发菜论文：发菜 海藻糖 麦芽寡糖基海藻糖水解酶 胁迫.doc

发菜论文：发菜中麦芽寡糖基海藻糖水解酶基因的克隆及其在胁迫条件下的响应

【中文摘要】发菜是一种极端环境下生长的陆生蓝藻,对逆境具有极强的适应力,因此是抗逆性研究中一种典型的植物资源,对其抗逆性研究具有重要的意义。目前人们对发菜适应极端环境的研究已经受到人们的广泛关注,但是还没有突破性的进展。本研究以发菜这一具有很强抗逆性的丝状蓝藻作为研究材料,应用基因工程技术,从发菜中克隆得到合成海藻糖途径的一个重要酶:麦芽寡糖基海藻糖水解酶MTH,转入大肠杆菌中进行重组表达,并对蛋白进行了纯化和酶活测定。同时,通过干旱和盐胁迫发菜,检测其NfMTS和NfMTH酶的表达量及相同条件下海藻糖和蔗糖的含量情况。得到以下结果和结论:通过设计简并引物,从发菜(Nostoc flaglliforme)中克隆出MTH的基因TreZ,对该基因序列测序表明开读框全长1848 bp,编码的蛋白质有615个氨基酸。生物信息学分析得到该基因编码的氨基酸序列包含四个麦芽寡糖基海藻糖水解酶的高度保守区域。将该基因在大肠杆菌中进行表达,通过SDS-PAGE检测到在0.5 mM IPTG诱导条件下该基因在大肠杆菌中有很高的表达量,分子质量约为70 kD。所得的重组蛋白经过纯化后,用麦芽六糖作为底物进行酶活反应,能水解麦芽...
【英文摘要】Nostoc flaglliforme which distributed in west and northwest of China widely is one of valuable terrigenous cyanobacterias. Its’living envioroment is extremely atrocious.A genomic DNA fragment encoding a putative maltooligosyltrehalose trehalohydrolase (NfMTH) for trehalose biosynthesis was cloned by the degenerate primer-PCR from cyanobacterium Nostoc flagelliforme. The ORF of NfMTH is 1,848 bp in length and encodes 615 amino acid residues constituting a 70 kDa protein.The deduced amino acid sequenc...
【关键词】发菜 海藻糖 麦芽寡糖基海藻糖水解酶 胁迫
【英文关键词】Nostoc Flagelliforme Trehalose Maltooligosyltrehalose trehalohydrolase Stress
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【目录】发菜中麦芽寡糖基海藻糖水解酶基因的克隆及其在胁迫条件下的响应

摘要

6-8

Abstract

8

1. 综述

11-26

1.1 发菜的概述

11-16

1.2 海藻糖概述

16-24

1.3 发菜中海藻糖的研究

24-25

1.4 本论文的研究目的和意义

25-26

2. 材料与方法

26-42

2.1 材料

26-28

2.2 方法

28-42

2.3 技术路线

42

3. 结果与分析

42-62

3.1 发菜总DNA 的提取

42-43

3.2 TreZ 目的基因的克隆

43-45

3.3 生物信息学分析

45-51

3.4 pET22b-TreZ 基因载体的构建

51-52

3.5 pET22b-TreZ 在大肠杆菌中的表达和纯化

52-53

3.6 pET22b-TreZ 基因产物的酶活性测定

53-54

3.7 TreZ-main 基因的克隆、表达及纯化

54-58

3.8 胁迫条件下发菜中NfMTH 表达量及海藻糖、蔗糖的测定

58-62

4. 讨论

62-65

5. 总结

65-66

6. 展望

66-67

7. 参考文献

67-72

8. 致谢

72-73

9. 攻读学位期间的研究成果

73