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中程、长程相互作用对于辨别球状蛋白质和膜蛋白质的作用
M. Michael Gromihaa, S. Selvarajb
a日本,茨城 305-0074, Tsukuba，3-1-1 Koyadai，物理化学研究所(RIKEN)， RIKEN Tsukuba学会
b印度, Tamil Nadu, Tiruchirapalli 620024 ，印度大学， 物理[学]
收到日期：2000年11月20日 发表日期：2001年3月27日
摘要 蛋白质结构里的残基之间相互作用的分析为我们了解他们的折叠和稳定性提供相当多的洞察力。我们先前已经分析了球状蛋白质的折叠过程中中、长程相互作用的作用。在这次的论文中，我们研究在薄膜蛋白质三维结构中的中、长程相互作用的截然不同的作用。 我们观察到在TMH区段里有较多的长程接触对,这意味着这些接触对在螺旋–螺旋相互作用的稳定性方面起着重要的作用。相较于球状蛋白质的全b类型，TMS蛋白质有稍微多的长范围接触对，这显示了TMS蛋白质里更密集的束状填塞。在TMH蛋白质的膜跨越区段中，形成中程接触对的残基数目是形成长程接触对的1.3倍；然而在TMS 蛋白质里，形成长程接触对的残基数目是形成中程接触对的14倍。残基-方式的分析指出，对照于球状蛋白质的全a类型，在 TMH 蛋白质里，残基Cys，Glu，Gly，Pro，Gln，Ser和 Tyr形成的长程接触对比中程接触对多。全a蛋白质里的带电残基对有更多的中程接触对，而在TMH蛋白质里疏水性残基对占优势。残基对形成中范围接触对的概率的这个知识已经成功地用于辨别TMH蛋白质和全a蛋白质。我们通过TMH和TMS蛋白质模板的随机结构证明了从这次研究获得的结果的统计意义。
关键字：螺旋区段和束状区段；中程和长程；膜蛋白质；残基接触对；三维结构
1介绍
在最近二十年期间， 我们一直目睹膜蛋白质领域中令人兴奋的进步。由解决几个横跨膜的螺旋状[1-8]水晶结构和横跨膜的线状[9-14]高分辨率蛋白质带来的的成就，膜蛋白质结构领域的特性特征被很好地理解。由横跨膜片段的β-线状组成的、外部薄膜蛋白质的薄膜装配。由于膜内的许多丰富的和极性的残留物的干涉，薄膜装配比横跨膜的螺旋状蛋白质更复杂。
基于膜蛋白质的三维结构，几次调查已经完成。例如分析：在膜环境里的脯氨酸残基[15,16],在外周胞质和细胞质环里的氨基酸成分[17],在膜蛋白质里的色氨酸残基的重要性 [18],膜蛋白质氨基酸残基的疏水性分布状态和空间安排[19]，以及在确定膜蛋白质的第二结构过程中氨基酸的重要性[20]。同样地，也已经调查了：在油脂双分子层里的螺旋形-螺旋形相互作用[21],膜蛋白质潜在的装配和稳定性的影响力[22]，以及突变数据基质[23]。此外，有人已经提议用多样的理论方法来预言螺旋状的横跨膜[24-30]、线状区段[31-35]，以及利用分子动力学的横跨膜蛋白质的模型[36]。
Tanaka和Scherage[37]将蛋白质交互作用分类为短程、中程和长程，并基于这些相互作用提出了一个三维机制的蛋白质折叠假说。最近，按照在多缩氨基酸的残基之间的分离距离，这些短程、中程和长程相互作用已经被分类了。这种分类已经成功地从事于蛋白质折叠和顺序识别的问题[38，39]。在我们之前的工作中，我们已经分析了中程、长程相互作用在下面两种折叠中的作用：不同结构类型的球状蛋白质的折叠[38，40]以及残基-残基接触对的不同折叠[41-43]。与球状蛋白质不同，作为横跨膜螺旋状蛋白质和横跨膜束状蛋白质的膜装配，理解这种相互作用在膜蛋白质的不同作用是非常重要的。在这次的工作中，我们探索中程、长程相互作用对膜蛋白质残基之间的距离的影响，并且将结果与球状蛋白质进行比较。更进一步地，在全α蛋白质和横跨膜蛋白质中成对构成中程、长程的残基对中，比较优先考虑的残基对正成功地用于辨别出全α蛋白质和横跨膜蛋白质。
2. 材料和方法
2.1膜蛋白质数据库
膜蛋白质数据库起源于文献中关于膜蛋白质可利用的三维结构资料[44]。一套典型的膜蛋白质可以从以下网址获得：http://blanco.biomol.uci.edu/Membrane_Proteins_xtal.html。这里用来研究的PDB代码是：1LGHA, 1LGHB, 1OCCI, 1OCCJ, 1OCCK, 1OCCL, 1OCCM, 1KZUA, 1KZUB, 1BGYE, 1BGYG, 1BGYJ, 1BGYK, 1MSL, 1FUMC, 1FUMD, 1OCCD, 1PRCH, 1OCCB, 1PSSH, 1FUMB, 1BGYD, 1EVLA, 1FUMA, 1AR1B, 1PRHA, 1CX2A, 2SQCA, 1PRCL, 1PRCM, 1OCCA, 1OCCC, 2BRD, 1E12, 1F88, 1PSSL, 1PSSM, 1QLAC, 1AR1A, 1BGYC, 2MPRA, 2OMF, 1PRN, 2POR, 1BXW, 1QJ8, 1QD5, 2FCP和1FEP。就目前的分析而论，我们已经将蛋白质分成六组，(i) 含有少于100个残基的小型TMH蛋白质，(ii)有100-150个残基的中型TMH蛋白质，(iii)单/双膜生成大型TMH蛋白质（大于150个残基），(iv) 单源论膜蛋白质，(v)多样生成TMH蛋白质，(ⅵ)多样生成TMS蛋白质。所有膜蛋白质结构的坐标是从蛋白质资料银行（PDB）获得[45]。
2.2 环绕残基的计算结果以及中程、长程接触对的影响
一个蛋白质分子里的环绕残基的计算结果在早期的文章里已有描述。一个蛋白质分子里的残基通过他们的Cα原子陈述。利用Cα坐标，半径为8 Å的球固定围绕在每一个残基周围，并且计算出与所有残基联系的环绕残基的结果。已知每一个残基对周围媒质的影响有效的距离是8Å[46，47]。8Å的限制已经足够描述氨基酸残基的疏水性的功效，并且足够适应限制和非限制的相互作用[48]。更进一步地，这个限制已经用于理解蛋白质的折叠率[49]、由异变产生的新蛋白质的稳定性[50]以及蛋白质的热稳定性[51，52]。
就一个给定的蛋白质而言，按照研究选定的序列标准，以及小于±3个残基的短程接触、±3或±4个残基的中程接触和>±4个残基的长程接触的影响，已经分析出环绕残基的成分。短程、中程接触对主要描述序列的影响和限制相互作用的影响。
长程接触对(>±4个残基)更进一步被分类为几段相差为10的间隔（4–10; 11–20; 21–30; 31–40; 41–50 和 >50），并且已经计算出每段间隔中长程接触对在所有蛋白质中的百分率。更进一步地，在不同间隔内，所有20种氨基酸残基的长程相互作用的贡献，是用来估计全部的数据库。
2.3 受中程、长程接触对影响的环绕残基的概率
在8 Å领域范围内的残基中，每个在TMH和TMS蛋白质里的残基已经被计算出来，并且那些形成长程接触的残基就像上面描述的那样被选择。就一个给定的蛋白质而论，构成中程、长程接触的所有20种氨基酸残基的概率级别已经被计算出，并且所有20种氨基酸残基的平均优先级别已经用下式计算出来：

这里，Nij是环绕残基中j类型残基环绕i类型残基（400种化合物）的个数，并且它的总和在所有考虑的蛋白质残基之上。Ni和Nj分别是i类型残基和j类型残基的总和。最上面的10对残基对被选择而且用来辨别TMH和全α蛋白质。
3. 结果和讨论
3.1 在中程、长程相互作用中残基的产生
我们观测的所有膜蛋白质类型的中、长程接触对的平均数在表格1中给出。全α蛋白质的各组比较结果也已经在表格中给出。我们观测到在膜蛋白质每一组中、长程接触对的不同特点。在小型TMH蛋白质里的残基有3个中程接触对/残基的平均数，这是非常接近于全α蛋白质的平均数，这显示了中程相互作用在这些蛋白质中的相似作用。但是，TMH蛋白质相较于全α蛋白质，有明显少的长程接触对。当我们考虑有100-150个残基的中型蛋白质时，虽然长程接触对的平均数是1.1±0.3个，中程接触对的平均数近似于小型TMH蛋白质的中程接触对和全α蛋白质的中程接触对的平均数。然而，膜蛋白质对于一个接触对/残基有平均数，而且这个平均数少于球状蛋白质的平均数。大型蛋白质的长程接触对的数目增大很多。单境膜蛋白质和单/双跨越大型膜蛋白质的类型有相似的长程接触对；与小型TMH蛋白质和全α蛋白质相反，他们的中程接触对的平均数少于长程接触对的平均数。
复合的跨越TMH蛋白质和大型的全α蛋白质之间的比较说明了：这些蛋白质有相同数目的中程接触对（3个接触对/残基）。这可能由于在球状蛋白质和膜蛋白质里都存在长螺旋形区段，这说明了填满这两类蛋白质的螺旋线标准存在相似性。相反地，TMS蛋白质相较于全β蛋白质，有少许多的长程接触对（6个接触对/残基）。考虑到全部的接触对，与全β蛋白质（10个接触对/残基）相比，在TMS蛋白质里，我们观测到一个额外接触（11个接触对/残基），这说明了在TMS蛋白质中存在β束的亲近级区段。
3.1.1在不同间隔里的长程接触对
对不同间隔里的长程接触对的分析显示出TMH蛋白质喜欢4-10范围。小型蛋白质对这个范围有微不足道的影响，尽管平均蛋白质和大型蛋白质对范围11-20有少许的影响。我们也注意到在中型的和大型的全α蛋白质中也有相似的趋向。TMS蛋白质喜欢11-20范围，而且更多的长程接触对受到21-30范围影响，类似于在球状蛋白质和 (α/β)8桶蛋白质观测到的[40，42]。这明显地说明了：在球状蛋白质和膜蛋白质里的氨基酸残基之间的物理相互作用保持在相同的范围内。
3.2中、长程接触对的氨基酸残基的概率
平均中、长程接触对已经用于估计在所有6组膜蛋白质里的20种氨基酸残基数。为了记述球状蛋白质和膜蛋白质之间的不同，我们在表格2里，从复合的跨越TMH蛋白质和TMS蛋白质连同全α蛋白质、全β蛋白质获得结果，并提出结论。我们认识到在TMH蛋白质里残基Cys, Leu, Ile, Met, Val, Phe, Trp 和Ala有较多的中范围接触对（表格2a）。明显地，这些残基在膜环境里受到高度重视[29]。在TMH蛋白质中的所有带电残基(Asp, Glu, His, Lys and Arg)相较于全α蛋白质，有较少的中程接触对。另外，对比于全α蛋白质，在TMH蛋白质里的Gln和Tyr残基的中程接触对是非常少的。但是，在TMH蛋白质中的Gly, Met 和Ser相较于全α蛋白质中的，有更多的中程接触对。与球状蛋白质一致的是，Pro由于它在球状蛋白质里是一个螺旋线破坏者[53]，所以它有最少的中程接触对，而且Pro在膜环境里是不受喜欢的残基[15，25]。更进一步地，除了Met和Pro外，全α蛋白质的所有残基的中程接触对比长程接触对多；尽管在TMH蛋白质中，Cys, Glu, Gly, Pro, Gln, Ser和 Tyr残基的长程接触对比中程接触对多。值得注意的是，在TMH蛋白质里所有带电残基的长程、中程接触对之间的比率都比在全α蛋白质里的高。这可能是由于在膜跨越螺旋线界限的附近存在残基[54]。我们认识到在小、中型蛋白质里，Cys有最多的中程接触对。在小型TMH蛋白质和Cys除外的中型TMH蛋白质里的所有残基，有比中程接触对更多的长程接触对。我们认识到单/双跨越大型TMH蛋白质和单境蛋白质的相对趋势：所有残基有比中程接触对更多的长程接触对。
在TMS蛋白质里，Cys残基有最多的长程接触对，接着是Met，而且Pro残基有最少的长程接触对（表2b）。的确，我们先前的学习已经说明Met和Pro在膜跨越β束里分别是接触对最多和最少的残基[34]。对比于平均中、长程接触对，所有残基有更多的长程接触对。特别地，带正电的残基Lys 和 Arg有大约8-12的比率，而在全β蛋白质里是5-7的比率；带负电的残基Asp 和 Glu，在TMS蛋白质里有5-7的比率，而在全β蛋白质里是3-6的比率。
3.3随机结构里的中、长范程接触对
我们已经在序列拖曳程序的帮助下通过(i)拖曳最初的膜蛋白质序列和（ii）保持相同的氨基酸成分,产生随即序列。我们可在http://scrugs.biosci.arizona.edu/util/shuffle.html上取得联系。利用它们各自的TMH/TMS结构的主链作为模板，我们可获得随机结构。而且这些随机结构已经用于分析从TMH和TMS蛋白质获得的结果的统计学意义。
复合的跨越TMH蛋白质的随机结构显示几个残基有相同的中程接触对，并且它的范围只有0.2（中程接触对是介于2.9个和3.1个之间）。但是TMH蛋白质的范围是1.4。考虑到长程接触对，在随机结构里的许多残基有相同的接触对，而且范围是稍微少于TMH蛋白质的范围（表格2a）。同时，我们也已经观测到TMS蛋白质作为模板获得的随机结构和TMS 蛋白质之间相近的差异(表格2b)。更进一步地我们认识到，将TMH和TMS蛋白质两者的随机结构与它们本身进行比较，20种氨基酸残基的中、长程接触对有非常少的偏差。这暗示了在不考虑氨基酸残基的情况下中、长程接触对具有相同的数值。这些结论说明了膜蛋白质除三维结构外有非随机氨基酸序列，以及每个氨基酸残基的中、长程接触对对于保持它们折叠的重要性。因此，从随机结构和膜蛋白质获得的接触对的明显区别证明了在TMH和TMS蛋白质中中、长程接触对的意义。
3.4TMH和TMS区段里构成中、长程接触对的氨基酸残基的概率
TMH和TMS区段里构成中、长程接触对的氨基酸残基的概率在表格3给出。从这个表格我们发现TMH区段中（表格3a），所有的残基一般都有比长程接触对更多的中程接触对。中程接触对和长程接触对的总体对比显示出中程接触对是长程接触对的1.3倍。在TMS区段（表格3b），我们发现总体来说，所有的残基有更多的长程接触对，而且明显是中程接触对的14倍。这可能是由于TMS蛋白质的复合结构，而在TMS蛋白质膜里布满极性残基。而且这个结构使得在区段里较远的邻近β束的残基之间形成氢链网和静电接触对。
在表格3已给出20种氨基酸残基在不同间隔里的长程接触对的数目，而这20种氨基酸残基是在TMH和TMS蛋白质的膜跨越螺旋状和束状区断里。从这个表格我们观察到在球状蛋白质的全α种类里的，不同的残基有不同的概率，而在这个球状蛋白质里的大多数残基喜欢4-10范围。在TMH蛋白质里，Gly在4-10范围内有最多的长程接触对；这种残基对获得膜蛋白质稳定性相互作用的不同类型是非常重要的[55]；极性残基Asn喜欢11-20范围；Len喜欢31-40范围。考虑到Lys优先发生在膜跨越螺旋线附近，带电残基Lys毫无疑问地喜欢4-10范围和41-50范围[54]。在TMS蛋白质中大多数残基喜欢11-20范围。残基His、Asn、Pro和Trp喜欢21-30范围。范围>50、间距为10的残基以及每个范围内的残基(如51-60；61-70等)的概率不是非常重要。因此，我们没有必要详细地讨论范围大于50的残基。
两个典型膜蛋白质的中、长程接触对相对残基数目如图1.所示。这些蛋白质在这样的一种方式内选择： 两个都是一样的大小、复合的跨越而且属于两个不同的类型，TMH(1PRC的M 链)和TMS(2OMF)。 在1PRC的M 链(图.la)方面， 在膜跨越螺旋状的区段里的大多数残基都有4 个中程接触对。有趣地是，与中程接触对相比较，少量的H1，H2 和H4螺旋线的N末端残基有更多的长程接触对。同时我们也认识到 H3和H5螺旋线的C 末端残基有相同的趋势。更进一步的分析说明在H1和H2螺旋线残基之间、 H3和H5螺旋线残基之间、 以及H4 和H5螺旋线残基之间存在长程触对。这结果表明长程相互作用对膜的螺旋形-螺旋形相互作用的稳定性有重要的影响。考虑全部的接触对(包括中、长程)， 局部的最小植总是在蛋白质的非螺旋状的区段里发生。
残基中存在最大的长程接触对。 图表1a显示了Gly92， Pro95 和Trp169的残基数。这些残基有9-11个长程接触对，并且在连结H1和H2以及连接H3和H4长循环区段内发生。残基Gly92和Pro95的大多数接触对与连接H3和H4的环里面的残基有关，而残基Trp165的大多数接触对与连接H1和H2环里面的残基有关。这说明了在膜外部的残基之间存在有利的相互作用。同样的，这些残基有少量的长程接触对与离膜螺旋线最近的终点残基有关。
在2OMF(图1 b)方面，在膜跨越β束里大约有75%的残基没有中程接触对。残基V105、A190、N230、A251和T331被确定为长程接触对(12-13个接触对)的最大限度。在这些残基中，A190、N230和T331是在膜跨越束里，V105和A251非常接近于β束。因此， 长程接触对主要起源于β束里的残基。
3.5 相对于残基数目的长程接触对的数目
为了统计所有膜蛋白质不同类型的长程接触对的数目，我们计算了所有残基的百分比。我们观察到在复合的跨越TMH蛋白质里，大型全α蛋白质中60%的残基平均有1-4个长程接触对。在TMS蛋白质里的残基平均有7-8个长程接触对，而且大约有55%的残基有6-9个长程接触对；全β蛋白质平均有3-8个长程接触对。因此，TMS蛋白质与全β蛋白质相比有更多的长程接触对。
3.6受中、长程影响的残基对
每一种氨基酸残基被所有20种氨基酸残基环绕，而且每一种氨基酸残基的概率取决于膜蛋白质所有类型里被计算出的中、长程接触对。同时我们已经在分析过程中使用复合的跨越TMH 和TMS蛋白质里的最高的10对残基对。
3.6.1中程接触对
在TMH蛋白质里，由于膜跨越螺旋状区段高度适应伸展的疏水性残基，疏水性-疏水性残基对主要形成中程接触对[25]。在疏水性残基中，Leu是最受喜欢的一个。有趣地是，Leu概率小的残基(Ala，Gly和Ser)来形成残基对。相反地，在全α蛋白质中，带电残基除疏水性残基对外， E-K 和D-K更优先构成中程接触对。Lys是最受喜欢的残基之一，而带负电的残基Glu 和Asp有更高的影响力。这些结果显示了TMH和全α蛋白质里的残基对在螺旋线排列方面的不同偏爱。在TMS蛋白质方面， 极性残基Asn 和Ser以及带电基Asn和His更优先考虑构成中程接触对。然而在全β蛋白质的情况下，Asn和His的影响又有所不同，Asn和His对形成中程接触对的作用最小。
3.6.2长程接触对
在TMH蛋白质里，残基Leu，Ile和Gly优先考虑形成长程接触对。在全α蛋白质里，Gly 和Ile的作用相当少，而E-K带电残基对却有相当大的影响力。在TMS蛋白质里， Gly最有影响力。同样的，Asn 和Tyr对长程接触对有较大的影响力。
3.7在不同膜蛋白质类型中的优先相互作用
之前我们分析了膜蛋白质不同类型的残基对的概率，这揭示了物理相互作用对蛋白质折叠和稳定性的重要性。我们发现氢链在小型TMH蛋白质方面有重要的相互作用，而且疏水性相互作用在中型TMH蛋白质有同样的重要性。单、双以及复合的跨越大型TMH蛋白质都受到疏水性相互作用的支配。多处发生的膜蛋白质对疏水性相互作用和氢链相互作用都有影响.在TMS蛋白质里， 我们观察到主要贡献来自于疏水性的相互作用，而氢链和其他极性相互作用也有杰出贡献。
3.8受喜欢的中程残基对在辨别TMH和全α蛋白质方面的应用
我们已经观察到大型TMH 和全α蛋白质之间重要的差别在于构成中程接触对的残基的优先考虑。这促使我们去检验是否这个信息能够用于辨别大型TMH和全α蛋白质。更进一步地，大我们可以通过区别随机结构的标准，证明大型TMH蛋白质残基对观测的重要性。为了这个目的，我们观测了已有资料里的一套23个完整的大型全α蛋白质[40]和一套39个复合的跨越TMH蛋白质[29]。
我们使用下列措施区别TMH 和全α蛋白质：(i)对于一个给定的氨基酸序列来说，列举全部中程接触对；例如，考虑到序列AIGKLHMIYL，在位置5的残基L(明显显示)中程接触对是L-A，L-I，L-I和L-Y(标了下划线的接触对残基)；(ii)如果残基对是在最早的10对受喜欢的残基对(TMH蛋白质L-L， G-L，A-L，I-L，F-L，A-F，L-V， A-A，F-V和L-S)的范围内，那么它就优先考虑；否则，增加整体的优先；L就TMH和全α蛋白质而言的优先数分别是3个和2个；(iii)给那些序列里的所有残基重复步骤(i)和(ii)，并且计算TMH和全α蛋白质总的优先数；(iv)比较TMH 和全α蛋白质的总优先数；如果TMH的优先数比全α蛋白质高，那么蛋白质被分配成为TMH，反过来也是一样的。目前的方法能够成功地以92%的精确度区别36 个TMH 和21个全α蛋白质。
通过比较TMH和全α蛋白质关于下面两个方面的辨别能力：(i)TMH残基对，(ii)从随机结构获得的残基对，我们检验了TMH蛋白质获得的残基对的重要性。我们认识到，TMH蛋白质获得的残基对能够正确地辨别39个TMH中的36个(92%)，而随机残基对的辨别能力只有51%（19个蛋白质已经错误地分配给全α类型）。这个结果强调了TMH蛋白质里受喜欢的残基对的正确性。
辨别球状蛋白质和膜蛋白质的不同类型的详细工作目前正在进行中。
4.结论
这篇论文的研究揭示了：对比于球状蛋白质，中、长程相互作用在TMH和TMS蛋白质的结构和稳定性方面的不同作用。特别地，长程相互作用在TMH蛋白质里的螺旋形-螺旋形相互作用的稳定性方面，以及在TMS蛋白质里的β束的紧密填塞方面起着重要的作用。TMH蛋白质的膜跨越区段有4个中程接触对，而TMS蛋白质膜跨越区段没有中程接触对。在TMS蛋白质里的残基平均有7-8个长程接触对，这明显高于球状蛋白质全β类型里的平均数。疏水性残基对形成TMH蛋白质的中程接触对有所贡献，同时，带电和极性残基对全α蛋白质有影响。形成中程接触对的残基对的优先考虑能有效的用于辨别TMH和全α蛋白质。更进一步地，我们通过随机结构证明了这些结果的统计意义。这次研究的结论对以下两个方面将有所贡献：将球状蛋白质和膜蛋白质区分开；预测在TMH 和TMS蛋白质里的膜跨越螺旋状和束状区段。
感谢：
作者感谢Dr. P. Prabakaran, Ms. A. Mary Thangakani 和 Ms. K.T. Shali他们阅读这份原稿。
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图一：两种典型的膜蛋白质的中、长程接触对的数目。(a) 1PRC的M链以及(b) 2OMF。密集和疏散的线分别揭示了中、长程接触对

表格一：对于不同膜蛋白质的中、长程接触对的平均值 （n 是在蛋白质里残基的总数目）

表格二：在TMH 和TMS蛋白质里的20种氨基酸残基中每一个残基的中、长程接触对的平均值
（S.D是在20种氨基酸残基中的规范化的标准偏差。范围不同于最高和最低之间的接触对）

表格三：在膜生成和束状区段里的20种氨基酸残基在不同距离里的长程接触对的数目