微生物应用技术实验实训项目2010.doc

第一部分 单项技能训练
技能训练一 食用菌的形态结构观察
一、技能训练目标
观察食用菌菌丝体的生长状态，利用显微镜认识食用菌的营养体和繁殖体的微观结构，观察食用菌子实体的形态特征，了解和熟悉各种食用菌子实体的类型和特征。
二、材料用具
1．材料 平菇、香菇、双孢蘑菇、草菇、金针菇、木耳、银耳、猴头菌、灵芝、密环菌、等食用菌子实或菌核浸制标本或干标本、鲜标本及部分食用菌的菌丝体、担孢子等。
2．仪器工具 光学显微镜(100--600倍)、接种针、无菌水滴瓶、染色剂(石炭酸复红或美蓝等)、酒精灯、75％酒精瓶、火柴、载玻片、盖玻片、刀片、培养皿、绘图纸、铅笔等。
三、方法步骤
1．菌丝体形态特征观察
(1)菌丝体宏观形态观察。①观察平菇、草菇、金针菇、香菇、木耳、银耳及香灰菌、蘑菇、猴头、灵芝等食用菌的试管斜面菌种或PDA平板上生长的菌落，比较其气生菌丝的生长状态，并观察菌落表面是否产生无性孢子。②观察菌丝体的特殊分化组织：蘑菇菌柄基部的菌丝束；密环菌的菌索；茯苓的菌核。
(2)菌丝体微观形态观察。①菌丝水浸片的制作：取一载玻片，滴一滴无菌水于载片中央，用接种针挑取少量子菇菌丝于水滴中，用两根接种针将菌丝拨散。盖上盖玻片，避免气泡产生。②显微观察：将水浸片置于显微镜的载物台上，先用10倍的物镜观察菌丝的分支状态，然后转到40倍的物镜下仔细观察菌丝的细胞结构等特征，并辨认有无菌丝锁状联合的痕迹。
2．子实体形态特征观察
(1)子实体宏观形态观察。仔细观察各种类型的食用菌子实体的外部形态特征，并比较各种子实体的主要区别，特别注意菌盖、菌柄、菌褶(或菌孔、菌刺)、菌环、菌托的特征，并对之进行比较、分类。
(2)子实体微观形态观察。①菌褶切片观察：取一片平菇菌褶置于左手，右手持刀片，横切菌褶若干薄片漂浮于培养皿的水中，用接种针选取最薄的一片制作水浸片，显微观察平菇担子及担孢子的形态特征。②有性、无性孢子的观察：灵芝担孢子水浸片观察；(以上各类孢子的观察可用标本片代替)。
四、作业与思考题
描述菌丝体的生长状态，并画出所观察菌丝、无性孢子、担子及担孢子的形态结构图。

技能训练二 食用菌母种培养基的制备、灭菌

一、 技能训练目标
了解食用菌母种培养基的配方，熟悉母种培养基(PDA或PSA)的配制方法，了解高压蒸汽灭菌锅的构造，掌握正确使用高压蒸汽灭菌锅的方法，掌握食用菌母种转管技术。
二、 材料用具
1．配制培养基材料 马铃薯、葡萄糖(或蔗糖)、琼脂、水等。
2．仪器用具 高压蒸汽灭菌锅(手提式或立式)、可调式电炉、铝锅(20cm)、汤勺、切刀、切板、量杯、纱布、漏斗(带胶管和玻璃管)、止水夹、漏斗架、试管(18mm×180mm)、lcm厚的长形木条(摆放斜面时垫试管用)、棉花(未脱脂)、捆扎绳、标签、天平等。
3．消毒灭菌药品及设备 高锰酸钾、37％甲醛溶液、坩埚或烧杯、紫外灯、0．25％新洁尔灭溶液、5％石炭酸溶液、喷雾器等。
4．转管材料及用具 平菇试管母种、接种箱、接种铲、酒精灯、火柴、95％酒精、75％酒精棉球、肥皂等。
三、方法步骤
1．母种培养基(PDA或PSA)配方 马铃薯200g，葡萄糖(或蔗糖)20g，琼脂15--20g，水1 000ml，pH自然。
2．母种培养基的配制
(1)熬制。先将马铃薯洗净，挖芽去皮，准确称取200g，然后将马铃薯切成玉米大小的颗粒或薄片。用量杯量取1 000ml水于铝锅内煮马铃薯，待水沸后计时20—25min，当马铃薯酥而不烂时，用双层纱布进行过滤于量杯中，洗净铝锅滤渣，将滤液到回锅中继续以文火加热，加入葡萄糖(或蔗糖)和琼脂，待琼脂溶化，不断搅拌，以免糊锅，注意补足水量。
(2)分装。将熬成的培养基保持文火，趁热分装。用勺将培养基加入漏斗中，左手握2--5支试管，右手持漏斗下面的玻璃管人试管口内，同时放开止水夹，让培养基逐个流入试管内，培养基高度约为试管长度的1／6--1／5，注意避免将培养基沾于试管口内外。分装后的试管，在培养基凝固前必须立放。
(3)制棉塞。用叠放式将未脱脂棉做成棉球，塞人试管口，管口内棉塞底部要求光滑，棉塞侧面要求无褶皱，棉塞长度的2／3在管口内，1／3在管口外。棉塞的松紧以手提棉塞轻晃试管不滑出为度。
(4)捆把。以10支试管为一捆，用捆扎绳扎紧。贴上标签，准备灭菌。
3．培养基的灭菌
(1)手提式高压灭菌锅的构造。锅体、提把、压力表、安全阀、排气阀、灭菌锅腔、筛架、锅盖、胶垫圈、紧固螺栓等。
(2)高压灭菌锅的使用方法。加水→灭菌物入锅→上盖一对称、均匀地扭紧螺栓→加热升温→压力至0.5kg／cm2时，打开排气阀排除锅内冷空气，压力降至0，排气阀有大量热蒸汽冲出时，关闭排气阀→继续升温，压力升至lkg／cm2，温度达到121℃时，开始调火稳压25-30min→灭火，自然降压至压力为0.5kg／cm2时，可慢慢打开排气阀徐徐降压至0(若降压太快，试管中的培养基易沸腾浸湿棉塞)→锅盖半开，让锅内多余蒸汽逸出，锅内的余热烘干棉塞→开盖，取物→摆斜面→斜面试管上应覆盖洁净的厚毛巾或几层纱布，防止试管内产生过多的冷凝水。
4．接种箱的消毒灭菌
(1)药物消毒。首先用0.25％新洁尔灭溶液擦净接种箱内外。再用5％石炭酸溶液进行接种箱内的喷雾。
(2)熏蒸杀菌。在坩埚或烧杯里倒人37％甲醛溶液l0ml／m3，放进接种箱内，再通过接种箱的侧门在甲醛溶液中加入高锰酸钾5～8g。甲醛溶液与高锰酸钾发生强烈的氧化还原反应，立即沸腾并挥发出有强烈刺激的气体，其中产生的原子氧有较强的杀菌作用。
(3)紫外线灯照射。接种箱的顶部安装一根30～40W紫外灯，在接种箱玻璃外面覆盖一层牛皮纸或几层报纸，黑暗中开灯照射才能增加杀菌效果。紫外线灯照射1h后关灯，待臭氧散后可开始接种。
5．食用菌母种转管技术
(1)手及试管的表面消毒。先用肥皂洗手，在用0.25％新洁尔灭溶液浸泡手2min，或以75％酒精棉球擦手和试管表面(包括母种试管和待接种的斜面试管)。在接种箱外的酒精灯的火焰上燃烧试管外的棉塞，即用手捂灭火焰，立即将试管放入接种箱内。
(2)菌种移接(转管)方法。两手从接种孔伸人接种箱内，左手持母种管和斜面管并排于拇指和食指间，拇指在上，食指在下。注意两支试管口对齐于火焰上方。右手持接种铲，用手背指缝拔掉试管棉塞，使棉塞底部朝外。将接种铲先蘸取95％酒精，后在火焰中烧灼接种铲的前段，待冷却后伸入母管内切取一小块带有培养基的菌种块，迅速移入斜面培养基的中部，菌丝朝上。然后，将右手指缝夹住的棉塞底部及周围在火焰上烧一下，立即塞入试管口，旋紧棉塞。再换上第二支斜面试管，重复如上操作。注意，菌种移接的整个过程的动作要求做到“快”、“准”，接种铲不要触碰管口及管壁。接种后的试管应立即贴标签，写上菌号及日期，进行适温培养。
(3)结束工作。菌种移接完毕，将酒精灯盖灭，95％酒精瓶盖上。然后，打开侧门，取出试管。将接种箱内的汽水擦干，清除箱内的残留物，将酒精灯、酒精瓶、接种铲等用具摆放整齐。
四、作业与思考题
1. 试述母种培养基的配制过程。
2. 怎样正确使用高压蒸汽灭菌锅对培养基进行灭菌?
3. 菌种移接的全过程为什么要在火焰上方进行?指出菌种移接过程中的关键技术。

技能训练三 食用菌菌种的分离

一、 技能训练目标
掌握食用菌母种制作技术，学会母种的分离方法。
二、材料用具
斜面培养基、三角瓶培养基、平菇种菇、接种箱、酒精灯、接种针、接种铲、镊子、剪刀或刀片、金属丝等。
三、方法步骤
1.种菇的选择　　从产量高、长势好、适应性强、无杂菌、无病虫害的群体中选择菇形正、朵大、菌盖厚实、生长健壮、八成熟的子实体作为分离材料。种菇应保持菇体洁净备用。
2．母种分离方法
(1)组织分离。此法是生产中最常用的方法，它操作简便，菌丝萌发快，分离所得的菌种遗传性较稳定，在培养基条件适宜的情况下，能保持原有菇种的优良性状和特性。
操作方法：在分离前用75％的酒精棉球擦菇体进行表面消毒，在接种箱内将种菇撕开，用消毒镊子或剪刀或刀片在菌盖与菌柄的交接处的组织上取一小块(绿豆大小)移至试管斜面培养基的适当位置，迅速塞上棉塞。将分离的试管放在25℃恒温箱内培养7～8d，即可进行转管扩大繁殖成母种。
(2)孢子分离。此法是将子实体成熟后散出的孢子收集在培养基上萌发并长成菌丝而获得的纯菌种。本实训中练习一种成功率较高的方法：
三角瓶钩悬法：取即将弹射孢子的鲜平菇，在菌盖边缘向里2／5处切取带有菌褶的菌盖组织一小块，金属丝钩悬挂菌块于底部有培养基的三角瓶内。注意菌块不要碰瓶壁或培养基。菌褶朝下，使孢子能散落在培养基上。将三角瓶放在25℃条件下，经1～2d在培养基上即可见到白雾状的孢子印，此时以无菌操作，把悬挂于瓶内的菌块取出，再将三角瓶移入恒温箱只培养。经2～3d，培养基表面就会出现许多乳白色的菌落。
四、作业与思考题
试比较组织分离和孢子分离的优缺点。

技能训练四 伴孢晶体染色

一、技能训练目标
学习伴孢晶体的染色方法，观察伴孢晶体在细胞内的位置和形状。
二、材料用具
1.菌种 培养24-48h的苏云金杆菌。
2.器材 MBB（溴酚蓝）染色液，番红染色液，载玻片，接种环及其它染色、镜检用物。
三、方法步骤
1．涂片 取干净载玻片一张于中央滴加蒸馏水少许，用接种环挑取苏云金杆菌芽孢杆菌菌体少许涂成薄片，待其自然干燥（不能加热固定）。
2．初染 滴加MBB染色液涂面上，待涂片出现灰白色结晶后，再滴加MBB染色液，如此反复染持续5-6 min后，用水轻轻冲洗。由于染色剂MBB中含有Hgcl2及酒精，故不需再加热固定，即固定及染色同步完成
3.复染 水洗后的涂片再滴加番红染色液染色30S，水洗，干燥。
4．镜检 油镜下观察伴孢晶体的形状。伴孢晶体呈深蓝色，芽孢边缘红色，内部无色。
四、作业与思考题
1. 绘出你观察的伴孢晶体在细胞中的位置和形状。
2. 何谓伴孢晶体？它有什么重要性？用MBB染色时为什么不需加热固定？

课程综合训练

综合技能训练一 固氮菌的分离与测数(土粒法)

一、 综合训练目标
学习固氮菌的分离与测数法，掌握其菌落特征并观察细胞形态。
二、 材料用具
1. 土样 肥土（过2mm筛）。
2. 器材 阿须贝（Ashby）无氮琼脂培养基，无菌培养皿，9ml无菌水管，90ml无菌水瓶，1ml无菌吸管，镊子及接种、染色、镜检用物。
三、 方法步骤
土粒法
1. 制平板 取融化并保温在50℃左右的无氮培养基，倒入无菌培养皿中，使凝成平板。
2. 接种、培养 用无菌镊子取过筛土粒均匀地点接于平板上，每皿点30～50粒（将平板放在一个具有接种点标记的样纸上）。点接完毕，将皿小心地倒置于28℃温度下培养5～7d。
3. 结果检查
（1）观察土粒周围出现的半透明、粘液状的菌落，有的在培养后期产生褐色或黑褐色色素。用接种环挑取菌落少许，涂片、染色、镜检。若看到个体较大的单生或呈“8”字形排列的球状细胞，细胞表面有较大的荚膜者，即为褐球固氮菌。
（2）统计生长菌落的土粒数，求出固氮菌生长的百分数，以表示该土中固氮菌的相对数量，以及与土壤肥沃性的关系。

四、 作业与思考题
1. 图示镜检的固氮菌细胞形态。
2. 记述固氮菌的菌落特征，并报告测数结果。
3. 固氮菌有何重要价值？在一般土壤中存在的数量约是多少？
4. 如何能得到固氮菌的纯培养？

综合技能训练二 硅酸盐细菌的分离与培养

一、 综合训练目标
学习硅酸盐细菌的分离培养法，观察其菌落特征与细胞形态。
二、 材料用具
1. 土样 肥土。
2. 器材 钾铝硅酸盐培养基或无氮培养基，无菌培养皿，无菌水管，无菌水瓶，无菌吸管，石炭酸复红液，黑素液及接种、染色、镜检用物。
三、 方法步骤
1. 分离 采用稀释平板倾注法（或涂抹法）进行分离。
2. 培养 分离完毕，置培养皿于28～32℃下培养3天。
3. 结果检查
（1）菌落特征观察 菌落圆形凸起，无色，半透明，表面光滑，形如玻璃珠样。用接种针挑取时菌落粘稠而富弹性。
（2）镜检 取菌落少许，涂片、加热固定，染色，镜检。其细胞形态为长杆状，外被肥厚的椭圆形荚膜。发育后期可形成椭圆形芽孢。
四、 作业与思考题
1. 记述菌落特征，图示镜检结果。
2. 分离培养硅酸盐细菌的意义何在？
3. 你能区分固氮菌与硅酸盐细菌的菌落与细胞的形态特征吗？

综合技能训练三 根瘤菌的分离与纯化

一、 综合训练目标
学习从豆科植物根瘤中分离根瘤菌的技术，观察根瘤菌的菌落特征与细胞形态。
二、 材料用具
1. 分离样品 大豆或豌豆植株。
2. 器材 甘露醇酵母汁琼脂培养基（代号：YMA），无菌水，无菌培养皿，95％酒精和1g／L HgC12溶液（分别盛于培养皿中）。
三、 方法步骤
（－）根瘤菌的分离
1. 选瘤 取大豆植株根系并用水冲洗净。选择主根上部发育健壮、饱满的根瘤1～2个，用剪刀将根瘤与连接的一段根一起剪下。
2. 灭菌 将根瘤放入盛95％酒精的培养皿中，浸5min，以排除根瘤表面的气泡，改善表面可湿性，以利于表面灭菌。然后用镊子夹取根瘤放入含1g／L HgC12的培养皿中再浸5min进行表面灭菌。
3. 洗涤 取出灭菌根瘤，放入无菌培养皿中，按无菌操作法倒入适量无菌水，轻轻振摇后，从皿缝中倒掉洗涤水，再加无菌水洗涤，如此反复进行5～6遍，使药剂残毒洗净为止。
4. 菌悬液制备 取玻棒蘸酒精，在灯焰上烧灼灭菌。冷却后，用玻棒端头把根瘤在皿中压破，于皿中倒入约1ml无菌水，与根瘤汁液混匀即成菌悬液。
5. 稀释、接种 取无菌培养皿2副，各倒入无菌水约1ml，用接种环取菌悬液1环，放入第1副皿中混匀后随即取1环，放入第2副皿中，即稀释了二次。然后倒入已融化并保温在50℃左右的YMA培养基少许，迅速摇匀并凝成平板。
6. 培养 置培养皿于28～30℃下培养。快生型菌需3～4d，慢生型菌需7～10d。
7. 检查 待菌落长成后，选择发育良好者，涂片，革兰氏染色，镜检细胞形态及纯度。若己为纯菌落，即可移接于新鲜斜面管上，待生长后保存备用；若菌落不纯，按上述方法再行分离，直至纯化。
(二) 检查纯化的辅助方法：取菌体少许，接入牛肉宵蛋白胨液体培养基中，经培养24h，观察有无菌生长；若无生长，即示该菌株已达纯度。（但也有的菌株在该培养基上有微弱生长现象，可结合镜检加以判断）。
根瘤菌细胞形态 在YMA培养基上为小杆菌，G一反应，染色后呈现出着色部位与不着色部位的环节状，易于判断。
根瘤菌菌落特征 圆形隆起，大小不一，表面光滑，边缘整齐，有光泽，具粘液，呈乳白色或无色半透明。
四、 作业与思考题
1. 列表记述根瘤菌菌落特征。
2. 图示镜检的根瘤菌细胞形态。
3. 分离培养的根瘤菌与根瘤中的根瘤菌在形态上有何异同？
4. 在分离纯化过程中，取得良好效果的关键步骤有哪几点？

综合技能训练四 微生物肥料的质检技术

一、 综合训练目标
了解微生物肥料的质量标准、学习菌肥的微生物检验技术。
二、 材料用具
1. 测试样品 根瘤菌肥料等微生物肥料。
2. 器材　培养基(150m1), 90ml无菌水瓶(内含玻璃珠)，9ml无菌水管，无菌培养皿，lml无菌吸管，无菌刮铲，称样纸，托盘天平，铝盒，干燥器。
三、 方法步骤
1. 菌悬液制备 称取菌肥样品10g(精确至0.01g)加入到90ml带玻璃珠的无菌水中，充分振荡30min，静置20min，即成10－1的菌悬液。
2. 稀释 用lml无菌吸管吸取1ml 10－1的菌悬液加入到9ml无菌水中，吹吸三次混匀成10-2的稀释液，依次稀释至10－8等浓度。
3. 倒平板 取融化并保温在50℃下的培养基一瓶，倒平板。编号10－6、 10－7、10-8，每一稀释度重复三皿，设CK皿1个。
4. 接种、培养 用1ml无菌吸管由高稀释度向低稀释度顺序；分别吸取0.1ml接种于平板上，用无菌刮铲涂匀。CK皿接种无菌水．置28～30℃温度下培养3～7d(培养时间以快、慢生型菌种而定)。
5. 检查、计数取出培养皿，于每个稀释度取5～10个菌落的菌体，进行菌落计数。计算出同一稀释度三个平皿上的菌落平均数。
按以下公式计算：

固体菌剂含菌数以亿/g表示；液体菌剂以亿/ml表示。根据菌落特征判定，分别计出各制品中特定微生物数和杂菌数。
菌落计数原则与计数方法示例：
①首先选择平均菌落数在30～300之间的平皿进行计算，当只有一个稀释度的平均菌落数满足此条件时，则以该平均菌落数乘其稀释倍数报告。
②若有两个稀释度的平均菌落数都在30～300之间，则按二者的菌落总数的比值来决定。若比值小于2，应取两者的平均值报告，若大于2则取其中较小的数字报告。
③若所有的稀释度的平均菌落数均大于300，则应按稀释度最高平均菌落数乘其稀释倍数报告。
④若所有的稀释度的平均菌落数均小于30，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数报告。
⑤若所有稀释度的平均菌落数均不在30～300之间，则应以最接近300或30平均菌落数乘以稀释倍数报告。
⑥菌落数在100以内的按实有数报告；大于100时，采用二位有效数字。
示例　计算菌落总数的方法

例次
不同稀释度的平均菌落数
两个稀释度菌落数之比
菌落总数
（个/ml或个/g）
10－5
10－6
10－7
1
1431
159
22
-
1.6×108
2
2760
235
31
1.3
2.7×108
3
2676
136
34
2.5
1.4×108
4
无法计数
1142
312
-
3.1×109
5
28
12
5
-
2.8×106
6
无法计数
303
18
-
3.0×108
6. 含水量测定　　称样品30g（精确到0.01）二份，放入铝盒中，于105℃温度下烘4h至恒重，取出后放入干燥器中冷却20min，再称重，损失量即为水分量。
计算公式：
7. pH值测定　　采用酸度计测定，随机称样8g，按1：5加入去离子水，浸泡振荡。预热pH计，用标准液（pH　6.68）校正仪器后测定。
四、 作业与思考题
1. 写出菌肥检测的结果，并做出客观评价。
2. 通过测定你对商品性生物肥料的质量有何认识。
微生物肥料的技术指标
项目
液体
固体
颗粒
1.外观
无异嗅味液体
黑褐色或褐色、粉状、湿润、松散
褐色颗粒
2.有效活菌
根瘤菌肥料
　慢生型根瘤菌
　快生型根瘤菌
固氮菌肥料
硅酸盐细菌肥料
磷细菌肥料
有机磷细菌
无机磷细菌
复合微生物肥料

≥5亿/ml
≥10亿/ml
≥5亿/ml
≥10亿/ml

≥5亿/ml
≥15亿/ml
≥10亿/ml

≥1亿/g
≥2亿/g
≥1亿/g
≥2亿/g

≥1亿/g
≥3亿/g
≥2亿/g

≥1亿/g
≥1亿/g
≥1亿/g
≥1亿/g

1亿/g
≥2亿/g
≥1亿/g
3.水分
－
20～35%
＜10%
4.细度
－
粒径0.18mm≥20%
粒径2.5～4.5mm25%
5.有机质

≥20%
≥25%
6.pH值
5.5～7.0
6.0～7.5
6.0～7.5
7.杂菌数
≤5%
≤15%
≤20%
8.有效期
不低于6个月
录自NY227－94，1994，5，30实施
注：在产品标明的有效期前有效活菌数应符合指标要求，出厂时有效活菌数应须高出本指标30%以上。

综合技能训练五 农用抗生素的效价测定

一、 综合训练目标
学习检验农用抗生素的抗菌作用的微生物学测定方法。
二、 材料用具
1. 菌种 病源菌的斜面菌种。
2. 器材 灭菌的PDA培养基，灭菌培养皿，无菌水，灭菌玻璃刮铲，无菌镊子，灭菌的0.6cm圆形滤纸，无菌吸管，接种钩。
三、 方法步骤(所采用方法为滤纸片法)
1. 制PDA平板 取融化的PDA固体培养基以无菌操作法倒入事先灭菌的无菌培养皿中，混匀，待冷却。
2. 菌悬液制备 取病源菌的斜面菌种管1支，加入无菌吸管加入无菌水少许，用接种钩将斜面上菌种菌苔打碎，与无菌水混匀即成。
3. 接种 用无菌吸管吸上述菌悬液0.1ml，加入PDA平板上，用无菌刮铲涂抹均匀。
4. 加抗生素 用无菌镊子先将灭菌的圆形滤纸片浸入抗生素液体中，取出后，控净药液，并稍晾干，放在接种后的平板的不同位置，并做好标记。
5. 培养 将培养皿倒置于28℃下培养3～4天后，观察结果。
6. 结果检查 取出培养皿观察抗生素对病源菌的抑制或杀灭作用，并测量抑菌圈的大小(直径)。
四、 作业与思考题
分析并报告实验结果。

综合技能训练六 微生物产沼气
微生物利用生活有机物垃圾、污水、粪便、农副产品及废弃有机物产生沼气，既可治理环境污染，又可利用废物产生能源，而且是重要的再生能源。特别是我国农村大力推广的“沼气生态园"，将沼气池、厕所、畜禽舍建在日光温室内，成为“四位一体”模式，形成以微生物发酵产沼气、沼液、沼渣为中心的种植业、养殖业、可再生能源和环境保护“四结合”的生态系统，在我国经济和社会的可持续发展中起重要作用。但微生物产沼气费时、费事，效率较低，许多问题亟待研究解决。进一步研究微生物产沼气的机制、条件和工艺是提高其效率的主要途径之一。
进行微生物产沼气实验，有利于深刻认识微生物产沼气的机制，也为进一步研究和制取微生物产沼气提供了一种简捷方法。
一、实验器材
1.菌种
来自于培养室的环境。
本实验的菌种为什么来自于培养室的环境?
利用有机物产生沼气是多种微生物共同作用的结果，一般认为有五大类菌群参与：①发酵性菌群首先将复杂有机物水解转化为可溶性的糖、脂肪酸、氨基酸等，再进一步转化为乙酸、丙酸、丁酸、醇和CO2等。②产氢、产乙酸菌群将丙酸、丁酸、乙醇、乳酸等转化为乙酸、H2和CO2。③耗氢产乙酸菌群利用H2和CO2或代谢糖类产生乙酸。④食氢产甲烷菌群均能以H2/CO2为底物产甲烷，而且大部分菌种能利用甲酸产甲烷。⑤食乙酸产甲烷菌群利用乙酸产甲烷，有的种还能用甲醇、甲胺产甲烷。这5类菌群中的许多菌种在培养室的环境中都存在，只要首先敞开待发酵的有机物，则有许多菌自然地加入进行好氧发酵，然后密封，又有众多菌能进行厌氧发酵，从而使有机物能产生沼气。
2.培养基
50 g稻米或面条。
3.仪器和其他用品
2个1000mL左右带盖的塑料饮料瓶，50cm长的乳胶或塑料软管，医用2号注射针头，橡皮塞，接种环，剪刀，强力黏胶，500mL的玻璃杯等。
二、目的要求
1.理解微生物产沼气的原理，认识微生物产沼气的过程。
2.学习并掌握在实验室制取沼气的一种简捷方法，并为其他发酵实验装置的制作、试验中的技术方法提供经验和借鉴。
三、基本原理
用富含淀粉等有机质的稻米或面条替代废弃有机物产沼气，首先是许多异养微生物将淀粉等不同有机质，在有氧条件下，分解生成简单有机酸、醇和CO2等，然后是产甲烷菌将乙酸、CO2、H2等在厌氧条件下，转化生成甲烷，从而形成以60％～70％甲烷为主，其次为30％～40％CO2，尚有极少数其他气体的沼气。发酵的原料、温度、pH、菌种、反应器等，对沼气产生的速度、质和量都有很大影响。微生物产沼气是一个非常复杂的过程，其机制还没有完全清楚，但可以肯定，它是多种微生物经好氧和厌氧混合发酵的结果。
四、操作步骤
1.发酵装置的制备
将接种环烧红，在2个塑料饮料瓶近底部各烙穿一小孔，孔径大小与乳胶管口径相近，再将一瓶盖中央烙穿一小孔，孔径大小与2号注射针头的尾端大小相近。将乳胶管的两端分别插入两塑料饮料瓶的小孔内，用强力黏胶密封乳胶管与塑料饮料瓶的相交处。将2号注射针头的尾端嵌入瓶盖的小孔，同样密封瓶盖与2号注射针头的相交处。待密封处干燥后，用水检验，确认密封处不漏水，才能算完成制备。这种连接在一起的2个带盖的塑料瓶可称为发酵装置，带注射针头瓶盖的塑料瓶可称为发酵罐，另一塑料瓶则称为储存罐。这种装置可用于实验室的一些发酵实验。
2.好氧发酵
取50 g稻米或面条，置于玻璃杯中，加入200mL的自来水，放28～37℃发酵，24～48h后，见水表面有许多小气泡，表明好氧发酵成功。如果需要加快实验的速度，便将稻米或面条加水煮熟，并放在37℃发酵24h，同样可以使好氧发酵成功。
3.厌氧发酵
将储存罐的盖盖上，并拧紧，好氧发酵过的物料和发酵液全部装入发酵罐，并加自来水将发酵罐灌满，拧紧罐盖，使水滴从注射针头的针尖中溢出，针尖扎入一小橡皮塞，密封注射针头的针管。全套发酵装置放在28～37 cC室内，打开储存罐的盖，进行厌氧发酵，并经常观察厌氧发酵的状况。
4.沼气的检验
厌氧发酵时，在发酵罐中，微生物发酵物料持续地产生沼气，聚集在发酵罐液面的上方，并产生压力将发酵罐中的物料和发酵液逐渐地排入储存罐中。发酵4h后，定期地记录排入储存罐中的物料和发酵液的量，表示厌氧发酵产沼气的量，由于存在CO2+H2O→H2CO3反应，因而沼气中含CO2的量较少，使其可以燃烧。待发酵液绝大多数被排人储存罐时，将储存罐提升，放在高处，使储存罐底部高于发酵罐的颈盖部，拔去发酵罐注射针头上的橡皮塞，这时发酵液将回流到发酵罐，沼气从注射针孔排出，对准注射针的针尖点火，则可见针尖处有气体燃烧，因沼气的火焰小，而且色淡，亮处不易看清，但可见针尖被烧红，或用纸片可在针尖上方被点燃。如果气体离开火源能自行燃烧，说明气体中甲烷含量已达50％，CO2量在40％以下，也表明发酵产生了沼气。1000mL沼气，从针尖排出可燃烧7～8 min。
5.检测产沼气的总量
沼气燃完后，待储存罐的发酵液全部流回发酵罐，将储存罐的盖盖上，并拧紧，小橡皮塞再次扎入发酵罐盖上的针尖，放在28～37℃室内，再打开储存罐的盖，进行厌氧发酵，并经常观察厌氧发酵的状况，记录所产气体的量。待发酵液绝大多数被排人储存罐时，便可进行第二次沼气的检验。如此从厌氧发酵到沼气的检验，还可进行第三、第四……多次，直至产沼气很少。每次所产沼气相加，则是50g稻米或面条在本次实验条件下产生沼气的总量。
6.产沼气的发酵条件试验
根据实验目的要求的需要，可用此发酵装置或再添加某些设备，如水浴锅、搅拌器，进行产沼气的发酵条件试验，包括发酵原料（有机垃圾、秸秆、人畜粪便）、碳氮比、温度、pH、搅拌、活性污泥或菌剂的添加、有害物的控制等实验。将实验得到的产沼气速度、总量等分析比较，获得的结论对改良大规模生产沼气有参考意义和价值。
获得本实验成功的关键
（1）装置的制备，一定要等待密封处的强力胶干燥后，用水检验，确认密封处不漏水，才能用于实验。
（2）注意发酵温度对好氧和厌氧发酵的影响，掌握好观察产沼气和燃烧沼气的时间。
（3）沼气产生后，防止发酵罐泄漏，发酵罐不可靠近高温，更不能接近明火，预防意外事件发生，特别要注意安全。
五、实验报告
1.结果
（1）你的实验好氧发酵的状况如何?厌氧发酵在48h期间产气情况如何?
（2）以培养时间（d）为横轴，产气量（ml）为纵轴，绘制你所试验原料的产气曲线。
2.思考题
（1）如果用农作物的秸秆作为产沼气的主要原料，应采取哪些措施提高产沼气量?
（2）你所制作的沼气发酵装置还能用于哪些微生物学方面的实验?经改造后又能用于哪些实验?
（3）农村目前推广的“沼气生态园"有哪些优越性?又有哪些问题或不足之处?试提出改进建议。

项目七 VA菌根的形态观察与检测
一、 目的要求
学习VA菌根菌的染色技术，观察VA菌根的形态与结构，统计菌根有侵染率。
二、 实验材料
1.采样 连根挖取植物样品1～2种(韭菜、洋葱、小麦、玉米、棉花、三叶草等)。
2.材料 乳酸石炭酸棉蓝染色液、乳酸甘油液(1：1)、10%KOH 、2%HCl、 25%H2O2、 FAA固定液、水浴锅、剪刀、镊子、解剖针、培养皿、试管、染色及镜检等用物。
三、实验步骤
1.采样 挖取植物根系，轻轻抖掉根上泥土，选取小根用清水洗净。
2.固定 将根剪成0.5～1cm的小段，放入装有FAA固定液的培养皿中24h，若样品立即进行染色，可免去此步。
3.净化 将固定在FAA固定液中的根样取出，用水冲洗，移至装有10%KOH溶液的试管中，置于90℃水浴锅中加热1h，可加塞后在0.11Mpa压力下4～7min，加热时间长短视根的老幼而定。
4.清冼 倾去KOH溶液，用水漂洗数次，直至水中不再出现黄色为止。清洗时，切勿用力搅动根样，否则根外菌丝易脱落。
5.软化 用25%H2O2 液浸泡根10～20min，直至根发白为止。幼嫩多汁的根样可免去此步。
6. 酸化 倒去H2O2 液，水洗数次，加入2%HCl浸泡3～4min，使根样酸化，倒去HCl液，但不需水洗。
7.染色 加入乳酸石炭酸棉蓝染色液，置于90℃水浴锅中加热20～30min，或在0.11Mpa压力下4～7min，使染料渗透至根组织和真菌细胞中去。
8.脱色 将根移入装有乳酸甘油液的培养皿中浸泡，以除去根细胞中的染料，使真菌的菌丝、泡囊和丛枝保持染色状态。
9.制片 将染色后的根放入培养皿中，用镊子随机取出根，按照与载玻片长度相垂直的方向，逐条平行间距排列，每片可放置10～20条根段，盖上盖玻片，轻压紧帖，使根段展平，并挤出其中的气泡。
10.镜检 用低倍镜和高倍镜观察，认识皮层内是否有菌丝囊泡、丛枝等结构，并按下列公式计算菌根侵染率。

四、实验报告
绘出镜检的VA菌根形态图，并表明所检植物的菌根侵染率。
五、思考题
1.为什么观察材料要用新鲜的侧根和小根？
2.染色中最关键的步骤是什么？

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