG13009（PREP4），并做异丙基硫化-β- D- 半乳糖苷（Isopropyl- beta- D- thiogalactoside，IPTG）诱导表达，通过SDS- PAGE 和Western blot 鉴定HCV P7 蛋白原核表达的情况。
HCV p7蛋白反式调节基因p7T P2的克隆化及生物信息学分析
应用PCR技术从HepG2细胞提取的cDNA扩增p7TP2基因，选用pGEM．T载体进行TA克隆，通过PCR，限制性酶切分析及测序进行鉴定。再将其亚克隆到真核表达载体pcDN硝M3．1／myc．His A，通过PCR，限制酶切分析进行鉴定，并应用生物信息学初步分析其物理化学性质、蛋白质结构域、功能及染色体定位。结果：成功从HepG2细胞提取的cDNA中扩增出p7TP2基因，编码区为495核苷酸(nt)，编码产物为164氨基酸残基(aa)，经核苷酸序列数据库(GenBank)同源序列的搜寻，与已知基因序列和蛋白序列之间没有显著同源性，属于未知功能新基因，并成功进行TA克隆，酶切、测序均正确，并进一步亚克隆至pcDNAⅢ3．1／mvc．His A真核表达载体，生物信息学分析此基因位于8q24．3，必17 146．5，理论pI：9．26，半衰期为30 h(体外哺乳类网状细胞)，属于不稳定蛋白，疏水指数较高，含有潜在的三个螺旋区域，四个B折叠，四个蛋白激酶C磷酸化位点，一个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点，5个N．肉豆蔻酰位点，预测可能为具有不紧密的球蛋白结构。具有信号肽及两个跨膜结构域．
p7 蛋白 丙型肝炎病毒潜在抑制靶点
HCV p7 蛋白是63 个氨基酸的疏水性蛋白。Lin等人122用带标签的融合蛋白, 证实p7 蛋白介于E2和NS2 之间。p7 蛋白N-端序列分析表明, p7 蛋白始于747 位, 并在E2 C-端疏水区引导下定位于质网膜, 终止于809 位。由于宿主信号肽酶对E2-p7 和p7-NS2 裂解存在活性差异, p7-NS2 ( 809P810AA) 比E2-p7( 746-747AA) 位点更容易断裂, E2-p7 降解不完全, 因此常见E2 和E2-p7 两种稳定的形式。不像病毒其他蛋白可在转录同时或转录后立即被降解, E2-p7-NS2 降解发生延迟, 因此常能检测到E2-p7-NS2的存在132。E2-p7 ( 746 ~ 747AA) 和p7-NS2 ( 809P810AA) 切点附近的氨基酸比较分析证实, 两处的氨基酸具有高度的保守性, 其中E2-p7 酶切位点N-末端氨基酸为A-L-E, p7-NS2 位点C-末端氨基酸为AY-A。
筛选HCV p7蛋白反式调节基因
应用基因芯片技术：以含有HCV全基因组的pBRTM质粒作为模板，应用聚合酶链反应（PCR）扩增p7蛋白编码基因片段，以常规的分子生物学技术构建表达载体pcDNA3.1（－）-p7。以脂质体技术转染肝母细胞瘤细胞系HepG2，提取总mRNA，逆转录为cDNA，与转染空白表达载体pcDNA3.1（－）的HepG2细胞进行DNA芯片分析并比较。
应用抑制性消减杂交技术：以HcV p7表达质粒pcDNA3．1(一)一p7转染HepG2细胞，以空载体pcDNA3．1(一)为对照；制备转染后的细胞裂解液，从中提取n1RNA并合成cDNA，经Rsa I酶切后将实验组cDNA分成两组，分别与两种不同的接头衔接，再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性PCR，将产物与T／A载体连接，构建cDNA消减文库，并转染大肠杆菌进行文库扩增，随机挑选克隆PcR后进行测序及同源陛分析．
p7蛋白与HCV的治疗
HCV感染世界上3 %的人群，在西方是肝移植的主要指征，急性感染常是无症状的，在大多数患者可持续导致慢性。HCV抗病毒的治疗局限在1 型干扰素(长效干扰素)或联合病毒唑、核昔类似物拉米夫定等，这一治疗方案是昂贵的，很少患者可以接受，且只对50%的患者有效.在病毒基因型中，经常出现治疗耐药。由于在体外不能成功培养病毒，使的疫苗和新治疗方法研究受到阻碍。所有这些使的对HCV离子通道p 7的靶向抗病毒治疗显得尤为重要.对与p 7离子通道蛋白同一家族流感病毒A的M2孔道的研究发现：金刚烷胺是第一个抗病毒药物。
展望
p7 蛋白是HCV 基因组中最小的蛋白, 长期以来对其功能知之甚少, 它既不是结构蛋白, 又难归于非结构蛋白。近几年的研究不仅认识了p7 蛋白结构和细胞定位, 而且还发现了它的部分生物学功能。无论是对前体蛋白的定位, 还是离子通道作用, 或是参与病毒的感染过程, 这些功能都会影响到HCV 生活周期。因此, 对p7 蛋白深入研究可为阻断p7 蛋白的离子通道活性、破坏其膜定位、抑制其与病毒前体蛋白其他区域以及UTR 的相互作用等找到答案,从而探索出抑制HCV 新途径。p7 蛋白可能成为新的抗病毒靶点。
参考文献
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2.成军慢性病毒性肝炎发病机制的分子生物学研究[期刊论文]-世界华人消化杂志 2002(2)
3.成军慢性丙型病毒性肝炎肝脏脂肪变的机制及其意义[期刊论文]-世界华人消化杂志 2002(9)
4.刘妍;杨倩;成军基因表达谱芯片筛选NS5ATP3转染细胞差异表达基因[期刊论文]-世界华人消化杂志 2004(2)
5.李克;王琳;成军酵母双杂交技术筛选克隆HCV核心蛋白结合蛋白基因1[期刊论文]-世界华人消化杂志 2001(12)
6.Majumder M;Steele R;Ghosh AK;Zhou XY, Thornburg L, Ray R, Phillips NJ, Ray RB Expression of
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7.Lo SY;Selby M;Tong M;Ou JH Comparative studies of the core gene products of two different
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