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TAB检测方法
一、 美国库格方法（K氏培养基）
1、 设备及材料
1.1 天平
1.2 水浴锅
1.3 灭菌三角烧瓶 （500ml, 250ml）
1.4 酒精灯
1.5 抽滤装置（过滤器和抽滤机）
1.6 0.45μm滤膜（φ50mm）
1.7 医用镊子
1.8 灭菌平皿（φ90mm）
1.9 培养箱
2、培养基的制备
2.1 在1L烧瓶里放入如下配料
蒸馏水或去离子水 900ml
酵母浸膏（OX） 2.5g 0.25%
蛋白胨（MERK） 5.0g 0.50%
葡萄糖（MERK） 1.0g 0.10%
吐温80 1.0g 0.10%
琼脂粉（北京奥博星） 15g 1.5%
在121℃、15磅压力下高压灭菌15min，放置于46℃水浴里。
取2.5g苹果酸于100ml的烧杯里，加蒸馏水或去离子水100ml混匀并通过0.22μm滤膜过滤除菌。
2.2苹果酸溶液到调制的K-培养基里并小心混合，调整培养基pH值为3.7±0.1，注入酸化的培养基到灭菌平板里，让其凝固备用。
3、操作步骤
3.1、检样处理
3.1.1 称取10克浓缩苹果清汁于250ML三角烧瓶里，加蒸馏水或去离子水90ML。
3.1.2在80℃水浴上摇动加热13min（当样品温度达到80℃时开始记时）
3.1.3在冷水里迅速冷却样品。
3.2过滤培养
3.2.1样品通过0.45微米的滤膜真空过滤。
3.2.2移去过滤器的顶部，用无菌镊子从过滤器上移取滤膜放置在K-培养基平板 上。
3.2.3轻轻按压滤膜，使滤膜与培养基之间没有气泡，保证与培养基接触。
3.2.4将平板正面朝上置于41℃的培养箱内培养5天。
4、菌落计数：计算滤膜上的菌落数。
5、结果报告：报告每10克样品所含的菌落数。

二、美国雀巢方法（K氏培养基）
1、仪器和试剂
A 、仪器
1.1 80°C水浴锅
1.2 温度计
1.3 10ml移液管
1.4 培养皿, 60 x 15 mm, #1007, B-D, Falcon Plastics, Oxnard, CA
1.5 43°C 的培养箱
1.6 带盖子的灭菌试管和试管架, 20 x 150 mm
1.7 0.45um滤膜,灭菌的微孔过滤器, TYPE HA, #HAWG047S0,
Millipore Corp., Bedford, MA 01730
1.8塑料袋
1.9显微镜,微生物载玻片,盖玻片
微孔过滤器，灭菌镊子
B 化学药品
1.1苹果酸
1.2灭菌的50 ml 蒸馏水空白
1.3为洗涤过滤器和真空设备的灭菌蒸馏水
C、试剂 A） 蛋白胨 5 g
酵母粉 2.5 g
葡萄糖 1.0 g
吐温80 1.0 g
琼脂粉 15 g.
把这些成分加入到990 ml的蒸馏水中，加热使其沸腾。高压灭菌121°C 15分钟，使用之前冷却到45°C，用25% 灭菌的苹果酸溶液调节pH 达到3.7
B）25%的苹果酸,必须经过无菌过滤并且在使用之前加到 K氏培养基中.
2、检测步骤
样品准备
用一个15 ml的广口吸管,以无菌操作移取10 ml样品并且将其加到20 x 150 mm的无菌试管中.另外再取15 ml 样品加入到另一个试管中(温度控制用),给此试管中插入一个温度计.
1. 将两个试管都放入到80°C的水浴中.(水浴锅中的水面应高于试管中的样品).当温度控制用的试管中的温度计达到80°C时,开始计时10分钟.
2. 10分钟后,迅速将试管放入冰浴.
3. 将10 ml经过热处理的样品加到50 ml的灭菌水中.
4． 用真空泵将此60 ml全部通过0.45 µm的滤膜.用10-20 ml的灭菌蒸馏水冲洗这个瓶子和过滤器.确信这张膜被真空抽干.将这张滤膜放到K氏培养基上.为了防止气泡,小心的使滤膜滚贴到K氏培养基上,并且用无菌的镊子轻敲滤膜,使滤膜的边缘紧贴在培养基上.
5. 用密封的容器(塑料袋)将此培养基在43°C 培养 3-5天.
6. 计数平板上所有的菌落并且报告每10 ml 中检出的耐酸耐热菌的结果.

三、日本嘉吉方法（YSG培养基）
1 仪器和试剂
1.1 恒温水浴锅：70±1℃
1.2 恒温培养箱：45±1℃。
1.3 灭菌培养皿：直径为90mm。
1.4 滤膜：0.45um水系一次性滤膜。
1.5 灭菌三角瓶：500ml。
1.6 灭菌蒸馏水。
1.7 YSG培养基的配制：
A组：
酵母粉（MERCK）： 2.0g
葡萄糖： 1.0g
可溶性淀粉(MERCK)： 2.0g
蒸馏水： 500ml
把A组用1-2N硫酸或盐酸调至PH为3.7±0.1；
B组：
琼脂（MERCK）： 15.0g
蒸馏水： 500ml
把A组和B组分别在121℃ 15分钟条件下灭菌，冷却至50—60℃，把两者混合。
2 、 操作步骤
2.1 取样品50ml于一个无菌瓶中，另取同样品同体积于一个相同的瓶中做温度控制用，在温度控制瓶中插入温度计。
2.2 把两个瓶都放入到70℃的水浴中。(水浴锅中的水面应高于瓶中的样品)，当温度控制瓶中的温度计达到70℃时，开始计时20分钟。
2.3 20分钟后，迅速将样品放入冰浴。
2.4 将经过热处理的样品加灭菌水稀释，稀释倍数约10倍左右。用真空泵将此样品全部通过0.45 µm的滤膜。用灭菌蒸馏水冲洗这个瓶子和过滤器。确信这张膜被真空抽干。将这张滤膜放到YSG培养基上。为了防止气泡，小心的使滤膜滚贴到YSG培养基上，并且用无菌的镊子轻敲滤膜，使滤膜的边缘紧贴在培养基上。
2.5 将此培养基在45℃培养 3-5天。
2.6 计数平板上所有的菌落
3、 数据处理
检出的耐酸耐热菌以cfu/50ml报告。

四、嘉吉方法：耐酸耐热菌检测（PDA琼脂）
1. Method of detection of ATSB
(ATSB = Acido-Thermoresistant Sporeforming Bacteria)

Materials 材料
- 250 ml bottle with heat resistant screwcap. 250毫升带有抗热螺丝钉的瓶子
- 100 ml bottle with aluminium screwcap. 100毫升带有率螺丝钉的瓶子
- Demiwater
- PDA agar merck PDA培养基
- Magnetic stirrer/heater磁力加热器
- 2000 ml erlenmeyer2000毫升的 erlenmeyer
- Dosagepipet of 1 milliliter千分之一毫升的吸量管
- Pipet 1 ml 1毫升的吸量管
- 9.5% tartaric acid solution.9.5%的酒石酸溶液
- Temperature adjustable water-bath可调节温度的水浴
- Sterile sample spoon or sterile hypodermic syringe (10ml).消过毒的样品匙或者消过毒的注射器（10毫升）
- Petri dish 14cm diameter14厘米直径的Petri盘
- Incubator培养器

medium ATSB.ATSB媒介

- Fill 90ml demiwater in 250ml bottle with screwcap, sterilize in autoclave during 15 minutes at 121°C.
- 将90毫升的demiwater注入250毫升带有抗热螺丝钉的瓶子，放在高压锅中在121°C条件下杀菌15分钟。
- Weigh 117.0 g of PDA agar
- 称量117克PDA培养基
- Dissolve the agar into 2000 g of demi water while heating/steering.
- 在加热搅拌过程中，将培养基溶解在2000克demi water中
- Fill 100 gram of dissolved agar into 100 ml bottle with alucap and sterilize during 15 minutes at 121°C.
- 将100克溶解后的培养基注入100毫升带有率螺丝钉的瓶子，并在121°C的条件下杀菌15分钟
- Cool solution back to 60°C and add 1.0 ml 9.5% tartaric solution
- 将溶液冷却至60°C并 加入1毫升9.5%的酒石酸溶液
- Cool further to 47.5°C prior usage.
- 在使用前进一步冷却至47.5°C

Procedure
- For single strength juice: pour 100 ml of sample in an empty sterile screw-cap bottle.
- 单一浓度的果汁：将100毫升的样品注入杀过菌的带有螺丝的空瓶中。
- For concentrate add 10 grams of sample into a sterile screw-cap bottle containing 90 ml of sterile distilled water.
- 浓缩果汁：将10毫升样品加入含有90毫升灭菌蒸馏水的带有螺丝的瓶子中
- Heat-shock the sample by placing the bottle in an 80°C water-bath for 10 minutes.
- 在80°C的水浴中加热样品10分钟。
- Start timing when the sample temperature reaches 80°C, and be sure that the water level in the bath is above the level of sample in the bottle.
- 在样品温度达到80°C时开始计时，并且保证水的液面高于瓶中样品的液面。
- Quickly cool the sample by placing into ice or cold water.
- 将样品至于冰水或者冷水中快速冷却。
- Pour 50 ml of the agar into the 100 ml sample.
- 将50毫升的培养基注入100毫升的样品中。
- Divide the 150 ml mix over 3 large petri dishes, and swirl to mix well
- 将150毫升的混合物分在3个大的petr盘中，并充分搅匀。
- Allow the plates to solidify
- 允许盘子凝固
- Incubate the plates for 5 days at 46°C +/- 1 °C
- 在46+/-1°C的温度下，培养5天
- Count the total of colonies on all three plates and record as:
- 将3个盘子中的菌落群体计数并记录如下：
- A) For single strength juice: Divide the total number of colonies on all three plates by 10 to obtain the count of Acido-Thermoresistant Sporeforming Bacteria in cfu/ 10 ml of juice. (Sensitivity = <0.01 cfu/ml).
- Ａ）单一浓度的果汁：用１０除三个盘子中的菌落总数作为10克果汁中含有的ATSB数量（灵敏度= <0.01cfu/ml）
- B) For concentrated juice: Record the total number of colonies on all three plates as is to obtain the amount of Acido-Thermoresistant Sporeforming Bacteria in cfu/10 gram of concentrate.
- Ｂ）浓缩果汁：记录三个培养皿中的菌落总数作为10克浓缩果汁中含有的ATSB数量

五、ACB检测方法

• 有代表性的样品，最少10克,
• 稀释样品： 用1:10的比例，用消过毒的水 (YSG/BAT broth)
• 在80oC热处理10分钟，然后冷却至45oC
• 过滤(稀释后可过滤的样品可选择)
• 在45oC浓缩(不可过滤的样品)2-5天
• Direct spread plating 0,1 ml (optional)/(sub)culturing filters, enrichment broths on K agar, and on YSG or BAT agar, 在45oC培养2- 5天

培养媒介：K agar
成份：
酵母提取物 2.5 g
蛋白胨 5.0 g
葡萄糖 1.0 g
Tween 80 1.0 g
琼脂 15.0 g
准备
将以上成份混合并加一升去除矿物质的水。用高压灭菌器杀菌(15分钟，121oC)。冷却至大约50oC并用25%苹果酸将PH值调节至3.7。
* K-agar可以从 Biotrace International BioProducts通过商业方式获得；产品号BP-0234-500； 网址：

培养介质：YSG agar
成份：
• 酵母提取物 2.0 g
• 葡萄糖 1.0 g
• 可溶性淀粉 2.0 g
• 琼脂 15.0 g
准备：
• 将以上成份混合并加一升去除矿物质的水。用高压灭菌器杀菌(15分钟，121oC)。冷却至大约50oC并用1 N HCl将PH值调节至3.7。
 *YSG agar 可以在德国达姆施塔特的Merck KGaA通过商业方式获得； YSG Agar用于微生物学，目录编号1.07207.0500。

培养介质：BAT agar
成份：
A) CaCl2 .2H2O 　　 0.25g
MgSO4 .7H2O 0.50g
(NH4)2 SO4 0.20g
KH2PO4 3.0g
霉菌提取物 2.0 g
葡萄糖 5.0g
微量矿物质溶液* 1.0 ml
去矿物质水 500ml
 用1N H2SO4 或者1N NaOH 调节介质的PH值至4.0。
用高压灭菌器杀菌(15分钟，121oC)并冷却至50oC。

培养介质：BAT agar
成份：
*微量矿物质溶液
CaCl2.2H2 0.66g； ZnSO4.7H2O 0.18g； CuSO4.5H2O 0.16g；
MnSO4.H2O 0.15g； CoCl2.5H2O 0.18g； H3BO3 0.10g；
Na2MoO4.2H2O 0.30g； 去矿物质水1000ml
用高压灭菌器杀菌并冷藏。
B)琼脂 15 到 20 g
蒸馏水 500ml
用高压灭菌器杀菌(15分钟，121oC)并冷却至50oC。
将容积相等的A和B溶液无菌混合，检查pH (如有需要，将PH值调至4.0),并倾倒入盘子中。
** BAT agar 可以在德国达姆施塔特的Merck KGaA通过商业方式获得： BAT Agar适用于微生物学，目录编号 1.07994.0500。

22、IFU- 程序1，适用于浓缩果汁和其他原料
• 检测从K agar, YSG agar and BAT agar上发展的生物群体。
• YSG and BAT介质支持所有目前所知的alicyclobacilli种类的生长, 与K agar相比，他们可以看到更为广泛的其他生物群体种类。
• 从每一个挑选过的群体中，取一部分放在 K agar 盘子，一个盘子含有中性PH值介质， (例如PCA, TSA)和两个YSG agar盘子， 在45+1oC培养3-5天。
• 但是第二个YSG盘子在65+1oC条件下2-3天。

23、IFU- 程序1适用于浓缩果汁和其他原料
• 观察生长情况：中性PH值介质中的应该没有生长，在这个盘子中，如果发现有生长现象， 那么记录alicyclobacilli为阴性。
• 检查K agar群体上出现的孢子。如果在K agar介质上没有生长现象，那么在 YSG agar上应该有生长。
• 在YSG agar上不应该出现孢子群。所以需要在其他介质上生长的孢子群，像BAT agar。 适宜用pH < 4.0 ，可以排除其他酸性孢子形成菌落，像Bacillus coagulans。

24、IFU- 程序1适用于浓缩果汁和其他原料
• 检查在65oC培养的 YSG 盘子：可产生污染的alicyclobacilli不可能在65oC生长。如果发现有生长，记录假定的可产生污染的alicyclobacilli为阴性。
• 记录在pH 为3.7时可产生孢子和在pH >6时不产生孢子的假定alicyclobacilli群体。那些在65oC不生长的是假定的可产生污染的alicyclobacilli。

25、IFU- 程序1 适用于浓缩果汁和其他原料
用过氧化物酶测试方法检测vanillic acid产生的愈疮木酚
像 A. acidoterrestris, A. acidiphilus, A. herbarius 和其他一些种类，在这个实验中也许呈阳性，但是它不是在所有的果汁生产过程中都会产生愈疮木酚。
像 A. acidocaldarius在这个实验中会呈阴性。
过氧化物酶的确认试验可以在日本的Kyokuto Pharmaceutical Industrial Co Ltd通过商业方式获得。 (联系: [e-mail]).

26、IFU-程序1 适用于浓缩果汁和其他原料
记录结果：
如果有使用过滤技术，用‘x’ 计数在10克样品中检测出的（或没有检出的）假定可产生污染的alicyclobacilli。
或：如果有使用浓缩技术，用阳性（阴性）表示在10克样品中检测出的（或没有检出的）假定可产生污染的alicyclobacilli。
或：如果有使用direct spread plate技术，用 ‘x’计数在0.01克样品中检测出的（或没有检出的）假定可产生污染的alicyclobacilli。

27、IFU- Alicyclobacillus检测方法
• 方法2适用于在生产结束后直接检测最终产品的样品（果汁、饮料、调料和其他可供销费的产品），这时就不需要另外做热处理。
• 样品预处理。

28、IFU-方法2适用于检测在生产结束后直接取得的最终产品
取一个完整包装的最终产品。
在原包装中预处理最终产品，温度为 45+1oC，时间为7天。
在无菌条件下打开包装，分别在含有K agar， YSG agar 或者 BAT agar的盘子中加入预处理过的产品0.14ml，使用spread plate技术。
将petri dishes在45+1oC条件下培养最少2天，如果盘子中没有任何生长现象就再培养5天。

29、IFU- Alicyclobacillus检测方法
• 方法C3 适用于在市场上取得的产品
• 样品预处理是可选择的，它和热处理是一样的。
• 在培养后没有检测出alicyclobacilli，如果怀疑是被破坏了，我们推荐使用热处理和浓缩。

30、IFU-方法C3 适用于在市场上取得的产品
同方法2，可是，
如果怀疑被alicyclobacilli损坏， 并且在直接培养后没有发现生物体，那么取一些样品（大约100ml）做热处理，并在45+1oC条件下培养热处理过的样品。 然后分别在K agar，YSG agar，或者 BAT agar中培养2天， 如果初次培养美育生长现象，那么再培养5天。