分子标记辅助选择育种省名师优质课赛课获奖课件市赛课一等奖课件.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,本资料仅供参考，不能作为科学依据。谢谢,第十四章 分子标识辅助选择育种,作物育种：创造变异，,选择,优良变异,传统育种选择方法：依据植株,表现型,选择,缺点：依靠育种家经验；育种年限长；受环境条件影响大（如抗病、抗虫等）,经过,与目标性状基因连锁,、,易于识别,性状作为,标识,，对目标性状进行,间接选择,（相关选择）,第一节分子标识辅助选择意义,第1页,遗传标识：,可遗传、特殊、易于识别表现形式,遗传标识类型：形态标识、细胞学标识、生化标识、分子标识,分子标识：,直接反应基因组间DNA差异遗传标识,分子标识辅助选择：,经过与目标性状基因紧密连锁分子标识来判断控制目标性状基因是否存在,优点：,不需要考虑作物生长条件和环境条件；降低基因互作干扰；快速垒集目标基因，加紧育种进程；降低群体种植规模等,第2页,简称,RFLP,标识,第二节分子标识类型及原理,一、分子标识类型,1、以DNA-DNA杂交为基础DNA标识技术,（in situ hybridization）,限制性片段长度多态性标识,（Restriction fragment length polymorphisms）,可变数目串联重复序列标识,（Variable number of tandem repeats）,简称VNTR标识,原位杂交,简称,ISH,第3页,2、基于PCRDNA标识,1）单引物PCR标识,2）双引物选择性扩增PCR标识,3）经过克隆、测序来构建特殊双引物PCR标识。,第4页,限制性酶切片段选择性扩增,3、基于PCR与限制性内切酶技术相结合DNA标识,分为两类,PCR扩增片段限制性酶切,如AFLP,如CAPs,第5页,Single nucleotide polymorphism，,4、基于单核苷多态性DNA标识,单核苷酸多态性,简称SNP,第6页,用限制性内切酶酶切不一样个体基因组DNA后，含有与探针序列同源酶切片段在长度上差异。,二、主要分子标识,1、RFLP（Restriction Fragment Length po1ymorpams）,限制性片段长度多态性,1980，Bostein,第7页,碱基替换、插入、缺失或重复造成某种限制性内切酶（restriction enzymes）酶切位点增加或丧失以及内切酶酶切位点间DNA片段改变,基因组DNA序列上改变,（1）RFLP标识原理,第8页,（2）RFLP标识分析步骤,第9页,（3）RFLP标识特点,优点,数目几乎无限,共显性,能够利用现有探针，含有,种族特异性,RFLP标识,遍布全基因组,重复性好,第10页,缺点,成本较高;,需要,许多克隆探针,；,一个探针只能产生,一个多态位点,；,所需,DNA量大,(515g)；,易造成环境污染,第11页,随机排列寡聚脱氧核苷酸,单链引物（10个核苷酸）。,经过PCR扩增染色体组DNA所取得长度不一样多态性DNA片段。,2、RAPD（Random Amplification Polymorphism DNA）,随机扩增多态性DNA,1990,Williams,第12页,特异性取决于引物与模板DNA结合特异性。,PCR，,聚合酶链式反应,（polymerase chain reaction）,Mullis等(1985),PCR反应：变性、复性、延伸。,第13页,RAPD与经典PCR反应区分,引物,反应条件,扩增产物,第14页,（2）RAPD标识特点,优点,1）可检测未知序列基因组DNA,2）引物无种族特异性,3）RAPD技术简单,第15页,4）单个引物可产生几个多态位点,第16页,5）经过克隆测序可转化成SCAR,SCAR（Sequence Characterized Amplification Region）,特异序列扩增区域标识,第17页,缺点,1）再现性差,2）显性遗传,3）存在共迁移问题,第18页,3、AFLP（Amplified Fragment Length Polymorphisms）,扩增片段长度多态性,1993，Zabeau marc和Vos pieter,是对限制性酶切片段选择性扩增,第19页,（1）AFLP标识原理,基因组DNA进行双酶切,人工接头连接,PCR反应引物,凝胶电泳,第20页,AFLP,扩增数量由酶切频率较低限制酶在基因组中酶切位点数量决定。,限制性酶,酶切频率较高限制性酶（frequent cutter），,酶切频率较低限制性酶（rare cutter）,产生,易于扩增,基因组DNA,限制,扩增模板DNA片段数量,第21页,3）选择扩增,AFLP分析基本步骤,1）限制性核酸酶双酶切基因组DNA,2）DNA片段两端连接上特定接头,(oligonucleotide adapters),第22页,6）自显影,4）聚丙烯酰胺凝胶电泳,5）凝胶转移，干胶处理,荧光标识、,银染,第23页,（2）AFLP标识特点,优点,1）,数目和种类很多,2）一次PCR反应可,检测多个遗传位点,3）AFLP分析,模板用量少,4）,分辨率高,5）,假阳性低,，,可靠性高,6）AFLP标识多数为,显性,第24页,缺点,分析成本高,DNA纯度及内切酶质量要求也比较高,甲基化敏感酶易产生假假阳性,第25页,(Variable number tandem repeat),4、SSR（Simple Sequence Repeat）,1987，Nakamura,生物基因组内有一个短,重复次数不一样,关键序列,可变数目串联重复序列,简称VNTR,小卫星（minisatellites）,微卫星（microsatellites）,第26页,简单重复序列,，又称,微卫星DNA,一类由16个碱基组成基序（motif）串联重复而成DNA序列,如（CA）n、（AT）n、（CC）n、（GATA）n,n代表重复次数，其大小在1060之间,第27页,微卫星DNA,两端序列是相对保守单拷贝序列,（1）SSR标识原理,依据微卫星DNA两端单拷贝序列设计一对特异引物，利用PCR技术，扩增每个位点微卫星DNA序列，经过电泳分析关键序列长度多态性。,第28页,2）检测一个单一多等位基因位点。,（2）SSR标识特点,1）数量几乎无限，检测出多态性频率极高,3）多数为共显性标识,第29页,使用SSR技术前提是需要知道重复序列两翼DNA序列。,4）重复性高，稳定可靠,5）需DNA样品量少，对DNA质量要求亦不苛刻,第30页,引物设计采取24个核苷酸序列为,基序,（motifs），以其不一样重复次数再加上几个非重复,锚定碱基,Inter-simple sequence repeat polymorphic DNA,ISSR,标识,相邻SSR区域内引物去扩增中间单拷贝序列,第31页,共显性遗传,5、SCAR（Sequence Characterized Amplification Region）,特异序列扩增区域标识,普通步骤,RAPD分析,克隆片段两端测序,设计长为1824bp引物,PCR扩增检测,高重复性,优点,第32页,6,、,CAPS（,Cleaved Amplification Polymorphism Sequence-tagged Site,）,切割扩增多态序列标签位点技术,又称PCR-RFLP,基本步骤,特定引物PCR扩增,PCR扩增产物限制性内切酶酶切,酶切产物凝胶电泳检测,第33页,CAPs标识优点,引物与限制酶组合非常多,CAPS标识呈共显性,所需DNA量极少,结果稳定可靠,操作简便、快捷,第34页,指基因组中长度为200500bp，且核苷酸次序已知单拷贝序列，可采取PCR技术将其专一扩增出来。,7、STS（Sequence-tagged Sites）,序列标签位点,简称,序标位,YAC或cosmid插入末端序列,引物起源,RFLP单拷贝探针序列,微卫星序列,表示基因序列,第35页,很轻易在不一样组合遗传图谱间进行标识转移，且是沟通植物遗传图谱和物理图谱中介。,8、,表示序列标签,（Expressed sequence tags，ESTs）,表示基因部分序列,共显性遗传,突出优点,第36页,扩增基因开发阅读框（open reading frames,ORFs）。,引物17-18个碱基，包含13-14个碱基关键区域（510-11个碱基为填充区，随即正向为CCGG，反向为AATT），关键区域后为3个选择碱基。,9、SRAP（Sequence-related amplified polymorphism）,相关序列扩增多态性,第37页,第38页,SRAP特点,优点,1）每一反应可得大量多态位点,2）不需克隆任何序列，引物可用于不一样生物；,3）便利、简单；,4）重复性好；,5）PCR产物可直接测序。,第39页,基因组中每隔1000个碱基就存在一单碱基差异。,普通经过对PCR产物、基因组文库、表示序列标签（EST）文库测序而取得,10、SNP（simple nucleotide polymorphisms）,单核苷酸多态性,等位基因遗传密码单碱基差异。,特点：数量大,第40页,A Chromosome Map of Tomato,第三节 主要农艺性状基因连锁标识筛选,一、遗传图谱构建,第41页,1、作图群体建立,（1）亲本选配,亲本选择标准,亲本间DNA多态性丰富；,亲本纯度高；,杂交后代可育。,第42页,（2）群体类型,F,1,P,1,P,2,F,2,F2群体,第43页,BC1群体,第44页,RIL群体是杂交后代经过多代自交而产生一个作图群体，通常从F2代开始，采取单粒方法建立。常自交6-7代。,重组近交系群体,（recombinant inbred lines，RIL,）,第45页,DH群体,单倍体经过染色体加倍形成二倍体,第46页,一组遗传背景相同或相近，只在个别区段存在差异株系,近等基因系群体,（Near-isogeneic linesNIL）,第47页,拟测交（Pseudo-testcross）群体,复合杂交群体（CP群体）,第48页,（3）群体大小,构建分子标识骨架连锁图可用小群体150单株或家系。,第49页,连锁图谱构建理论是染色体交换和重组。,A,A,B,B,a,b,a,b,a,b,A,B,A,B,a,b,A,B,b,a,重组率可用来表示遗传图距，,重组型配子最大百分比为50%，改变0-50%。,图距单位用厘摩（centi-Mergan,cM）表示，,1cM大小大致符合1%重组率。,2、图谱构建理论基础,第50页,两位点存在连锁(r0.5)概率与不连锁概率(r=0.5)比,为确定两位点之间存在连锁，普通要求似然比大于1000，即LOD3；而否定连锁存在，则要求似然比小于100，即LOD2。,图谱制作统计学原理,两点测验,L,(r)/,L,(0.5),概率之比可用似然比统计量来表示,似然函数,L,(),多点测验,第51页,检测作图群体个体（株系）分子标识基因型,P,1,P,2,F,1,1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22,B H A A H H A H B A A H H H A B H A B A H H,1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12,3、标识基因型检测,第52页,4、图谱构建软件,利用DNA标识数据，经过作图软件构建连锁图谱。,MAPMKER/EXE3.0,Map manger QTX20,Joinmap,第53页,陆地棉（渝棉1号T586）F,2:7,群体,第54页,1、质量性状基因定位,二、基因定位,第55页,（1）近等基因系分析,第56页,（2）分离群体分组混合分析,第57页,1,1,1,170,1,2,135,1,3,1480,1,4,215,1,5,710,CMS育性恢复基因分子标识,第58页,控制数量性状基因,2、数量性状基因定位,数量性状基因座,（quantitative trait loci,QTL,）,第59页,检验同一标识不一样基因型间数量性状均值差异,（1）QTL定位方法,1）基于标识分析方法,均值差检测法,若差异显著，则表明标识与QTL连锁。,第60页,陆地棉（渝棉1号T586）F,2:7,群体QTL定位,第61页,2）基于性状分析方法,分离群体分群分析法,第62页,选择性基因型分析法,第63页,3、QTL定位软件,Mapmaker/QTL1.0,Map Manager QTX,QTL Cartographer,MapQTL,Windows Cartographer,第64页,4、QTL精细定位,1）单个QTL精细定位,连续用,渝棉1号,回交分子标识辅助选择,渝棉1号,T586,T586,渝棉1号,群体大于1000,第65页,可靠性取决于标识与目标基因连锁程度。,若只用一个标识对目标基因进行选择，则标识与目标基因间连锁必须非常紧密，才能够到达较高正确率。,第四节 分子标识辅助选择（MAS）育种,一、分子标识辅助选择遗传基础,1、前景选择,对目标基因选择称为前景选择(foreground selection),Hospital&Charcosset(1997)提出,第66页,供体,受体,RR Rr rr,(1-r),2,2r(1-r)r,2,M,R,m,r,M,R,m,r,目标基因与DNA标识间遗传距离位p,亲本中DNA标识带型,F,1,杂种中DNA标识带型,在F,2,分离群体中分子标识类型,即MM,Mm,mm,MM类型分子标识所代表目标基因型及其频率,利,用,MAS,遗,传,基,础,（以,RFLP,为,例）,M抗性标识 R抗性基因,m感病标识 r感病基因,第67页,选择正确率随重组率增加而快速下降。重组值越小，其错选率越低。,假如要求最少选到一株目标基因型概率为P，则必须选择含有标识基因型MM植株最少为：,n,log（1-P）/log（1-p）,式中,p（1r）,2,第68页,第69页,对基因组中其它部分（即遗传背景）选择，称为背景选择（,background selections,）。背景选择对象几乎包含了整个基因组，所以，这里牵涉到一个全基因组选择问题，在分离群体中，因为在上一代形成配子时同源染色体之间会发生交换，所以每条染色体都可能是由双亲染色体重新组装杂合体。,2、背景选择,第70页,第71页,二、分子标识辅助选择优越性,1.克服性状表现型判定困难,2.允许早期选择,3.控制单一性状多个（等位）基因利用,4.允许同时选择多个性状,5.可进行性状非破坏性评价和选择,6.从育种进程考虑，可加紧育种进程，提升育种效率,第72页,三.分子标识辅助选择应具备主要条件,A：,与目标基因紧密连锁分子标识,B:,简便快捷标识检测方法,第73页,How to use a genetic marker for marker-assisted selection,Weaver Carrier Sire,+,W,W,+,+,+,M1,M2,M1,M2,M3,M3,W=Weaver +=Normal,第74页,目标基因标识筛选（,gene tagging,）是进行分子标识辅助选择（,MAS,）育种基础。用于MAS育种分子标识须具备三个条件：,分子标识与目标基因紧密连锁,标识实用性强，重复性好，而且能够经济简便地检测大量个体。,不一样遗传背景选择有效。,第75页,作物MAS育种须具备条件,分子标识与目标基因共分离或紧密连锁，普通要求二者间遗传距离小于5cM,最好1cM或更小。,含有在大群体中利用分子标识进行筛选有效伎俩，主要是应用PCR技术。,筛选技术在不一样试验室间重复性好，且含有经济、易操作特点。,含有实用化程度高并能帮助育种家作出抉择计算机数据处理软件。,第76页,四、MAS育种方法,（一）回交育种,（二）SLS-MAS,（三）MAS聚合育种,第77页,受体亲本,供体亲本,(不含优质基因)(含优质基因),F,1,受体亲本,BC,1,目标基因定位,标识辅助选择,中选BC,1,受体亲本,(含优质基因),BC,2,BC,3,标识辅助选择,标识辅助选择,中选BC,3,(含优质基因),新育成优质品种,(受体亲本遗传本背景+优质基因),自,交,目标基因定位,与标识辅助回交,育种相结合程序图,中选BC,1,受体亲本,(含优质基因),第78页,受体亲本 供体亲本A,(无优质基因)(含优质基因A),受体亲本 供体亲本B,(无优质基因)(含优质基因B),F1(含优质基因A)F1(含优质基因B),复杂杂种(分离群体),受体亲本 供体亲本C,(无优质基因)(含优质基因C),中选杂种个体 F1,(含优质基因A和B)(含优质基因C),复杂杂种(分离群体),中选杂种个体 受体亲本,(含优质基因A、B和C),新育成优质品种,(受体亲本遗传背景+优质基因A、B和C),回交12代，标识辅助选择,自交,标识辅助选择,标识辅助选择,标,记,辅,助,基,因,聚,合,与,品,质,改,良,相,结,合,程,序,图,第79页,五、提升分子标识筛选效率,（一）多重PCR方法,（二）用相斥相分子标识进行育种选择,（三）克服连锁累赘,（四）降低MAS育种成本,第80页,MAS育种研究范围：,1.分子标识与资源评价（度量遗传多样性）,2.分子标识与亲本选配,3.MAS增强作物抗病性（转移新抗性基因，抗性基因累加或聚合）,4.MAS提升作物杂种产量,第81页,品质性状分子标识体系,HMWGS：2*、7、5、8、9、16、20,硬度：,Pina/Pinb,淀粉：,Wx-A1,、,Wx-B1,和,Wx-D1,多酚氧化酶：2个,黄色素：1个,第82页,抗病分子标识体系,条锈：,Yr5、Yr ZH84、Yr10、Yr24,白粉：,Pm12,、,Pm16,、,Pm31,第83页,HMW-GS、LMW-GSSDS-PAGE分析,第84页,-Gliadin,B3b,B3b,B,B3d,B3h,B3j,1BL/1RS,SDS-PAGE of 1BL/1RS translocation,1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20,第85页,PCR marker development for By8,Dominant PCR marker system specific to glutenin By8,527bp,M,By18,By8,By18,By16,By16,By8,By9,By9,By15,By8,By8*,By20,By8*,By20,By-null,第86页,M 1 2 3 4 5 6 7,1.CS 2.X(N4AT4B)3.X(N4AT4D)4.Beihuomai 5.Kanto107 6.Lu935031 7.Gamenya,Molecular identification of,Wx,-,B1,in Chinese wheat,第87页,PPO新标识品种检测,876 bp,685 bp,第88页,硬度 27 65 27 76 24 60 19 21 26,Friabilin蛋白电泳图谱，箭头示硬度相关谱带,第89页,第90页,