piRNA-102526参与缺氧_复氧诱导心肌细胞焦亡作用及机制研究.pdf

第3 6卷 第3期2023 年08月 青 岛 大 学 学 报(自 然 科 学 版)J O U R N A L O F Q I N G D A O U N I V E R S I T Y(N a t u r a l S c i e n c e E d i t i o n)V o l.3 6 N o.3A u g.2023 文章编号:1 0 0 6 1 0 3 7(2 0 2 3)0 3 0 0 1 5 0 6d o i:1 0.3 9 6 9/j.i s s n.1 0 0 6 1 0 3 7.2 0 2 3.0 3.0 4p i R N A-1 0 2 5 2 6参与缺氧/复氧诱导心肌细胞焦亡作用及机制研究王少聪,鞠 杰,陈鑫哲,于 雪,王 昆(青岛大学转化医学研究院,青岛 2 6 6 0 2 1)摘要:为探究p i R NA-1 0 2 5 2 6与心肌细胞焦亡的关系,体外构建小鼠乳鼠原代心肌细胞缺氧/复氧模型,设置 3 h、6 h、9 h、1 2 h、2 4 h 缺氧时间梯度及6 h复氧条件,检测小鼠乳鼠原代心肌细胞焦亡水平。利用q R T-P C R检测p i R NA-1 0 2 5 2 6表达水平,W e s t e r n B l o t t i n g检测焦亡相关蛋白(G S DMD、C a s p a s e-1、I L-1、A S C)表达,P I染色和L DH活性检测细胞死亡。研究结果显示,小鼠乳鼠原代心肌细胞缺氧6 h/复氧6 h,细胞焦亡相关蛋白表达水平最高。抑制 p i R NA-1 0 2 5 2 6 表 达,小 鼠 乳 鼠 原 代 心 肌 细 胞 焦 亡 加 剧,过 表 达 p i R NA-1 0 2 5 2 6,小鼠乳鼠原代心肌细胞焦亡减少。这表明,p i R NA-1 0 2 5 2 6能通过 C a s p a s e-1 参与经典焦亡通路,调节小鼠乳鼠原代心肌细胞焦亡过程。关键词:细胞焦亡;p i R NA;原代小鼠心肌细胞;心肌细胞损伤;G S DMD中图分类号:R 5 4 2.2 文献标志码:A收稿日期:2 0 2 2-1 2-1 0基金项目:国家自然科学基金(批准号:8 2 0 7 0 3 1 3)资助。通信作者:王昆,女,博士,教授,主要研究方向为心脏及心血管疾病分子机制研究。E-m a i l:w a n g k 6 9 6q d u.e d u.c n 近些年,中国老龄化进程不断加重,心血管疾病患病人数持续增长1,且心梗患者数量不断增加2。心肌梗死严重威胁患者生命健康安全,给予心梗患者及时有效治疗非常重要3。恢复患者血供使缺血心脏获得血液再灌注,最大可能降低器官损伤,提高患者预后水平4是现阶段治疗心梗最有效的途径。大量临床研究发现,缺血再灌注过程会导致心肌不可逆损伤5-6,表现为心肌细胞死亡、诱发炎症反应、严重者则发生心律失常甚至死亡7-9,治疗效果大打折扣。因此减少炎症反应,可以保护心肌细胞正常功能。不同于其他细胞死亡,细胞焦亡作为一种新发现的细胞死亡方式,常伴随胞内炎性因子释放,引发免疫炎症反应1 0。细胞焦亡所参与信号通路主要依赖由C a s p a s e-1介导经典通路和C a s p a s e-4/5/1 1介导非经典通路1 1-1 2。p i R NA(P i w i-i n t e r a c t i n g R NA)是一类由2 43 1个核苷酸构成的非编码R NA1 3,需要和P I W I(P-e l e m e n t I n d u c e d W i m p y T e s t i s)蛋白家族成员结合才能发挥基因调控作用1 4。以往研究表明,p i R NA与心脏肥大1 5、癌症1 6和生殖1 7等疾病发生发展密切相关,然而仍缺乏p i R NA调控心肌细胞焦亡的深入研究。因此,本文基于缺氧/复氧(H y p o x i a/R e o x y g e n a t i o n,H/R)诱导小鼠乳鼠原代心肌细胞焦亡模型,研究p i R NA-1 0 2 5 2 6表达水平,以及干预p i R NA-1 0 2 5 2 6表达后与细胞焦亡作用关系,为治疗心肌缺血再灌注损伤提供相关研究思路和新靶点。1 材料与方法1.1 实验材料1 2日小鼠乳鼠(青岛大任富城有限公司);DMEM/F 1 2培养基(大连美仑生物技术有限公司);青霉素与链霉素(大连美仑生物技术有限公司);胎牛血清(大连美仑生物技术有限公司);胰液素(S i g m a R e a g e n t s 青 岛 大 学 学 报(自 然 科 学 版)第3 6卷C o.,L t d);胶原酶(W o r t h i n g t o n B i o c h e m i c a l C o.,L t d);S Y B R G r e e n核酸荧光染料(A c c u r a t e B i o l o g y);逆转录试剂盒(A c c u r a t e B i o l o g y);R I P A裂解液(索莱宝);B C A蛋白浓度测定试剂盒(索莱宝);P I染液(索莱宝);L DH检测试剂盒(索莱宝);E C L显影液(雅酶);干扰R NA(吉玛基因);转染试剂(碧云天);G S DMD(A B c l o n a l);G S DMD-C(A B c l o n a l);C a s p a s e-1(成都正能生物科技有限公司);I L-1(成都正能生物科技有限公司);-a c t i n(成都正能生物科技有限公司);A S C(成都正能生物科技有限公司);辣根过氧化物酶标记二抗(爱必信)。1.2 实验方法1.2.1 分离培养小鼠乳鼠原代心肌细胞 选取雌雄不分12日龄小鼠乳鼠至容器内,用7 5%酒精喷洒小鼠乳鼠23次,杀菌消毒后放至超净工作台。使用眼科剪剪取小鼠乳鼠心脏,置于预冷P B S缓冲液内。清洗34次,然后破碎心脏,移至灭菌锥形瓶内。加入由胰液素和二型胶原酶配制消化液,用锡纸封闭好锥形瓶口,置于3 7 水浴锅内摇动裂解心脏组织,每次消化56 m i n。消化完成后,上清移至含有5 m L胎牛血清离心管内(5 0 m L),再次加入消化液消化,重复该过程,直至心脏碎块被完全消化。收集消化产物置于离心机,1 0 0 0 r p m离心5 m i n。离心后弃上清,用DMEM/F 1 2重悬,再次离心,弃上清。用1 0 m L 5%血清DMEM/F 1 2培养基重悬沉淀,悬液通过 1 0 0 目筛网,筛至1 0 c m细胞培养皿。置于恒温细胞培养箱,细胞差速贴壁1.5 h,收集上层细胞悬液,此时未贴壁细胞为心肌细胞。细胞悬液移至新培养皿内,待2 4 h可完成后续实验。1.2.2 小鼠乳鼠原代心肌细胞转染 分离培养小鼠乳鼠原代心肌细胞,接种至6 c m细胞培养皿,选用吉玛基因公司合成过表达和敲低模拟物。按照转染试剂使用要求,分别转染过表达对照(N C)、p i R NA-1 0 2 5 2 6过表达和敲低合成物至小鼠乳鼠原代心肌细胞。细胞转染3 6 h后,完成后续实验。1.2.3 体外构建小鼠乳鼠原代心肌细胞H/R 模型 小鼠乳鼠原代心肌细胞培养2 4 h后,培养基由5%血清DMEM/F 1 2换为无糖无血清DMEM/F 1 2。小鼠乳鼠原代心肌细胞置于恒温低氧细胞培养箱(3 7,含9 5%N2和5%C O2),设置相应缺氧和复氧时间,构建体外细胞H/R模型。1.2.4 q R T-P C R检测小鼠乳鼠原代心肌细胞相关基因表达水平 设计p i R NA-1 0 2 5 2 6相关引物(表1),R NA通过逆转录试剂盒逆转录为c D NA,使用q R T-P C R检测相关目的基因表达水平。表1 p i R N A-1 0 2 5 2 6相关引物名称及序列引物名称序列U 6-FG C T T C G G C A G C A C A T A T A C T AAU 6-RC G C T T C A C GAA T T T T G C G T G T C A Tp i R NA-1 0 2 5 2 6 R T p r i m e rG T C G T A T C C A G T G C A G G G T C C GA G G T A T T C G C A C T G GA TA C GA C T C AA GAp i R NA-1 0 2 5 2 6-FG G T T C A T A T GA G GA C C A G G T GAp i R NA-1 0 2 5 2 6-RA G T G C A G G G T C C GA G G T A T T1.2.5 W e s t e r n B l o t t i n g检测小鼠乳鼠原代心肌细胞焦亡相关蛋白表达水平 收集每组细胞后提取总蛋白,利用B C A法测定每组蛋白浓度,计算调至相同上样浓度后,通过S D S聚丙烯酰胺凝胶电泳,分离不同大小蛋白。电泳后通过湿法转膜过程转移蛋白至聚偏二氟乙烯(p o l y v i n y l i d e n e f l u o r i d e,P V D F)膜,5%脱脂牛奶封闭1 h非特异性 结合位点,4 环 境用一抗 过夜孵育P V D F膜。次 日T B S T清 洗 膜3次,每 次51 0 m i n。常温条件下用二抗孵育膜1 h,T B S T洗膜51 0 m i n,重复3次。使用化学发光试剂显影P V D F膜表面特异性结合条带,以-a c t i n表达作为参照,分析相关蛋白表达强弱。1.2.6 L DH 表达和 P I 染色检测细胞死亡率 各分组细胞培养基吸至离心管,按照L DH检测试剂盒相关说明操作。操作完成后,待测样品置于酶标仪,选取4 5 0 n m波长,检测样品吸光度值。去除细胞培养皿内原培养基,P B S清洗3次,每次3 m i n。加入适量按比例稀释P I溶液(11 0 0 0稀释),3 7 孵育1 5 m i n,再次使用P B S清洗3 m i n,重复3次,荧光显微镜下观察P I染色阳性细胞比例。1.2.7 统计学分析 利用G r a p h p a d P r i s m 8软件,计量结果以xs表示,两独立样本比较采用t检验,所61 第3期 王少聪等:p i R NA-1 0 2 5 2 6参与缺氧/复氧诱导心肌细胞焦亡作用及机制研究有比较结果以P0.0 5表示具有统计学差异。2 结果2.1 小鼠乳鼠原代心肌细胞 H/R 时间筛选为确定诱导细胞焦亡最佳缺氧时间,构建小鼠乳鼠原代心肌细胞体外H/R模型,探究H/R后,细胞焦亡标志性蛋白G S DMD活性形式G S DMD-C表达。设置3/6 h,6/6 h,9/6 h,1 2/6 h,2 4/6 h缺氧/复氧时间梯度,提取小鼠乳鼠原代心肌细胞总蛋白。通过W e s t e r n B l o t t i n g检测细胞焦亡通路标志性蛋白G S DMD-C,及其上游蛋白C a s p a s e-1,下游蛋白I L-1表达。结果显示,H/R后,细胞焦亡标志性蛋白G S DMD-C缺氧6 h,复氧6 h 后表达最强,G S DMD-C上游和下游蛋白C a s p a s e-1、I L-1表达也明显增加(图1)。图1 细胞焦亡时间点筛选及缺氧6 h/复氧6 h 焦亡相关蛋白表达(a)G S DMD-C 蛋白;(b)C a s p a s e-1蛋白;(c)I L-1蛋白2.2 细胞和各组织器官内p i R N A-1 0 2 5 2 6表达利用q R T-P C R检测小鼠乳鼠原代心肌细胞、非心肌细胞与各组织器官内p i R NA-1 0 2 5 2 6表达水平,由图2可知,H/R后小鼠乳鼠原代心肌细胞p i R NA-1 0 2 5 2 6表达明显降低,小鼠乳鼠心肌细胞表达水平高于非心肌细胞(CM:心肌细胞,C F:非心肌细胞),且心脏组织p i R NA-1 0 2 5 2 6表达明显高于其它组织器官,表明p i R NA-1 0 2 5 2 6高表达于心肌细胞和心脏内。图2 心肌细胞、非心肌细胞及组织器官中p i R N A-1 0 2 5 2 6表达(a)H/R后心肌细胞(P0.0 5);(b)心肌与非心肌细胞(P0.0 5);(c)组织器官(H e a r t:心脏,K i d n e y:肾脏,B r a i n:脑,L u n g:肺,S p l e e n:脾,L i v e r:肝,P0.0 5)2.3 抑制p i R N A-1 0 2 5 2 6表达后的功能向小鼠乳鼠原代心肌细胞转染A n t a g o m i r-p i R NA-1 0 2 5 2 6,构建细胞内基因敲低模型。由图3可知,通过q R T-P C R检测,发现p i R NA-1 0 2 5 2 6敲低组(A n t a g o m i r)相较于对照组表达明显降低,说明敲低模型构建成功。W e s t e r n B l o t t i n g结果显示,敲低小鼠乳鼠原代心肌细胞内p i R NA-1 0 2 5 2 6后,细胞焦亡标志性蛋白G S DMD-C表达增加,其上游蛋白C a s p a s e-1和下游蛋白I L-1表达也明显增加。检测小鼠乳鼠原代心肌细胞上清L DH含量和P I染色结果显示,敲低p i R NA-1 0 2 5 2 6后,细胞上清L DH含量以及P I染色阳性细胞数明显增加,说明小鼠乳鼠原代心肌细胞死亡率增加。因此,敲低小鼠乳鼠原代心肌细胞内p i R NA-1 0 2 5 2 6表达,能促进细胞焦亡过程。2.4 过表达p i R N A-1 0 2 5 2 6后的功能向小鼠乳鼠原代心肌细胞内转染A g o m i r-p i R NA-1 0 2 5 2 6,构建细胞内p i R NA-1 0 2 5 2 6过表达模型,H/R条件下,验证小鼠乳鼠原代心肌细胞焦亡水平。通过q R T-P C R检测,A g o m i r-p i R NA-1 0 2 5 2 6转染组相较71青 岛 大 学 学 报(自 然 科 学 版)第3 6卷于对照组表达明显增高,说明转染模型构建成功(图4)。细胞内转染A g o m i r-p i R NA-1 0 2 5 2 6以及H/R诱导下,提取细胞内总蛋白,W e s t e r n B l o t t i n g检测小鼠乳鼠原代心肌细胞焦亡通路相关标志物表达水平,结果显示H/R+A g o m i r组焦亡标志物G S DMD-C表达降低,其上游和下游蛋白A S C、C a s p a s e-1、I L-1表达也明显降低。检测小鼠乳鼠原代心肌细胞上清L DH含量,发现H/R+A g o m i r组L DH含量明显降低。P I染色阳性细胞数H/R+A g o m i r组相较于H/R+N C组和H/R组减少。因此,过表达小鼠乳鼠原代心肌细胞内p i R NA-1 0 2 5 2 6能有效逆转细胞焦亡过程。图3 抑制p i R N A-1 0 2 5 2 6表达后功能的验证(a)p i R NA-1 0 2 5 2 6转染效率(P0.0 5);(b)G S DMD-C、C a s p a s e-1、I L-1蛋白表达;(c)L DH活力检测(P0.0 5);(d)P I染色图3 讨论近些年细胞死亡研究不断深入,除细胞凋亡、细胞坏死和细胞自噬等死亡类型外,其它细胞死亡相关研究不断被揭示如细胞焦亡、铁死亡、铜死亡1 8。细胞焦亡是一种由炎性因子参与程序性细胞死亡过程1 9,其表现为外界影响因子作用下,激活胞内炎性因子进而活化下游焦亡素蛋白家族。焦亡素蛋白家族是一类打孔蛋白,如G S DMD蛋白被水解后产生具有活性的N段,以多聚体形式聚集于细胞膜表面,继而形成孔洞结构,同时诱发细胞内启动免疫级联反应产生炎性小体如I L-1、I L-1 8 等通过孔洞释放至胞外,引发范围性乃至全身性免疫炎症反应2 0-2 1。研究发现,细胞焦亡参与诸多疾病发生发展过程,如尼古丁使血管内皮细胞发生焦亡导致动脉粥样硬化,诱发心血管疾病2 2。有研究表明,DHA处理后,乳腺癌细胞焦亡过程加剧,诱发乳腺癌细胞死亡,加快癌细胞清理和免疫应答过程,有助于癌症早期预防2 3。因此,深入了解细胞焦亡能够为多种疾病治疗和研究提供新思路。非编码R NA通常不编码蛋白质,大多调控基因表达,深入研究发现许多非编码R NA被证明参与疾病发生和调控过程。早期研究显示,m i R-2 9 a能参与心肌缺血再灌注后心肌细胞损伤,抑制细胞内m i R-2 9 a表达,可有效降低心肌缺血再灌注后细胞焦亡过程2 4。m i R-1 4 9也被证实能参与心肌细胞焦亡过程,m i R-1 4 9与下游靶分子F o x O 3(F o r k h e a d b o x O 3)结合发生负性调控作用,促进缺血再灌注后心肌细胞发生焦亡2 5。p i R NA早期发现于生殖细胞,心脏肥大相关研究证明缺失p i R NA CHA I P I R能有效改善心肌肥厚,促使恢复心脏功能1 5。然而,p i R NA与心肌细胞焦亡作用机制仍不清楚。本文通过构建H/R诱导小鼠乳81 第3期 王少聪等:p i R NA-1 0 2 5 2 6参与缺氧/复氧诱导心肌细胞焦亡作用及机制研究鼠原代心肌细胞焦亡模型,发现过表达p i R NA-1 0 2 5 2 6能够有效逆转小鼠乳鼠原代心肌细胞焦亡过程,但具体作用机制还有待深入研究。图4 过表达p i R N A-1 0 2 5 2 6后功能的验证(a)p i R NA-1 0 2 5 2 6转染效率(P0.0 5);(b)G S DMD-C、C a s p a s e-1、I L-1及A S C蛋白表达;(c)L DH活力检测(P0.0 5);(d)P I染色图4 结论本研究通过体外构建小鼠乳鼠原代心肌细胞H/R模型,探究p i R NA-1 0 2 5 2 6的细胞焦亡调控作用。结果表明,小鼠乳鼠原代心肌细胞,缺氧6 h复氧6 h条件下细胞焦亡相关蛋白表达最明显。p i R NA-1 0 2 5 2 6能依赖C a s p a s e-1G S DMD细胞焦亡经典信号途径调控心肌细胞死亡。今后将通过寻找细胞焦亡通路的其他作用靶点和构建动物模型,检测组织功能水平变化,为心血管疾病治疗及预后提供新参考。参考文献1 中国心血管健康与疾病报告编写组.中国心血管健康与疾病报告2 0 2 1概要J.心脑血管病防治,2 0 2 2,2 2(4):2 0-3 6.2 中国心血管健康与疾病报告编写组.中国心血管健康与疾病报告2 0 2 0概要J.中国循环杂志,2 0 2 1,3 6(6):5 2 1-5 4 5.3 帅靖.心电图对急性心肌梗死诊断的影响J.中国城乡企业卫生,2 0 2 2,3 7(1 0):1 6 7-1 6 9.4H E U S C H G.M y o c a r d i a l i s c h a e m i a-r e p e r f u s i o n i n j u r y a n d c a r d i o p r o t e c t i o n i n p e r s p e c t i v eJ.N a t u r e R e v i e w s C a r d i o l o g y,2 0 2 0,1 7(1 2):7 7 3-7 8 9.5X I AN G M,L U Y D,X I N L Y,e t a l.R o l e o f o x i d a t i v e s t r e s s i n r e p e r f u s i o n f o l l o w i n g m y o c a r d i a l i s c h e m i a a n d i t s t r e a t m e n t sJ.O x i d a-t i v e M e d i c i n e a n d C e l l u l a r L o n g e v i t y,2 0 2 1,2 0 2 1:6 6 1 4 0 0 9.6 王菲,李培峰,高岩岩.p-B R A F在心肌缺血再灌注损伤中的作用和机制研究J.青岛大学学报(自然科学版),2 0 2 2,3 5(2):1 2-1 8.7MO E N S A L,C L A E Y S M J,T I MME RMAN S J P,e t a l.M y o c a r d i a l i s c h e m i a/r e p e r f u s i o n-i n j u r y,a c l i n i c a l v i e w o n a c o m p l e x p a t h o-p h y s i o l o g i c a l p r o c e s sJ.I n t e r n a t i o n a l J o u r n a l o f C a r d i o l o g y,2 0 0 5,1 0 0(2):1 7 9-1 9 0.8N E R I M,F I N E S C H I V,D I P AO L O M,e t a l.C a r d i a c o x i d a t i v e s t r e s s a n d i n f l a mm a t o r y c y t o k i n e s r e s p o n s e a f t e r m y o c a r d i a l i n f a r c t i o nJ.C u r r e n t V a s c u l a r P h a r m a c o l o g y,2 0 1 5,1 3(1):2 6-3 6.9WHE L AN R S,KA P L I N S K I Y V,K I T S I S R N.C e l l d e a t h i n t h e p a t h o g e n e s i s o f h e a r t d i s e a s e:M e c h a n i s m s a n d s i g n i f i c a n c eJ.A n n u a l R e v i e w o f P h y s i o l o g y,2 0 1 0,7 2:1 9-4 4.1 0 S H I H R,GAO Y,D ON G Z,e t a l.G S DMD-m e d i a t e d c a r d i o m y o c y t e p y r o p t o s i s p r o m o t e s m y o c a r d i a l I/R i n j u r yJ.C i r c u l a t i o n R e-s e a r c h,2 0 2 1,1 2 9(3):3 8 3-3 9 6.91青 岛 大 学 学 报(自 然 科 学 版)第3 6卷1 1 M I AO E A,R A J AN J V,A D E R EM A.C a s p a s e-1-i n d u c e d p y r o p t o t i c c e l l d e a t hJ.I mm u n o l o g i c a l R e v i e w s,2 0 1 1,2 4 3(1):2 0 6-2 1 4.1 2 KAYA GAK I N,WA RM I N G S,L AMKAN F I M,e t a l.N o n-c a n o n i c a l i n f l a mm a s o m e a c t i v a t i o n t a r g e t s c a s p a s e-1 1J.N a t u r e,2 0 1 1,4 7 9:1 1 7-1 2 1.1 3 L I U Y M,D O U M,S O N G X X,e t a l.T h e e m e r g i n g r o l e o f t h e p i R N A/p i w i c o m p l e x i n c a n c e rJ.M o l e c u l a r C a n c e r,2 0 1 9,1 8(1):1 2 3.1 4 A R AV I N A,GA I D A T Z I S D,P F E F F E R S,e t a l.A n o v e l c l a s s o f s m a l l R NA s b i n d t o M I L I p r o t e i n i n m o u s e t e s t e sJ.N a t u r e,2 0 0 6,4 4 2:2 0 3-2 0 7.1 5 GAO X Q,Z HAN G Y H,L I U F,e t a l.T h e p i R NA C HA P I R r e g u l a t e s c a r d i a c h y p e r t r o p h y b y c o n t r o l l i n g ME T T L 3-d e p e n d e n t N-m e t h-y l a d e n o s i n e m e t h y l a t i o n o f P a r p 1 0 mR NAJ.N a t u r e C e l l B i o l o g y,2 0 2 0,2 2(1 1):1 3 1 9-1 3 3 1.1 6 MO Y A N O M,S T E F A N I G.p i R N A i n v o l v e m e n t i n g e n o m e s t a b i l i t y a n d h u m a n c a n c e rJ.J o u r n a l o f H e m a t o l o g y&O n c o l o g y,2 0 1 5,8:3 8.1 7 WANG X L,L V C,GUO Y,e t a l.M i t o c h o n d r i a a s s o c i a t e d g e r m i n a l s t r u c t u r e s i n s p e r m a t o g e n e s i s:p i R NA p a t h w a y r e g u l a t i o n a n d b e-y o n dJ.C e l l s,2 0 2 0,9(2):3 9 9.1 8 B AO J H,L U W C,D UAN H,e t a l.I d e n t i f i c a t i o n o f a n o v e l c u p r o p t o s i s-r e l a t e d g e n e s i g n a t u r e a n d i n t e g r a t i v e a n a l y s e s i n p a t i e n t s w i t h l o w e r-g r a d e g l i o m a sJ.F r o n t i e r s i n I mm u n o l o g y,2 0 2 2,1 3:9 3 3 9 7 3.1 9 KOVA C S S B,M I AO E A.G a s d e r m i n s:E f f e c t o r s o f p y r o p t o s i sJ.T r e n d s i n C e l l B i o l o g y,2 0 1 7,2 7(9):6 7 3-6 8 4.2 0 L I U X,Z HAN G Z B,RUAN J B,e t a l.I n f l a mm a s o m e-a c t i v a t e d g a s d e r m i n D c a u s e s p y r o p t o s i s b y f o r m i n g m e m b r a n e p o r e sJ.N a-t u r e,2 0 1 6,5 3 5:1 5 3-1 5 8.2 1 D I N G J J,W A N G K,L I U W,e t a l.P o r e-f o r m i n g a c t i v i t y a n d s t r u c t u r a l a u t o i n h i b i t i o n o f t h e g a s d e r m i n f a m i l yJ.N a t u r e,2 0 1 6,5 3 5:1 1 1-1 1 6.2 2 WU X X,Z HAN G H Y,Q I W,e t a l.N i c o t i n e p r o m o t e s a t h e r o s c l e r o s i s v i a R O S-N L R P 3-m e d i a t e d e n d o t h e l i a l c e l l p y r o p t o s i sJ.C e l l D e a t h&D i s e a s e,2 0 1 8,9:1 7 1.2 3 P I Z A T O N,L U Z E T E B C,K I F F E R L F M V,e t a l.Om e g a-3 d o c o s a h e x a e n o i c a c i d i n d u c e s p y r o p t o s i s c e l l d e a t h i n t r i p l e-n e g a t i v e b r e a s t c a n c e r c e l l sJ.S c i e n t i f i c R e p o r t s,2 0 1 8,8:1 9 5 2.2 4 D I N G S K,L I U D H,WAN G L X,e t a l.I n h i b i t i n g m i c r o R NA-2 9 a p r o t e c t s m y o c a r d i a l i s c h e m i a-r e p e r f u s i o n i n j u r y b y t a r g e t i n g S I R T 1 a n d s u p p r e s s i n g o x i d a t i v e s t r e s s a n d N L R P 3-m e d i a t e d p y r o p t o s i s p a t h w a yJ.T h e J o u r n a l o f P h a r m a c o l o g y a n d E x p e r i m e n t a l T h e r a p e u-t i c s,2 0 2 0,3 7 2(1):1 2 8-1 3 5.2 5 L I N J,L I N H H,MA C,e t a l.M i R-1 4 9 A g g r a v a t e s p y r o p t o s i s i n m y o c a r d i a l i s c h e m i a-r e p e r f u s i o n d a m a g e v i a s i l e n c i n g f o x O 3J.M e d i-c a l S c i e n c e M o n i t o r,2 0 1 9,2 5:8 7 3 3-8 7 4 3.T h e R o l e a n d M e c h a n i s m o f p i R N A-1 0 2 5 2 6 i n H y p o x i a/R e o x y g e n a t i o n-I n d u c e d P y r o p t o s i s i n C a r d i o m y o c y t e sWANG S h a o-c o n g,J U J i e,CHE N X i n-z h e,YU X u e,WANG K u n(I n s t i t u t e o f T r a n s l a t i o n a l M e d i c i n e,Q i n g d a o U n i v e r s i t y,Q i n g d a o 2 6 6 0 2 1,C h i n a)A b s t r a c t:T h e H y p o x i a/R e o x y g e n a t i o n m o d e l o f p r i m a r y n e o n a t a l m o u s e c a r d i o m y o c y t e s w a s c o n s t r u c t e d i n v i t r o t o e x p l o r e t h e r e l a t i o n s h i p b e t w e e n p i R NA-1 0 2 5 2 6 a n d c a r d i o m y o c y t e p y r o p t o s i s.T h e h y p o x i a t i m e g r a d i e n t o f 3 h,6 h,9 h,1 2 h,2 4 h a n d t h e r e o x y g e n a t i o n c o n d i t i o n o f 6 h w e r e s e t t o d e t e c t t h e d e-g r e e o f p y r o p t o s i s o f p r i m a r y n e o n a t a l m o u s e c a r d i o m y o c y t e s.T h e e x p r e s s i o n o f p i R NA-1 0 2 5 2 6 w a s d e t e c-t e d b y q R T-P C R.W e s t e r n B l o t t i n g w a s u s e d t o d e t e c t t h e e x p r e s s i o n o f G S DMD,C a s p a s e-1,I L-1 a n d A S C.P I s t a i n i n g a n d L DH w e r e u s e d t o d e t e c t t h e d e g r e e o f c e l l d e a t h.T h e r e s u l t s s h o w t h a t t h e e x p r e s-s i o n l e v e l o f p y r o p t o s i s-r e l a t e d p r o t e i n s i s t h e h i g h e s t i n p r i m a r y n e o n a t a l m o u s e c a r d i o m y o c y t e s a f t e r h y-p o x i a f o r 6 h a n d r e o x y g e n a t i o n f o r 6 h.T h e e x p r e s s i o n o f p i R NA-1 0 2 5 2 6 i s i n h i b i t e d,a n d t h e p y r o p t o s i s o f p r i m a r y n e o n a t a l m o u s e c a r d i o m y