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酵母蔗糖酶的提取及性质测定

引论及原理
酶的分离制备在酶学以及生物大分子的结构功能研究中有重要意义。本实验属综合性实验，接近研究性实验，包括八个连续的实验内容，通过对蔗糖酶的提纯和性质测定，了解酶的基本研究过程；同时掌握各种生化技术的实验原理、基本操作方法。本实验技术多样化，并且多个知识点互相联系，实验内容逐步加深，构成了一个综合性整体，为学生提供一个较全面的实践机会，学习如何提取纯化、分析鉴定一种酶，并对这种酶的性质，尤其是动力学性质作初步的研究。
蔗糖酶（invertase）（b—D—呋喃果糖苷果糖水解酶）（fructofuranoside fructohydrolase）（EC.3.2.1.26）特异地催化非还原糖中的a—呋喃果糖苷键水解，具有相对专一性。不仅能催化蔗糖水解生成葡萄糖和果糖，也能催化棉子糖水解，生成密二糖和果糖。每水解1mol蔗糖，就生成2mol还原糖。还原糖的测定有多种方法，本实验采用Nelson比色法测定还原糖量，由此可得知蔗糖水解的速度。
＋　H2O
蔗糖酶
O H
H O

在研究酶的性质、作用、反应动力学等问题时都需要使用高度纯化的酶制剂以避免干扰。酶的提纯工作往往要求多种分离方法交替应用，才能得到较为满足的效果。常用的提纯方法有盐析、有机溶剂沉淀、选择性变性、离子交换层析、凝胶过滤、亲和层析等。酶蛋白在分离提纯过程中易变性失活，为能获得尽可能高的产率和纯度，在提纯操作中要始终注意保持酶的活性如在低温下操作等，这样才能收到较好的分离效果。啤酒酵母中，蔗糖酶含量丰富。本实验用新鲜啤酒酵母为原料，通过破碎细胞，热处理，乙醇沉淀，柱层析等步骤提取蔗糖酶，并对其性质进行测定。

一、蔗糖酶的提取与部分纯化
（一）实验目的
学习酶的提取和纯化方法，掌握各步骤的实验原理，并为后续实验提供一定量的蔗糖酶。
（二）实验原理（略）
（三）实验仪器、材料及试剂
　　仪器
1. 高速冷冻离心机、恒温水浴箱、－20℃冰箱
2. 电子天平、研钵（＞200ml）、制冰机、50ml烧杯
3. 离心管（2ml，10ml，30ml或50ml）、移液器（1000ul）或滴管、量筒
　材料及试剂
1. 市售鲜啤酒酵母（低温保存）
2. 石英砂（海沙）、甲苯（使用前预冷到0℃以下）
3. 95%乙醇（预冷－20℃）、去离子水（使用前冷至4℃左右）
4. Tris-HCl（pH7.3）缓冲液
（四）操作步骤
1. 提取
（1）将市售鲜啤酒酵母2000 rpm，离心10 min，除去大量水分。
（2）将研钵稳妥放入冰浴中。
（3）称取50g鲜啤酒酵母，加30g石英砂放入研钵中，加50ml预冷的甲苯（边研边加）或预冷的去离子水，在研钵内研磨成糊状，然后每次缓慢加入预冷的10ml去离子水，边加边研磨以便将蔗糖酶充分转入水相。共加75ml去离子水，研磨约40~60分钟，使其成糊状液体。（注：研磨时可用显微镜检查研磨的效果，至酵母细胞大部分研碎）。
（4）将混合物转入50ml（或分装入2个30ml）离心管中，平衡后，用高速冷冻离心机离心，
4℃，15000rpm，15min。观察结果：如果中间白色的脂肪层厚，说明研磨效果良好。
　（4）用移液器（或滴管）吸出上层有机相（弃掉）。
（5）用移液器小心地取出脂肪层下面的水相液转入量筒，量出体积，并记录。
（6）取出2ml放入2ml离心管中（标记为粗级分I，－20℃下保存），用于测定酶活力及蛋白含量。剩余部分转入清洁的小烧杯中。
2. 热处理
（1）将盛有粗级分I的小烧杯迅速地放入50℃恒温水浴中，保持30分钟，并用玻璃棒温和搅动。
（2）取出小烧杯，迅速用冰浴冷却，转入清洁的离心管中（根据量大小选择离心管），4℃，15000rpm，离心15min。
（3）将上清液转入量筒，量出体积，并记录。
（4）取出2ml放入2ml离心管中（标记为热级分II，－20℃下保存），用于测定酶活力及蛋白含量。剩余部分转入清洁的小烧杯中。
3. 乙醇沉淀
（1）将盛有热处理后的上清液放入小烧杯，在冰浴下逐滴加入预冷的等体积（逐滴加入）95%乙醇，温和搅拌、放置，需1小时。
（2）转入清洁的离心管中，用4℃，15000rpm，离心15min，倾去上清，并滴干。
（3）离心管中沉淀用5~8mlTris-HCl（pH7.3）缓冲液充分溶解（若溶液混浊，则用离心管，4000rpm离心除去不溶物），转入量筒，量出体积，并记录。
（4）取出2ml放入2ml离心管中（标记为醇级分Ⅲ，－20℃下保存），用于测定酶活力及蛋白含量。剩余部分转入清洁的小烧杯中，用于下一步实验。（注：离心管中沉淀也可盖上盖子或薄膜封口，然后将其放入冰箱中冷冻保存，用时再处理）
（五）实验结果与分析
记录实验结果，并加以解释，若有异常现象出现，可进行分析讨论。
（六）注意事项

二、DEAE-纤维素层析纯化蔗糖酶
（一）实验目的
学会离子交换柱层析法纯化蛋白的方法，掌握各步骤的实验原理，并为后续实验提供一定量的蔗糖酶。
（二）实验原理（略）
（三）实验仪器、材料及试剂
　仪器
1. 核酸蛋白检测仪、自动部分收集器、蠕动泵、层析柱、梯度混合器
2. 滴管、真空泵或抽滤瓶、烧杯等。
材料及试剂
1. 0.05mol/L Tris-HCl缓冲液（pH7.3）
2. 0.5mol/L NaOH
3.0.5mol/L HCl
4.含100mmol/L NaCl 的0.05mol/L Tris-HCl（pH7.3）液
5. DEAE-纤维素
6. 2%蔗糖溶液
7．Benedict试剂：称取柠檬酸钠173g及碳酸钠（Na2CO3•H20）100g加入600mL蒸馏水中，加热使其溶解，冷却，稀释850mL。另称取17.3g硫酸铜溶解于100mL热蒸馏水中，冷却，稀释至150mL。最后，将硫酸铜溶液徐徐地加入柠檬酸－碳酸钠溶液中，边加边搅拌，混匀，如有沉淀，过滤后贮于试剂瓶中可长期使用。
（四）操作步骤
1. 离子交换剂的处理
（1）称取6克DEAE纤维素（DE-23）干粉，加水浸24小时抽干（真空泵或抽滤瓶）后放入小烧杯中；
（2）加入0.5mol/L NaOH溶液（约50ml），轻轻搅拌，浸泡0.5小时后抽干，用去离子水洗至近中性，抽干后放入小烧杯中；
（3）加50ml 0.5 mol/L HCl, 搅匀，浸泡0.5小时后抽干，用去离子水洗至近中性，放入小烧杯中；
（4）用0.5 mol/L NaOH重复处理一次，用去离子水洗至近中性后，抽干备用。
本实验可直接用0.5mol/L NaOH浸泡1小时，抽干水洗至中性。
因DEAE纤维素昂贵，用后务必回收。按“碱→酸”的顺序洗即可，因为酸洗后较容易用水洗至中性。碱洗时因过滤困难，可以先浮选除去细颗粒，抽干后用0.5 mol/L NaOH溶液处理，然后水洗至中性备用。
2．装柱与平衡
（1）先将层析柱垂直装好，用滴管吸取烧杯底部大颗粒的纤维素装柱（装量为柱长2/3或离柱顶端3~ 4cm，柱内纤维素要均匀，不要出气泡）；
（2）用0.05 mol/L pH 7.3 Tris-HCl 起始缓冲液平衡（约100ml流出液即可），以流出液pH与缓冲液一致为准。
3.　上样与洗脱
（1）将剩余小烧杯中的醇级分Ⅲ用滴管取1.5ml小心地沿柱壁加到层析柱中，不要扰动柱床。（注意上样量：分析用量一般为床体积的1%~2%，制备用量一般为床体积的20%~30%）
（2）用滴管小心地沿柱壁加入起始缓冲液约5ml；
（3）用0.05mol /L Tris-HCl，pH7.3的缓冲液进行NaCl（0~100mmol/L）线性梯度洗脱。
层析柱联上梯度混合器，混合器中分别为50ml 0.05ml/L Tris-HCl，pH7.3的缓冲液和50ml 0.05mol/L Tris-HCl，pH7.3的缓冲液，其中含100mmol/L NaCl。
　洗脱流速为0.5 ml /分~1ml/分，使用部分收集器连续收集洗脱液，每管接收4ml。记录每管A280。至混合器中液体流完为止。
　（4）每隔4管（或取A280值高的几个峰值）做酶活力的定性测定，确定活性最高的几管合并（约20ml即可），转入量，量出体积，并记录。
（5）取出2ml放入2ml离心管中（标记为柱级分IV，－20℃下保存），用于测定酶活力及蛋白含量。剩余部分用于下一步实验。（标记为柱级分IV）。
蔗糖酶活力的定性测定方法：取1干净试管加入2%蔗糖溶液1.5ml，蔗糖酶溶液0.5 ml, 37℃恒温水浴保温15分钟后，加入Benedict试剂1ml，沸水浴2~3分钟。观察桔红色沉淀多少。
（五）实验结果与分析
记录实验结果，并加以解释，若有异常现象出现，可进行分析讨论。
（六）注意事项

三、蔗糖酶活性及蛋白质浓度的测定
（一）实验目的
学会用考马斯亮蓝结合法测定蛋白质浓度，用Nelson方法测定酶活力。掌握各步骤的实验原理和方法。
（二）实验原理
本实验以Nelson方法测定酶活力，其原理是还原糖含有的自由醛基或酮基，在碱性溶液中将Cu2+还原成氧化亚铜，糖本身被氧化成羟酸，砷钼酸试剂与氧化亚铜生成蓝色溶液，在510nm下有正比于还原糖的吸收，从而可确定酶的活力，测定范围：25~200µg。
本实验用考马斯亮蓝结合法测定蛋白浓度，考马斯亮蓝能与蛋白质的疏水微区相结合，这种结合具有高敏感性。考马斯亮蓝G250的磷酸溶液呈棕红色，最大吸收峰在465nm。当它与蛋白质结合形成复合物时呈蓝色，其最大吸收峰改变为595nm，考马斯亮蓝G250－蛋白质复合物的高消光效应导致了蛋白质定量测定的高敏感度。在一定范围内，考马斯亮蓝G250－蛋白复合物呈色后，在595nm下，吸光度与蛋白质含量呈线性关系，故可以用于蛋白质浓度的测定。
（三）实验仪器、材料及试剂
仪器
　1. 722型（或7220型）分光光度计、电子分析天平、恒温水浴箱
　2. 量筒、容量瓶、移液器、试管。
材料及试剂
1. 考马斯亮蓝(G250)染液（0.01%）：称取0.1g考马斯亮蓝G250溶于50ml 95%乙醇中，再加入100ml浓磷酸（市售质量百分渡为85%），然后加蒸馏水定容至1000ml。
2. 0.9% NaCl溶液
3. 牛血清标准蛋白液（0.1mg/ml）：准确称取牛血清蛋白0.1g，用0.9% NaCl溶液溶解并稀释至1000ml。
4. 4mmol/L葡萄糖、4mmol/L蔗糖、0.5mmol/L蔗糖。
5. 0.2mol/L乙酸缓冲溶液(pH4.5)：
（1）0.2mol/L NaAC：称取27.616g NaAC溶解并定容至1000ml。
（2）0.2mol/L HAC：100ml乙酸(分析纯)定容至500ml。
（3）将两者分别取315ml、185ml混合，用强碱调pH到4.5。
6. Nelson试剂：
A试剂：100ml溶剂中含 Na2CO3 2.5g， NaHCO3 2.0g ， 酒石酸钾钠（酒石酸钠）2.5g， Na2SO4 20g。
B试剂：100ml溶剂中含 CuSO4•5H2O 15g，浓H2SO4 2滴。
以A：B=50：2比例混合即可使用，使用前需在37℃以上溶解，防止溶质析出。
7. 砷钼酸试剂：100ml中含钼酸铵 5g ，浓H2SO4 4.2ml，砷酸钠 0.6g。（砷酸钠有毒，实验中注意）
（四）操作步骤
1．各级分蛋白质浓度测定
（1）蛋白质浓度测定――标准曲线的制备
取7支干净试管，按表1编号并加入试剂混匀。以吸光度平均值为纵坐标，各管蛋白含量作为横坐标作图得标准曲线。（或将数据代入线性回归方程，求出Y？和r？）

表1　考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度――标准曲线的绘制
编　号
0
1
2
3
4
5
6
标准蛋白液/ml
—
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.9%NaCl/ml
1.0
0.9
0.8
0.7
0.6
0.5
0.4
考马斯亮蓝/ml
4
4
4
4
4
4
4
蛋白含量/μg
0
10
20
30
40
50
60

室温静置5min
A595nm　

（2）各级分蛋白浓度的测定
取9支干净试管，每级分做两管，按表2编号并加入试剂混匀。读取吸光度值。以各级分的吸光度的平均值查标准曲线即可求出蛋白质含量。各级分应进行一定倍数的稀释，先试做，选其吸光度值在标准曲线内，即蛋白含量应在10~80μg 的稀释度为宜。
表2 各级分蛋白浓度的测定
编　号

1
2
3
4
粗级分I/ ml

热级分II/ ml

醇级分III/ ml

柱级分IV/ ml

0.9%NaCl/ml

考马斯亮蓝/ml
4
4
4
4
4
4
4
4
蛋白含量/μg
各级分应进行一定倍数的稀释，先试做，选其吸光度值在标准曲线内，即蛋白含量应在10~80μg 的稀释度为宜

室温静置5min
　A595nm　

A595nm 平均值

各级分蛋白浓度mg/ml

2．各级分蔗糖酶活性的测定
（1）蔗糖酶活性的测定――标准曲线的制作
　　取9支试管，按表3加样。以吸光度值（O.D）为纵坐标，以还原糖（葡萄糖含量，μmol）作为横坐标作图得标准曲线。（或将数据代入线性回归方程，求出Y？和r？）
（2）各级分蔗糖酶活性测定
取9支干净试管，分两组，按表4编号并加入试剂混匀。各级分酶液应进行一定倍数的稀释，先试做，选其吸光度值在标准曲线内，即还原糖含量应在0.08~1.2μmol的稀释度为宜。读取吸光度值。以各级分的吸光度的平均值查标准曲线即可求出蛋白质含量。

编号
0
1
2
3
4
5
6
7
8
4mmol/L葡萄糖/ml
－
0.02
0.05
0.10
0.15
0.20
0.25
0.30
—
4mmol/L蔗糖/ml
－
－
－
－
－
－
－
－
0.2
蒸馏水/ml
1
0.98
0.95
0.90
0.85
0.80
0.75
0.70
0.80
葡萄糖量/μmol
0
0.08
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2

Nelson试剂
向每管中加入1ml Nelson试剂，盖上塞子，置于沸水浴中20分钟，再冷至室温
（在碱性条件下糖被氧化，将Cu2+还原成氧化亚铜（Cu20）
砷钼酸试剂
向每个管中加入1ml砷钼酸试剂，5分钟　
（砷钼酸试剂与氧化亚铜生成蓝色溶液）
蒸馏水/ml
向每个管中加入7ml蒸馏水，充分混匀
A510nm

表3　 Nelson法测定蔗糖酶活性――标准曲线的绘制

表4 各级分蔗糖酶活性测定
样品
空白
粗级分I
热级分II
醇级分III
柱级分IV
编号
0
1
2
1
2
1
2
1
2
乙酸缓冲液/ml
0.2
0.2
0.2
0.2
0.2
0.2
0.2
0.2
0.2
蒸馏水/ml
0.6

0.5mol/L蔗糖/ml
0.2
0.2
0.2
0.2
0.2
0.2
0.2
0.2
0.2
各级分酶液/ml
—
？
？
？
？
？
？
？
？
室温时间/min
10分钟
Nelson试剂
向每管中加入1ml Nelson试剂，盖上塞子，置于沸水浴中20分钟后冷至室温
砷钼酸试剂
向每个管中加入1ml砷钼酸试剂，5分钟
蒸馏水/ml
向每个管中加入7ml蒸馏水，充分混匀
1　A510nm
0

2　A510n
0

A510nm平均值
0

（3）活力和比活力的计算
活力单位（U）：酶在室温，pH=4.5条件下，每分钟水解产生1μmol葡萄糖所需酶量。
根据测得结果，计算出各步数据填入下表
各级分样液
体积/ml
蛋白mg/ml
总蛋白mg
活力U
总活力U
比活力U/mg
提纯倍数
回收率
粗级分I

热级分II

醇级分III

柱级分IV

（五）实验结果与分析
记录实验结果，并加以解释，若有异常现象出现，可进行分析讨论。
（六）注意事项

四、蔗糖酶纯度测定
（一）实验目的
学会操作步骤，掌握实验原理，能够分析实验结果。
（二）实验原理
（三）实验仪器、材料及试剂
仪器
1．电泳仪、电泳槽
2．微量取样器、染脱色装置
材料及试剂
1．凝胶贮备液：丙烯酰胺（Acr）29.2g亚甲基双丙烯酰胺（Bis）0.8g　加蒸馏水至100 ml，外包锡纸，4℃冰箱保存30天内使用
2. 凝胶缓冲液（1.5mol/LTris-HCl，pH8.8）：18.15gTris（三羟甲基氨基甲烷），加约80ml蒸馏水，用1mol/L HCl调pH到8.8，用蒸馏水稀释至最终体积为100ml，4℃冰箱保存．
3．电极缓冲液（5*TBE）：使用1*TBE。
4．质量浓度为10％过硫酸铵：此溶液需临用前配制
5．溴酚蓝溶液：5ml 50%甘油+5ml电极液+数滴溴酚蓝
6．染色液：0.25g考马斯亮蓝R250，加入91ml 50％加甲醇，9 ml冰醋酸。
7．脱色液：50 ml甲醇，75ml冰醋酸与875 ml蒸馏水混合。
（四）操作步骤
1．8%凝胶的配制、灌胶、上样
（1）8%PAGE凝胶
溶液成分
总体积 10ml
蒸馏水/ml
30%丙烯酰胺/ml
凝胶缓冲液/ ml
TEMED/ ul
10%Ap /ul
4.8
2.66
2.5
5
50

（2）用滴管吸取凝胶，在电泳槽的两玻璃板之间灌注后插入梳子，待凝胶聚合后，将梳子取出 。
（3）将各步留液（I、II、III、IV）稀释成1~2mg/ ml蛋白，上样量20μl（蛋白稀释液与溴酚蓝溶液1：1混合上样）。每级分酶液样占一个泳道。（注：若酶液蛋白浓度低，可增加上样量）
3．电泳
接上电泳仪，上样端接电源的负极，打开电泳仪电源开关，调电压80V，30分钟后加大到120 V，待蓝色的溴酚蓝条带迁移至距凝胶下端约1cm时，停止电泳。
4．剥胶、染色与脱色：
小心将胶取出，置于染脱色装置中，染色30min，脱色30min后更换一次脱色液，直至背景清晰。
（五）实验结果与分析
绘出凝胶电泳图谱，分析各步纯化后酶的纯度情况。
（六）注意事项

五、蔗糖酶Km值测定及脲素的抑制作用
（一） 实验目的
　　了解米氏常数的意义，学会测定蔗糖酶米氏常数的方法；了解底物浓度和抑制剂对反应速度的影响，掌握确定抑制类型的方法。
（二） 实验原理
酶促动力学研究酶促反应的速度及影响速度的各种因素，而米氏常数Km值等于酶促反应速度为最大速度的一半时所对应的底物浓度，其数值大小与酶的浓度无关，是酶促反应的特性常数。不同酶的Km值不同，同一种酶在与不同的底物反应时，其Km值也不同。Km反映了酶和底物亲和能力的强弱程度。大多数纯酶的Km值0.01~100mmol/L之间。
酶的活力可以被某些物质激活或抑制，凡能降低酶的活性甚至使酶失活的物质，称为酶的抑制剂，酶的活力抑制有可逆抑制和不可逆抑制两种。而可逆的抑制又包括有竞争性抑制，非竞争性抑制等类型，在有抑制剂存在条件下，酶的一些动力学性质发生改变，如Km，纵轴交点为1/Vmax，横轴交点为-1/Km。

1/[S]
1/V
-1/Km
1/Vmax
1．无抑制剂
2．竞争性抑制
3．非竞争性抑制

ν＝
Vmax[S]
Km+[S]
本实验以米氏公式

利用双倒数法作图，（1/V对1/[S]）,实验推导得出Km，并推导出抑制类型，Vmax等，通过实验的方法，可以确定出抑制类型。

（三） 实验仪器、材料及试剂
仪器
　1. 722型（或7220型）分光光度计、电子分析天平、恒温水浴箱
　2. 量筒、容量瓶、移液器、试管。
材料及试剂
　1．0.2mol/L乙酸缓冲液
2．0.5mol/L蔗糖溶液
　3．8mol/L脲
4．Nelson试剂：(每组30ml)
5．砷钼酸试剂：(每组30ml)

（四）操作步骤
1. Km值的测定
（1）时间作用曲线
取11支试管，按表5加样操作。以时间为横坐标，以产物量为纵坐标，制作时间作用曲线。
酶液的稀释倍数以测定酶活力时得出的稀释倍数为准。

表5 时间作用曲线的制做
编号
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
0.2mol/L乙酸缓冲液
向各管中加0.2ml
0.5mol/L蔗糖/ml
向各管中加0.1ml
蒸馏水/ml
向各管中加0.6ml
酶液(稀释的IV)
0管不加作空白，其余各管中加0.1ml
保温时间（分钟）
0
1
2
3
4
8
10
12
15
20
25
Nelsol试剂
向各管加入Nelsol试剂1ml，置沸水浴中20分钟，再冷至室温
砷钼酸试剂
向各管中加1 ml砷钼酸试剂，5分钟
蒸馏水
向各管中加7ml水，充分混匀
A510nm
0

（2）底物浓度的影响
　取9支试管编号，按表6加样操作。以1/[s]对1/v作图，求Km值。

表6　酵母蔗糖酶Km值的测定
编号
0
1
2
3
4
5
6
7
8
0.2mol/L乙酸缓冲液
向各管中加0.2ml
0．5mol/L蔗糖/ml
0.2
-
0.02
0.04
0.06
0.08
0.1
0.2
0.4
蒸馏水/ml
0.4
0.6
0.58
0.56
0.54
0.52
0.5
0.4
0.2
酶液(稀释的IV)
0管不加作空白，其余各管中加0.2ml
保温时间（分钟）
室温放置10分钟
Nelsol试剂
向各管加入Nelsol试剂1ml，置沸水浴中20分钟，再冷至室温
砷钼酸试剂
向各管中加1 ml砷钼酸试剂，5分钟
蒸馏水
向各管中加7ml水，充分混匀
A510nm
0

2．脲的抑制
取9支试管，按表7加样操作（做两组，求平均）。以1/[s]对1/v作图，与底物影响之双倒数图对照比较，推出抑制类型。

表7　脲对蔗糖酶的抑制类型测定
编号
0
1
2
3
4
5
6
7
8
0.2mol/L乙酸缓冲液
向各管中加0.2ml
0．5mol/L蔗糖/ml
0.2
-
0.02
0.04
0.06
0.08
0.1
0.2
0.4
8mol/L脲/ml
0.2
向各管中加0.15ml
蒸馏水/ml
0.4
0.45
0.43
0.41
0.39
0.37
0.35
0.25
0.05
酶液(稀释的IV)
0管不加作空白，其余各管中加0.2ml
保温时间（分钟）
室温放置10分钟
Nelsol试剂
向各管加入Nelsol试剂1ml，置沸水浴中20分钟，再冷至室温
砷钼酸试剂
向各管中加1 ml砷钼酸试剂，5分钟
蒸馏水
向各管中加7ml水，充分混匀
　A510nm
0

（五）实验结果与分析
确定酵母蔗糖酶Km值；确定脲的抑制类型。
（六）注意事项

六、pH对酶活性的影响和最适pH的测定
（一）实验目的
掌握实验原理，学会测定酶最适pH值的方法，确定出在此实验条件下的酵母蔗糖酶的最适pH。
（二）实验原理（略）
（三）实验仪器、材料及试剂
仪器
　同酶活力和测定
材料及试剂
1．乙酸缓冲液：配制成pH为3.5； 4.0；4.5； 5.0； 5.5； 6.0
2．0.5mol/L蔗糖溶液、Nelson试剂、砷钼酸试剂
（四）操作步骤
1．取6支试管，按表8加样操作。（每个pH均作一个空白，不加酶液）
2．以pH对v作图，画出pH曲线，找出最适pH。
（五）实验结果与分析
确定在此条件下的最适pH
（六）注意事项

表8　 蔗糖酶最适pH的测定
编号
1
2
3
4
5
6
pH
3.5
4
4.5
5
5.5
6
0.2mol/L乙酸缓冲液
0.2
0.2
0.2
0.2
0.2
0.2
蒸馏水
向各管中加0.4ml
0.5mol/l蔗糖
向各管中加0.2 ml
酶液
向各管中加0.2 ml
室温时间/min
反应10分钟
Nelson试剂
向各管中加1 ml Nelson试剂后，置沸水浴20分钟，再冷至室温
砷钼酸试剂
向各管中加1 ml砷钼酸试剂，5分钟
蒸馏水
向各管中加7ml水，充分混匀
A510nm

七、温度对酶活性的影响和最适温度的测定
（一）实验目的
掌握实验原理，学会测定酶最适温度的方法，确定出在此实验条件下的酵母蔗糖酶的最适温度。
（二）实验原理（略）
（三）实验仪器、材料及试剂
　　恒温水浴器，其它仪器、试剂均同于酶活力的测定
（四）操作步骤
1．取6支试管，按表7加样操作。在0℃—70℃之间选择不同温度测定酶活力，以找出酵母蔗糖酶在此条件下的最适温度。（每个温度均作一个空白，不加酶液）

表7　 蔗糖酶最适温度的测定　　　　　
编号
1
2
3
4
5
6
温度
35
45
50
55
60
70
乙酸缓冲液/ml
向各管加0.2 ml
H2O/ml
向各管加0.4 ml
酶液/ml
向各管加0.2 ml
预保温时间/s
30秒
0.5mol/L蔗糖/ml
向各管加0.2 ml
反应时间/min
反应10分钟
Nelson试剂
向各管中加1 ml Nelson试剂后，置沸水浴20分钟，再冷至室温
砷钼酸试剂
向各管中加1 ml砷钼酸试剂，5分钟
蒸馏水
向各管中加7ml水，充分混匀
A510nm

2．以温度对v作图，画出温度曲线，找出最适温度。
（五）实验结果与分析
确定在此条件下的最适温度。
（六）注意事项

八、SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳测蔗糖酶相对分子质量（略，参看生化实验）