体外细胞培养.doc

第一讲 体外细胞培养的基本技术
l 体外细胞培养条件和基本技术
l 体外细胞培养
l 体外培养物的生长生物学
l 细胞系和细胞株
l 培养物的冷冻与复苏
l 培养物的污染、检测和排除　

l 一、体外细胞培养条件和基本技术
体外细胞培养的优缺点
优点： 简化细胞的生长环境，方便施加实验因素，便于观测实验结果， 便于获得均一细胞群，能够进行大规模生物制品的生产。
体外细胞培养不足之处：培养对象脱离了机体的整体支配和调控，细胞间在一定程度上失去组织联系及相互作用。体外培养条件下的生长发育情况与在体时的情况存在一定差异，分析实验结果时必须考虑这种差异。

一、体外细胞培养条件
（一）、体外培养实验室
1. 准备室
2. 培养室：基本条件要求：清洁、无菌、干燥、不通风，并具有适宜的光线。空气调节用中央空调或分体式空调机。室顶安装紫外灯等消毒装置。
3. 缓冲室 4. 其他实验室
（二）、体外培养的设备和器具
设备：1. 超静工作台，生物安全柜，净化室 2. 培养箱：温度，湿度，pH值
3. 倒置显微镜 4. 水净化装置：去离子水净化装置，石英玻璃蒸馏器，超纯水装置 5. 冰箱 6. 离心机 7. 冷冻保存装置
8. 高压蒸汽消毒装置：电热干燥箱，pH计，天平
培养器具：1. 过滤除菌装置：Zeiss 滤器，抽滤式玻璃简易型滤器，
针头式加压塑料小滤器
2. 培养器皿：（1） 溶液瓶（2） 培养瓶（3） 培养皿
（4） 多孔培养板（5） 离心管
3. 移液器
4.筛网：金属筛网（不锈钢网、铜网），尼龙筛网
（三）培养用液
• 水和平衡盐溶液（balanced salt solution, BSS)
水：离子交换水，蒸馏水
平衡盐溶液：主要成分： 无机盐和葡萄糖
常用BSS: PBS ，Ringer Earle ，D-Hanks， Hanks
• 培养液：1.天然培养液：1）血清： 小牛血清,胎牛血清（fetal bovine serum, FBS） ,马血清，2）水解乳蛋白，3）胚胎渗出液
2.合成培养液：合成培养基的种类 MEM，RPMI 1640，McCoy 5A，HAM F12等
3.无血清培养基：
干粉型培养基的配制：1）. 制备高质量的去离子水(玻璃三蒸馏水)或超纯水
2）. 加温水至15-30℃之间3）. 加干粉入水中，搅拌令之溶解4）. 加NaHCO3
5）. 加水至最终量 6）. 必要时用1N HCl或1N NaOH调节pH，因滤过时pH可能受影响7）. 用0.22um或小于此微孔滤膜滤过消毒
• 其他用液：消化液等
1.消化液： 胰蛋白酶、EDTA溶液 2.pH 调整液： NaHCO3溶液、HEPES溶液
3.抗生素液 ： 青链霉素

常用的生长培养液：基本培养基 80-90％
血清(多用小牛血清) 10-20 ％
抗生素(多用青霉素100单位／毫升和链霉素100微克／毫升

一、细胞体外培养的其它条件
一）、无污染的气、液相环境：1、O2 （ 5%CO2 + 95% 空气， O2: 21%）
2、CO2- pH 3、液相环境-渗透压
二）、温度
三）、生长基质 1、多聚赖氨酸： 0.05mg/ml 2、纤维连接蛋白：1mg/ml 3、胶原：1~3mg/ml 4、层粘连蛋白： 5~10mg/ml

一、清洗和消毒
1.1玻璃器皿的清洗：浸泡→刷洗→酸浸→冲洗
浸酸液：强液： 63克重铬酸钾， 1000毫升浓硫酸，200毫升蒸馏水。
次强液： 120克重铬酸钾，200毫升浓硫酸，1000毫升蒸馏水。
弱液： 100克重铬酸钾，100毫升浓硫酸， 1000毫升蒸馏水。
胶塞清洗： 胶塞入水中浸泡→2％Na0H煮沸10-20分钟→自来水冲洗→ 1％稀盐酸浸泡30分钟→自来水冲洗和蒸馏水漂洗2-3次，晾干备用
1.2塑料器皿的清洗：
2.包装：局部包装；全包装
3.消毒：紫外线，干热消毒，湿热消毒，滤过消毒，射线消毒，消毒剂的使用

l 二、体外细胞培养
体外细胞培养类型：原代培养，继代培养
一）、基本流程： １mm3的植块→植块培养
原代培养： ↗
动物器官或大组织块→洗去血污→剔除多余成分
↙
　 　　 组织剪碎→蛋白酶消化→ 机械吹打→铜网过滤→
离心→细胞悬液→调整细胞数→ 分离细胞培养
二）、实验要点：
1、 常用实验材料的取材： 胚胎、组织、人体手术或活检材料
2、分散细胞的方法：
１）. 机械解离细胞法：吸管吹打法,过筛法,单细胞分离器
２). 蛋白酶学处理法: 胰蛋白酶, 胶原酶
３). 螯合剂解离细胞法: EDTA , 柠檬酸钠　
3、接种和培养过程:：
１）. 植块培养： 接种与培养：
　　优点：比较简单，保留了在体时细胞间的相互作用，因而在体外培养时，植块内细胞容易存活和生长。
２）.分散细胞培养： 操作过程:
优点：解除了植块内部细胞间的组织关系，从而可以反映出单个细胞的生物学特征。可实现对单一细胞类型进行细胞生物学研究。
4、讨论和注意事项
n 相对于植块内的细胞，分离散细胞在体外更难以存活和生长。
n 对于大多数贴壁依赖型细胞来说，如何尽快让接种的细胞贴壁，是决定培养物生长快慢的关键步骤。可选用生长基质表面；降低浮力。
n 细胞密度：105个/ml左右，对大多数动物细胞是比较适中的。

三）、原代细胞培养的注意事项
1、培养液： 培养基的选择，添加剂，培养液的酸碱度，换液。
2、培养的空间： 通常培养液与液面上空间的体积比以1:10为宜。

一、 原代培养物需要传代的指标:
继代培养
1、 植块培养;2、分离细胞培养物;3、悬浮细胞培养物
二、传代的过程
1、主要材料：
（1）蛋白酶消化液；（2）培养器皿；（3）培养液及平衡盐溶液
2、方法：
（1）贴壁生长细胞培养物的传代：
吸去旧培养液→PBS 或D-Hanks洗→ 酶消化解离细胞→终止消化→吹打培养器皿底部→收集细胞、洗涤、调整细胞数→接种
（2）悬浮培养物的传代：
培养物移入离心管→离心、去上清→培养液重悬→接种培养皿→补加培养液
三、 传代培养的注意事项
1、传代的时机与再培养的细胞密度 2、传代数与培养物的生长

l 三、体外培养物的生长生物学
一、培养细胞的生长与增殖
n 原代培养期： 细胞性状与体内原组织相似性大，异质性。
n 传代培养期： 细胞增殖旺盛（潜伏期、指数生长期、停滞期），逐渐趋 向同质化，正常细胞约可传30-50代，应及早冻存。
n 衰退期： 细胞增殖减慢，直至死亡。
二、体外细胞培养物的生长类型:： （黏附型细胞；悬浮型细胞）
1、黏附型细胞
1）多数培养细胞贴附生长，属贴壁依赖性细胞。
2)体内：粘附全方位，外形具有复杂的立体特征。
体外：多数情况，细胞只有一个附着平面，外形一般与体内时明显不同。
成纤维细胞型： 梭形、长条形或不规则多角形，胞体一般铺展很开，成群细胞呈现放射状、旋涡状等走行形式。
起源于中胚层的细胞在体外培养时一般表现为此型，如成纤维细胞、肌肉细胞、骨与软骨细胞以及血管内皮细胞等。
上皮细胞型： 扁平、多角形，细胞间相互衔接或呈镶嵌状紧密排列，呈“铺路石样”，形成单层膜。
起源于内、外胚层的细胞体外培养时可能呈现此型，如皮肤表皮及其衍生物、消化管上皮、肝胰、肺泡上皮等。
游走细胞型： 细胞相互分散，一般不形成集落；在器皿壁上生长位置不固定，经常处于较活跃的变形和游走状态，因此外形不规则且不断变化。
主要是具有吞噬作用的单核巨噬细胞细胞系统的细胞，如颗粒性白细胞、淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞以及某些肿瘤细胞。
多形细胞型： 形态不规则，一般分为胞体和胞突两部分。胞突为细长形，似丝状伪足。胞体虽略呈多角形。
主要是神经元和神经胶质细胞

2、 悬浮型细胞
细胞在培养时不粘附于支持物上，而是呈悬浮生长状态，如某些癌细胞和血液白细胞。
细胞悬浮生长时胞体为圆形。适于大量繁殖。
三、培养细胞的生长状况观察
一）常规观察
1培养液：颜色、透明度等； 2细胞生长概况及形态变化：细胞轮廓、折光性、胞内颗粒等； 3微生物污染状况：
二）细胞生长状况观察
1. 细胞计数： 细胞计数仪；细胞计数板
制备细胞悬液，稀释成合适的浓度；
加至细胞计数板中央凹槽处，显微镜下计算四角大方格内细胞总数；
按照公式计算悬液中细胞密度。
2. 细胞生长曲线
细胞生长曲线是衡量细胞增殖快慢的重要指标。
细胞计数法： MTT（CCK-8）法

潜伏期： 细胞有生长话动而无细胞分裂。潜伏期一般为6～24小时。
对数生长期： 细胞数随时间成倍增长，活力最佳，最适合进行实验研究。
停止期（平台期）： 细胞长满瓶壁后，虽有活力但基本不再分裂。
3. 细胞分裂指数（mitotic index, MI）
培养物中分裂相数量占全部细胞数量的百分比，统计时，每瓶至少需计数1000个细胞。
一般细胞的MI约为0.1－0.5%。原代培养物的MI比继代培养物低。连续细胞系和肿瘤细胞高，可达3%－5%。
4. 细胞周期
流式细胞仪测定； 同位素标记测定：3H-TdR 掺入法

细胞群体倍增时间：培养物中细胞数量翻倍的平均时间。
群体倍增时间通常长于单个细胞周期。

四、细胞活力的检测方法
1、台盼蓝排斥试验
台盼蓝（Trypan blue）染色使死细胞呈蓝色，活细胞不着色。计数法得到活细胞比例。
此法简单快速。
注意及时检测，时间过长部分活细胞亦被染色
2、克隆（集落）形成试验
测定单个细胞增殖能力，克隆形成率高者独立生存能力强。
平板克隆形成试验
软琼脂克隆形成试验：多用于检测肿瘤细胞或转化细胞。利用肿瘤细胞的非锚着生长依赖性，将其悬浮培养于软琼脂内。可根据其克隆形成率判断细胞的恶性程度，亦可用此法进行亚克隆分离
3. 3H-TdR 掺入法
3H标记的胸腺嘧啶脱氧核苷（TdR），在DNA复制时掺入至新合成的DNA链中，从而使子细胞被3H标记，测定3H的放射性脉冲数即可比较细胞增殖活性。
4. 细胞活力测定的MTT比色法
n MTT（二甲基噻唑二苯基四唑溴盐）是线粒体琥珀酸脱氢酶的作用底物，在活细胞中 MTT能被其线粒体脱氢酶还原为formazan颗粒，溶于异丙醇或 DMSO之后，溶液颜色深浅与所含的 formazan量成正比，因此根据呈现的 OD值可反应细胞的代谢水平。 死细胞无此酶活性。
n MTT 法简单快速、准确，广泛应用于新药筛选、细胞毒牲试验、肿瘤放射敏感性实验等。
n 亦常用于测定生长曲线。

l 四、细胞系和细胞株
一、基本概念
细胞系 (cell line)： 从原代培养物经传代后得来的一群不均一的细胞。由原先组成原代培养物的所有细胞类型组成，但一般以某种细胞为主。
细胞株 (cell strain)： 通过选择或克隆化培养，从原代培养物或细胞系中获得的具有特殊遗传、生化性质或特异标记的细胞群。
如一定标记染色体、对某种病毒的敏感性或抗性、特殊的抗原性等，这些特性在以后的培养中必须持续存在。

有限细胞株（finite cell strain）
连续细胞株（continuous cell strain
二、建立细胞系（株）的档案
1、培养细胞的来源
交代细胞供体所属物种、年龄、性别、器官或组织来源。对肿瘤组织，应说明临床病理诊断结果、组织来源、病例号等。
说明培养基、血清等的使用条件。
2、细胞生物学特性
说明细胞的一般形态、特征性结构、生长曲线与分裂指数、倍增时间、集落形成率、染色体特性等。对腺细胞应查明有无蛋白质或激素等分泌产物；对肿瘤细胞应作琼脂培养、异体动物成瘤性、组织浸润能力等检测。

l 五、培养物的冷冻与复苏
一、培养物的冷冻保存与复苏原理
冷冻保存： 将体外培养物悬浮在加有或不加冷冻保护剂的溶液中，以一定的冷冻速率降至零下某一温度（一般是低于-70℃的超低温条件），并在此温度下对其长期保存的过程。
复苏： 以一定的复温速率将冻存的培养物恢复到常温的过程。
一）冷冻保护剂
甘油、DMSO
渗透到细胞内，避免细胞过分脱水皱缩，减少水分子形成冰晶，保护酶和蛋白质等。
添加浓度通常为10%。
二）冷冻速率
速度过慢：脱水严重，体积严重收缩，溶质损伤； 速度过快：胞内冰晶损伤严重
三）冷冻保存温度
1、液氮温度（-196℃）是目前最佳的冷冻保存温度。 2、-70℃～-80℃，短期保存一个月内 3、冰点到-40℃保存效果不佳
四）复温速率
37-40 ℃水浴中，于1~2min内快速完成复温
二、冻存方法
（1）待冻存细胞悬液的准备（2）分级冷冻（3）记录
三、冻存细胞的复苏
从液氮中取出后，立即投入到37～40℃温水中，溶解后尽快离心弃除冷冻保护液。

l 六、培养物的污染、检测和排除
一、培养物的污染与检测
1. 污染的内容： 1）微生物： 真菌、细菌和病毒 2） 化学物：
影响细胞生存非细胞所需的细胞成分 3） 细胞：其他非同一种细胞
2. 污染对细胞的影响：
轻者： 细胞生长缓慢、分裂相减少、细胞变得粗糙、轮廓增强
重者： 细胞增殖停止、分裂相消失、胞质中出现大量堆积物、细胞变圆、脱落
3.污染的途径：
空气、清洗消毒、操作、血清、组织块
4. 细菌污染与检测：
怀疑有污染时，用无抗生素的培养液培养检测。如果有的话，几小时内培养液外观就浑浊，呈现黄绿色，在倒置相差显微镜下有点状的细菌颗粒，培养背景变的模糊。
5. 真菌污染与检测：
酵母菌污染： 类似细菌污染，倒置相差显微镜下可以看到圆形或卵圆形的酵母菌；有酒或酸的发酵样异味；液体呈现黄绿色。
霉菌污染： 丝状或树枝状生长的菌丝，成白色丝状团块
6. 支原体污染与检测：
支原体污染的培养细胞，在显微镜下无特殊的外观表现，培养液也不浑浊。因而在污染早期相当难以发现。
如果发现细胞增殖缓慢、破碎的细胞甚多、培养细胞需要频繁改善营养环境才能支持长期传代培养时，应怀疑培养物可能受到支原体污染。
检测技术：DNA荧光染色法、PCR、免疫学方法以及支原体培养法。
7. 病毒污染的检
• 感染了病毒的宿主细胞形态上不一定有显著的特异性改变，因此较难判断。
• 判断方法：电子显微镜观察，免疫学方法，和PCR方法
二、污染的预防
1、培养操作前的准备：
a.定期清洗或更换超净工作台的空气滤网，检查其空气净化标准
b.培养液和培养器皿的无菌检查 c. 操作野的消毒
d.操作者的清洁与消毒
2. 培养操作时的注意事项：
a.培养瓶瓶口与风向一 b.培养瓶的开启、吸管帽的安装等
c.操作时，动作轻软、不许交谈 d. 操作完毕后的清理与消毒
3、其他注意事项：
a.及时冻存有价值的培养物 b.血清的灭活 c.定期更换培养体系中的抗生素 d.定期清洁CO2培养箱 e.新引进的细胞株应严加观察
三、污染的排除
1.抗生素 2.巨噬细胞共培养的方法 3. 小鼠腹腔过继培养方法

思考题
· 细胞培养的基本条件？

· 细胞冻存和解冻的原则是什么？

· 名词解释：细胞系和细胞株。

· 如何进行细胞计数？细胞计数的公式是什么？请详细说明。