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第7章 花药和花粉培养
花药和花粉培养都是指花粉在培养基上改变其正常发育和机能，不经受精发生细胞分裂，由单个花粉粒发育成完整植株的技术。

花粉粒的发育过程：
减数分裂
花粉母细胞─── →四分体→花粉粒(单核,n) （单核期）
(2n) (n) ↙↘
生殖细胞(n) 营养细胞(n) (双核期，二核花粉粒）
↙↘
精子(n) 精子(n) （三核花粉粒）

第1节 花药培养(单雄生殖)
1 花药培养的一般程序
1）采花粉在单核期左右的花蕾或幼穗；
2）保湿条件下低温等预处理；
3）取出花药表面消毒；
4）将花药接种到适宜的培养基上，在适宜温度下培养（有时需短时预培养）；
5）花粉胚或花粉愈伤组织发育到适当阶段后，转入植株再生培养基，形成花粉植株；
6）染色体加倍；
7）移入土壤栽培。

禾本科植物花粉植株的诱导一般过程:

花药
↓
含有2,4-D (1~2mg/L)的诱导培养基，蔗糖浓度依植物种类不同而异(2~12%)
↓
愈伤组织
↓10~15d,长到直径约1.5~2.0mm时
分化培养基：去掉2,4-D,加入(0.2mg/L)NAA和(1mg/L) KT
↓
愈伤组织表面陆续出现绿色芽原基
↓
芽原基萌发,长成绿色的芽
芽分化的同时或稍后,同一块愈伤组织的下部一般会有根的分化.

2 影响花药培养成功的因素
2.1 材料的选择
1) 亲本植株的基因型
2) 亲本植株的生理状态
3) 花粉的发育时期 ：多数在单核期较易培养成功。
2.2 预处理
常用低温冷藏,可以提高诱导率.不同材料所需温度和时间不同。
还有离心、乙烯利、高温、甘露醇预处理等。
2.3 材料的表面消毒
常用条件:
1) 漂白粉饱和液的上清液浸泡10~15min;
2) 8~10%的安替福民水溶液浸泡5~10min;
3) 0.1%升汞浸泡10min.

2.4 培养基
基本培养基常用：H（烟草）、N6（禾谷类）、C17和W14（小麦）、B5（油菜）、FHG（大麦）等。
与常规培养基相比:降低铵离子浓度，调整铵态氮和硝态氮的比例；有些用麦芽糖等代替蔗糖。
植物生长物质：不同植物、不同品种之间都可能有差异。
多数禾本科植物：外源生长素，尤其2，4-D是促进花粉启动分裂、形成愈伤组织的必要条件。但细胞分裂素类不是必要条件。
其他: 多种维生素、氨基酸和其他有机附加物的添加常有利。有些花药培养中还使用活性炭.

2.5 培养方式
液体培养：液体培养基比琼脂培养基更适合于花药培养
双层培养
花药-花粉分步培养
条件培养基
2.6 培养条件：
温度： 接种后最初几天在较高温度下培养比较有利。
　光：愈伤组织诱导常以暗培养较好; 分化需要的光照长度和给光时间不同植物要求不同。
3 花粉植株的倍性及染色体加倍技术
3.1 花粉植株的倍性
　 花粉植株中倍性多样：n,2n,多倍体，非整倍体
出现二倍体的原因：主要是核内有丝分裂造成。
和接种花粉的时期、培养基中激素的种类和水平、花粉植株的发生方式,以及愈伤组织继代培养时间的长短有关.
3.2 染色体加倍技术
1）利用上述自发的核内有丝分裂;
2）秋水仙素处理：浓度范围0.02~0.4%, 处理方式和部位及使用浓度和时间等随植物种类不同而异.
3.3 花粉植株倍性的鉴定
一般是对茎尖或根尖细胞进行染色体计数；也可用其他指标

4 操作实例:烟草花药培养
选用花粉处于单核晚期(单核靠边期)的花蕾
¯
剥去花蕾萼片，消毒（70%的酒精10 s,饱和漂白粉上清液15~30min）
¯
剥去花冠,将花药接种到含有1%活性碳的H培养基上(+IAA0.1~0.5mg/L)
¯ 26~28oC,适当照光
3周左右后药室开裂,可见乳黄色的胚状体,见光后很快变绿
¯
胚状体逐渐发育成单倍体小苗
¯小苗长出3~4片真叶时
染色体加倍（0.4%的秋水仙碱水溶液浸泡小苗24~48h, 倾出药液,无菌水洗3次）
¯
将小苗分株移栽到T培养基上
¯
小苗长出发达根系时移栽到花盆中（一周内用烧杯将小苗罩起）

第2节 花粉培养(小孢子培养)
将花粉粒从花药中分离出来,进行人工培养，使花粉粒脱分化,进而发育成完整植株的一种技术.
属单细胞培养

1 花粉培养的特点
1) 可以排除花药培养中药壁、药隔和花丝等体细胞的干扰
2) 便于实验结果的分析.
3) 高效、节约.
4）数量多、单细胞、 单倍性和较高的同步性
2 花粉的分离
2.1 直接挤压
将已消毒的花药在液体培养基中用平头的玻璃棒反复挤压花药,挤出花粉。
2.2 压挤-过筛-清洗（挤压法;机械分离法 ）
从花蕾中分离出花药
↓
加蔗糖溶液或分离液，轻压花药,挤出花粉.
↓
经合适孔径的细胞筛过滤入离心管
↓
低速离心
↓
花粉粒沉淀
↓
弃上清液；重新加入蔗糖液,振荡重新悬浮花粉
↓
再次离心,重复3~4次
↓
最后一次用液体培养基代替蔗糖溶液.
↓
上清液吸出后,加入一定量的液体培养基,
↓
血球计数板计数,调整花粉密度，使达到105个/ml左右.

2.3 散落法（shed pollen method）：
在进行花药的液体漂浮培养时，花药会自动开裂，小孢子从花药裂口出散落到培养基中。及时将花药壁从培养瓶中取出,留下的花粉继续培养(水稻,大麦等)
分离的小孢子可以用密度梯度离心纯化。

3 花粉培养技术
3.1 预处理
与花粉培养类似,低温、高温等预处理后，可以提高一些植物小孢子培养的成功率。
3.2 培养基
与花药培养的类似 。激素含量
小麦小孢子：CHB 培养基（麦芽糖）

3.3 花粉培养的方式
1) 直接培养
2) 条件培养 (补充花药提取物)
3) 哺养培养 (nurse culture；保育培养，看护培养)
4) 微室培养

3.4 白化苗现象
白化苗产生的原因目前了解尚少
生理的？
遗传的？

４ 操作实例 烟草花粉培养
花粉发育时期为单核晚期~双核初期的烟草花蕾3oC处理72h
¯ 无菌操作取出花药
接种到 (Nitsch)H培养基
¯ 28oC±1oC，光照，培养3d,
压挤-过筛-清洗的方法分离出花粉,使花粉密度达到7*105个/ml
¯
每瓶1ml分装入20ml的三角瓶
¯ 28oC±1oC,弱散射光
静止的薄层液体培养.
¯ 5~10d后
花粉脱分化形成细胞团
¯　20~30d
细胞团发育成胚状体
¯
将子叶形的胚状体转接到H固体培养基上
¯一周后
胚状体发育成小植株