UTMD联合抑制CREB基因促进动脉粥样硬化斑块稳定性的实验研究.pdf

现代实用医学2 0 2 3年10 月第35卷第10 期UTMD联合抑制CREB基因促进动脉粥样硬化斑块稳定性的实验研究.1277:邱勤，徐萍，刘旭东【摘要】目的探究超声靶向微泡破坏(UTMD)联合抑制环磷腺苷效应元件结合蛋白(CREB)基因对动脉粥样硬化斑块稳定性的影响。方法将2 0 只健康雄性新西兰兔（45月龄）随机分为空白组（n=5）、模型组(n=5）、对照组（单纯CREB质粒组，n=5)和治疗组（UTMD联合CREB质粒组，n=5）；利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR）和WesternBlot实验分别评估CREB、血管内皮生长因子(VEGF）、基质金属蛋白酶-2/9(MMP-2/9)的RNA和蛋白水平；实时剪切波弹性杨氏模量值和超声造影峰值强度评估斑块；乳胶增强免疫比浊测定血清白介素（IL)-17A和超敏C反应蛋白（hs-CRP）含量；利用免疫组化染色评估斑块内VEGF、M M P-2/9 的表达及定位。结果治疗组CREB、V EG F和MMP-2/9的mRNA水平和表达低于模型组和对照组（t4.59，均P0.05）。与空白组相比，模型组存在hs-CRP和IL-17A的高表达(t13.51,均P0.05)；对照组和治疗组 hs-CRP和 IL-17A的表达较模型组低,并且治疗组 hs-CRP和IL-17A的表达低于对照组(t2.50,均 P0.05）。实时剪切波弹性成像及超声造影提示，与模型组和对照组相比，治疗组斑块杨氏模量值显著性升高，造影峰值强度值明显下降（t4.60，均P0.05）。免疫组化显示，治疗组VEGF和MMP-2/9的表达阳性细胞数明显低于模型组和对照组。结论通过建立动脉粥样硬化动物模型和评估斑块的蛋白表达发现，UTMD联合CREB质粒具有比单纯CREB质粒更高的转染效率，有效降低斑块的CREB蛋白表达，使斑块更加稳定。【关键词】动脉粥样硬化；斑块；稳定性；超声靶向微泡破坏；抑制环磷腺苷效应元件结合蛋白doi:10.3969/j.issn.1671-0800.2023.10.005【中图分类号】R543.5Study of UTMD combined with CREB gene inhibition on the stability of atherosclerotic plaqueQIU Qin,XU Ping,LIU Xudong(Ningbo Yinzhou No.2 Hospital,Ningbo 315010,Zhejiang,China)Corresponding author:XU Ping,Email:AbstractJObjective To explore the effect of ultrasonic targeted microbubble destruction(UTMD)combined withcAMP-response element binding protein(CREB)gene inhibition on the stability of atherosclerotic plaque.MethodsAtherosclerosis animal models were established by liquid nitrogen injury method and high-fat feeding method,andwere randomly divided into model group,control group(CREB plasmid group)and treatment group(UTMD com-bined with CREB plasmid group).New Zealand rabbits with normal diet were randomly selected as the blank group.RNA and protein levels of CREB,vascular endothelial growth factor(VEGF)and matrix metalloproteinase-2/9(MMP-2/9)were evaluated by qRT-PCR and Western Blot assay,respectively.Real time shear wave elastic Youngsmodulus value and contrast-enhanced ultrasound peak intensity assessment of plaques.ELISA assay was used to de-tect the levels of IL-17A and hs-CRP in the serum of New Zealand rabbits.Evaluate the expression and localizationof VEGF and MMP-2/9 in plaques using immunohistochemical staining.Results The mRNA levels and ex-pressions ofCREB,VEGF,and MMP-2/9 in the treatment group were significantly lower than those in the model gro-up and control group(all P 0.05).Compared with the blank group,the model group showed high expression ofhigh-sensitivity C-reactive protein(hs-CRP)and Interleukins-17A(IL-17A)(P 0.05).The expressions of hs-CRPand IL-17A in the control group and treatment group were lower than those in the model group,and the expressionsof hs-CRP and IL-17A in the treatment group were significantly lower than those in the control group(P 0.05).The results of real-time shear wave elastography and contrast-enhanced ultrasound showed that compared with themodel group and control group,the Youngs modulus value of plaques in the treatment group significantly increased,作者单位：31519 2 宁波，宁波市鄞州区第二医院通信作者：徐萍，Email：2 36 38 9 9 0 q q.c o m【文献标志码】A【文章编号】16 7 1-0 8 0 0(2 0 2 3)10-12 7 7-0 6:1278while the peak intensity value of contrast-enhanced ultrasound significantly decreased.The immunohistochemicalresults showed that the number of positive cells expressing VEGF and MMP-2/9 in the treatment group was signifi-cantly lower than that in the model group and control group.Conclusions Through the establishment of athero-sclerosis animal model and the evaluation of the protein expression and properties of plaque,it is found that UTMDcombined with CREB plasmid has a higher transfection efficiency than the simple CREB plasmid,which effectivelyreduces the CREB protein expression of plaque and makes plaque more stable.Key words Atherosclerosis;Paque;Stability;Ultrasonic targeted microbubble destruction;Inhibition of cyc-lic adenosine responsive element binding proteinModern Practical Medicine,2023,35(10):1277-1282随着人们生活水平的提高和饮食习惯的改变，mg/kg)注射戊巴比妥钠对实验动物实施安乐死。本各种心肌梗死和缺血性脑卒中等致死性疾病正在逐研究经宁波大学实验动物伦理委员会审批通过（申渐年轻化且发病率显著上升。动脉粥样硬化(AS)请编号：12 6 9 8)。易损斑块的破裂与心脑血管疾病的发生密切相关。1.2超声仪器及方法彩色多普勒超声诊断仪选用研究发现，炎症因子、基质金属蛋白酶（MIMPs)和血西门子AccusonS2000超声诊断仪，探头频率为6 管内皮生长因子（VEGF)在斑块的形成和促进不稳18MHz,用于斑块的二维测量；麦瑞Resona7S超声定性中起着重要的作用；因此，抑制上述因子是增加诊断仪，探头频率为514MHz，用于斑块的弹性斑块稳定性的重要方法。环磷腺苷效应元件结合成像和造影；融海低功率聚焦超声实验装置用于超蛋白（CREB)是细胞内第二信使的转录因子，参与炎声辐照。分别在第0.56 和7 0 天对仰卧位兔子的右症因子、斑块内新生血管和MMP 的调节47,调节侧颈总动脉进行了B-型超声、实时剪切波弹性成像CREB的表达有望成为稳定斑块治疗AS的新方法。(SWE)和超声造影检查，评估斑块的形状、大小、回超声靶向微泡破坏技术(UTMD)是一种新型的基因声、硬度、微血管密度和颈总动脉内膜-中层厚度转染方法，具有安全、无创、靶向性和可重复使用性(CIMT）。同时治疗组给予超声辐照（输出频率6 50好等优点，已广泛应用于基因和药物的靶向治疗8。kHz、输出能量2.5W/cm、辐照时间3min）。本研究将UTMD与RNA干扰技术相结合，构建针1.3超声微泡和质粒转染GV102质粒(6.4kb)购对CREB的shRNA，以超声微泡为载体释放shRNA自吉凯基因（中国上海），将质粒转化为大肠杆菌后用超声辐照兔颈动脉斑块组织，观察其是否能通TOP10感受态细胞（吉凯基因，中国上海），并根据质过抑制颈动脉斑块中白介素（IL)-17A、M M P-2、粒提取试剂盒（中国北京天根)说明书提取纯化。通MMP-9和VEGF的表达，达到减促进斑块稳定性的过分光光度法（1mg/ml）测量所得质粒DNA的浓目的，报道如下。度，并在2 6 0 nm处测量质粒DNA的吸光度。OD260/OD280在1.8 2.0 之间表明质粒DNA中没有污1资料与方法染，然后将产物保存于一2 0。声诺维购自Bracco1.1动物模型的建立及分组健康雄性新西兰兔（4Imaging（意大利米兰）。用0.9%氯化钠注射液制备5月龄）2 0 只购自宁波大学动物实验中心，体质量声诺维微泡悬浮液，然后倒置或振动使微泡以(2 2.02.5k g。完全随机分为空白组（n=5)，模型组5)10/ml的密度和5mg/ml的浓度均匀分布。实验(n=5），对照组（单纯CREB质粒组，n=5）和治疗组前,将5ml声诺维与1ml质粒DNA溶液(（含1mg(UTMD联合CREB质粒组，n=5）。用液氮损伤右质粒）混合，在4下保存15min后，通过耳静脉将侧颈总动脉（RCCA）后，采用含10%胆固醇的高胆混合物注射入AS模型兔，然后对AS模型兔右侧颈固醇血症饮食喂养10 周建立AS模型，食物摄入量动脉斑块处进行3min的超声脉冲辐照（2.5W/cm）。限制在10 0 g/d。本研究中的新西兰兔于宁波大学1.4血脂测定新西兰兔禁食2 4h后，通过耳缘静实验动物研究中心饲养，动物实验按照宁波大学动脉抽取血液样本后放入普通干燥试管中。采用自动物实验规定进行。研究结束后，通过耳缘静脉（150生化分析仪分别测定第0 和56 天的血清总胆固醇Modern Practical Medicine,October 2023,Vol.35,No.10现代实用医学2 0 2 3年10 月第35卷第10 期(TC)、三酰甘油（TG)、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C)和高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)水平。1.5血清超敏C反应蛋白(hs-CRP)和IL-17A测定分别于第56 和7 0 天抽取3ml新西兰免空腹静脉血，放入普通干燥试管中，立即行乳胶增强免疫比浊测定,测量血清 hs-CRP和IL-17A水平。1.6蛋白质印迹分析获得组织提取物并在12%SDS-聚丙烯酰胺凝胶上分离蛋白质，转移到PVDF膜上。用5%BSA封闭后，将膜与适当稀释的特异性一抗抗CREB抗体，抗VEGF，抗MMP-9，抗MMP-2和GAPDH（购自上海爱必信)在4下共孵育过夜。然后，将膜与辣根过氧化物酶标记的二抗（博斯特，中国武汉）一起孵育后，使用增强型化学发光试剂可视化蛋白质条带。1.7逆转录和实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析使用Trizol试剂从新西兰兔右侧颈总动脉中提取总RNA，使用分光光度法测量总RNA量，并使用逆转录试剂盒将总RNA逆转录为cDNA。RNA 定量是通过qRT-PCR进行的，引物如下：-actin（正义链：5-ATCAGCAAGCAGGAGTAT-3,反义链:5-CA-ATCTCGTCTCGTTTCTG-3)，兔CREB（正义链：5-TCAGCTCCTCAATCAGCGTCT-3,反义链:5-AGTTGTTATGGCTTCCTCCCC-3),兔MMP-9(正义链：5-CCACCACAACATCACGTACTGGA-3，反义链:5-ACTGGATGACAATGTCTGCGTCC-3)，兔MMP-2（正义链：5-CTTCGTGTAGGTGTA-AATGGG-3,反义链:5-TTCCTGGGCAACAAG-TATGAG-3）和兔VEGF（正义链：5-GGTGA-CGTTGAACTCCTCGGT-3，反义链：5-GGAGA-CAATAAACCCCACGAA-3）。q RT-PC R数据的分43210空白组模型组a注：a为高胆固醇饮食喂养10 周后，空白组和模型组体质量比较，b为空白组和模型组血脂浓度比较，c为通过二维超声观察颈动脉斑块的特征，d为空白组和模型组CIMT比较。LDL-C为低密度脂蛋白胆固醇，HDL-C为高密度脂蛋白胆固醇，TG为三酰甘油，TC为血清总胆固醇，CMIT为颈动脉内中膜厚度，n=5，*P 0.0 5:1279:析通过比较2-4ACT方法进行。1.8组织学和免疫组织化学切除新西兰免右侧颈总动脉的组织块，在4%多聚甲醛中固定48 h，嵌入石蜡中，切片用苏木精/伊红(HE)染色。使用的一抗为抗CREB抗体、抗MMP-9、抗MMP-2和抗-VEG-FR抗体,按1：50 0 稀释。二抗为辣根过氧化物酶-山羊抗-兔IgG。二氨基联苯胺用于产生信号。切片用苏木精轻轻复染。1.9统计方法实验数据通过GraphpadPrism6.0软件进行分析，计量资料以均数土标准差表示，两组比较用独立样本t检验和Menn-Whitney检验，多组比较用单因素方差分析和Kruskal-Wallis检验，多重比较用LSD-t和Dunnett检验。P0.05表示差异有统计学意义。2结果2.1建立AS动物模型喂养10 周后，模型组体质量高于空白组（t-12.34,P0.05)，见图1a。模型组TC、H D L-C 和 LDL-C 显著增加,特别是血清TC 和LDL-C浓度与空白组相比分别上调了15和12 倍，见图1b。模型组RCCA中可观擦到斑块回声形成（图1c)，同时，与空白组相比，模型组的颈动脉内中膜厚度（CMIT)显著增加（t-10.19,P0.05），见图1d,证明AS动物模型建立成功。2.24组新西兰兔CREBmRNA水平比较4组CREBmRNA水平差异有统计学意义(F=14.15,P0.05）。其中治疗组 CREBmRNA 水平和表达显著低于模型组和对照组（t=4.88、7.50，均P0.05），见图2。*40吕空白组吕模型组(/louu)302010工0LDL-CHDL-CTGb图1新西兰兔AS模型评估0.6r*0.4*T*0.2*0.0TC空白组模型组Cd:12802.34组新西兰兔hs-CRP、IL-17 A 水平比较4组hs-CRP、I L-17 A 水平差异有统计学意义(F=107.30、73.81,均P0.05)。其中模型组hs-CRP和IL-17A水平高于其他组(t13.51,均P0.05)；治疗组hs-CRP和IL-17A水平低于对照组(t-2.50、7.18,均P0.05),见图3。2.44组新西兰兔VEGF、超声造影峰值强度和杨氏模量值水平比较4组VEGFmRNA差异有统计学意义（F=213.61，P 0.0 5），其中模型组VEGFmRNA水平高于其他组(t13.10,均P0.05)；治疗组VEGFmRNA水平低于对照组（t-28.50，P0.05），见图4a、b。治疗组斑块组织的杨氏模量值明显高于其他两组（t-7.96、4.6 0,均P0.05)，见图4c.d;而治疗组斑块的超声造影峰值强度低于模型组和对照组（t-8.54、5.54，均P0.05），见图4e、f。治疗组VEGF表达阳性细胞数明显低于模型组和对照组，见图4g。2.54组新西兰兔MMP-2、M M P-9 水平比较4组MMP-2和MMP-9的mRNA水平差异有统计学意义（F=93.78、41.6 6，均P0.05），其中模型组MMP-2 和 MMP-9 的 mRNA 水平高于其他组(t6.72，均P0.05)，治疗组MMP-2和MMP-9的mRNA水平低于对照组（t=4.95、4.59，均P0.05），见图5ad。与模型组和对照组相比，定位于细胞质中的 MMP-2和 MMP-9在治疗组中的表达显著降低，见图5e、f。3讨论AS不稳定斑块的形成与以下三个方面密切相关：（1）炎症。炎症是引起斑块不稳定的关键因素，*2.5*2.01.51.00.50.0空白组模型组对照组治疗组ModernPractical Medicine,October2023,Vol.35,No.10斑块破裂及糜烂几乎与炎症共存，在斑块的不稳定状态时炎症总是上调的-1。（2)MMP。斑块纤维帽的主要成分是细胞外基质,MMP是降解细胞外基质最重要的酶类；不稳定斑块的MMP活性增加,纤维帽强度减弱，斑块变得易破裂12-4。（3)新生血管。活化的巨噬细胞可产生VEGF，导致内膜新生血管的形成；新生血管主要分布在斑块的肩部和基底部，成为炎性细胞和脂质成分进入斑块的通路；此外，新生血管发育不完善基底膜不完整，故易于破裂和出血，导致斑块的不稳定。因此寻找能抑制以上三方面的靶点并进行干预来促进斑块的稳定性是本实验的研究基础。CREB是细胞中第二信使的转录因子。Westbom等发现CREB可以上调炎症因子，参与体内的炎症过程。有研究报道，CREB可参与某些病理生理过程中MMP的调节17 。还有研究发现 CREB与VEGF的表达密切相关。这提示CREB可通过调控炎症因子、MMP和VEGF的表达促进斑块的不稳定性。本研究通过建立新西兰兔AS斑块模型并在此基础上进行了CREB-shRNA质粒的转染。结果发现，CREB-shRNA质粒可沉默AS斑块模型血清中炎症因子hs-CRP和IL-17A表达；同时AS斑块中MMP-2、M M P-9 及VEGF的表达也随之下调；超声弹性成像显示斑块的杨氏模量值上升，超声造影显示斑块的造影峰值强度下降。这证实了CREB对斑块不稳定性的促进作用，沉默CREB可增加斑块的稳定性。UTMD治疗性超声已显示出其作为靶向破坏肿瘤脉管系统的巨大潜力。研究较多且具有潜力的策略是用治疗剂加载微泡，在超声治疗区域内靶向破*(u/u)y do-su25CREBGAPDH空白组模型组对照组治疗组*(Iu/d)VLI-TI 600*40020050空白组模型组对照组治疗组空白组模型组对照组治疗组*0a图2 qRT-PCR和Westernblot评估转染效率注：a为通过qRT-PCR检测相对CREBmRNA水平，b为通过Westemblot注：hs-CRP为超敏C反应蛋白,IL-17A为白介素-17 A，*P 0.0 5检测CREB表达。CREB为环磷腺苷效应元件结合蛋白，n=5，*P 0.0 5ba图34组血清hs-CRP和IL-17A水平比较b现代实用医学2 0 2 3年10 月第35卷第10 期128115*1050*VEGF-actin空白组模型组对照组治疗组a50403020100模型组对照组治疗组d空白组模型组对照组治疗组beC25*(%)3050模型组对照组治疗组f空白组注：a为通过qRT-PCR检测相对VEGFmRNA水平，b为通过Westernblot检测VEGF表达，c、d 为通过超声剪切波弹性成像评估斑块的弹性，e、f 为通过超声造影评估斑块内新生血管水平，g为通过免疫组化染色评估斑块内VEGF阳性表达细胞数量（x400)。VEG F为血管内皮生长因子，*P0.05坏微泡时能够局部释放有效载荷。该技术正在探索用于局部基因转染、靶向药物递送和释放、血脑屏障破坏和溶栓等方面。本研究微泡与CREB质粒结合作为靶向治疗的是一种具有潜力且可行性高的新方法。综上所述，用UTMD递送和靶向CREB质粒释放比单纯的CREB质粒转染可以更有效地沉默CREB基因，更能有效降低CREB、VEG F、M M P-2、MMP-9 和炎症因子hs-CRP、IL-17 A 的表达,且拥有更高的杨氏模量值和更低的超声造影峰值强度，达到稳定斑块的目的。利益冲突所有作者声明无利益冲突作者贡献声明邱勤：论文撰写、统计学分析、数据整理；刘旭东：实验操作、数据整理；徐萍：研究指导、论文修改、经费支持模型组图4斑块内新生血管形成情况1KAYIKCIOGLU M,OZKAN H S,YAGMUR B.Premature my-ocardial infarction:A rising threatJJ.Balkan Med J,2022,39(2):83-95.2 FAN J,WATANABE T.Atherosclerosis:Known and unknown.Pathol Int,2022,72(3):151-160.3 CHEN L,JIANG Z,AKAKURU O U,et al.Recent progress in thedetection and treatment of atherosclerosis by nanoparticlesJ.Ma-terials Today Chemistry,2020,17(pt3):100280.4KOTLA S,SINGH N K,HECKLE M R,et al.The transcriptionfactor CREB enhances interleukin-17A production and inflamma-tion in a mouse model of atherosclerosis J.Sci Signal,2013,6(293):ra83.5 LEE DK,PARK E J,KIM E K,et al.Atorvastatin and simvastatin,but not pravastatin,up-regulate LPS-induced MMP-9 expression in对照组g治疗组参考文献2.512823*20空白组模型组对照组治疗组aModern Practical Medicine,October 2023,Vol.35,No.10MMP-2-actin空白组模型组对照组治疗组bMMP-9-actin空白组模型组对照组治疗组C2.01.51.00.50.0空白组模型组对照组治疗组d空白组模型组对照组e治疗组空白组注：a、d 为通过RT-PCR分别检测MMP-2、M M P-9 m RNA 水平;bc为通过Westernblot分别检测MMP-2、M M P-9 表达;e、f 为利用免疫组织化学技术分别对各组中MMP-2、M M P-9 的表达及评估(40 0)。MMP为基质金属蛋白酶，*P0.05macrophages by regulating phosphorylation of ERK and CREB J.Cell Physiol Biochem,2012,30(3):499-511.6WANG X,CUI H,LOU Z,et al.Cyclic AMP responsive element-binding protein induces metastatic renal cell carcinoma by mediat-ing the expression of matrix metallopeptidase-2/9 and proteins as-sociated with epithelial-mesenchymal transition.Mol Med Rep,2017,15(6):4191-4198.7 JEON S H,CHAE B C,KIM H A,et al.The PKA/CREB pathwayis closely involved in VEGF expression in mouse macrophagesJ.Mol Cells,2007,23(1):23-29.8 SHI D,GUOL,SUN X,et al.UTMD inhibit EMT of breast cancerthrough the ROS/miR-200c/ZEB1 axis.Sci Rep,2020,10(1):6657.9SCHWARTZ R S,BAYES-GENIS A,LESSER J R,et al.Detec-ting vulnerable plaque using peripheral blood:inflammatory andcellular markersJ.J Interv Cardiol,2003,16(3):231-242.10 ZHU Y,XIAN X,WANG Z,et al.Research progress on the relati-onship between atherosclerosis and inflammationJ.Biomolecu-les,2018,8(3):80.11 GUSEV E,SARAPULTSEV A.Atherosclerosis and inflammation:Insights from the theory of general pathological processesJ.Int JMol Sci,2023,24(9):7910.12 GALIS Z S,KHATRI J J.Matrix metalloproteinases in vascular re-modeling and atherogenesis:the good,the bad,and the uglyJ.CircRes,2002,90(3):251-262.模型组图5评估斑块内细胞外基质MMP-2和MMP-9的表达2018,165(6):798-802.14 LIU Q,PAN J,BAO L,et al.Major vault protein prevents athero-sclerotic plaque destabilization by suppressing macrophage ASK1-JNK signalingJ.Arterioscler Thromb Vasc Biol,2022,42(5):580-596.15 FANG Y,YANG R,HOU Y,et al.Dual-modality imaging of angi-ogenesis in unstable atherosclerotic plaques with VEGFR2-target-ed upconversion nanoprobes in vivo.Mol Imaging Biol,2022,24(5):721-731.16 WESTBOM C M,SHUKLA A,MACPHERSON M B,et al.CREB-induced inflammation is important for malignant mesothe-lioma growthJ.Am J Pathol,2014,184(10):2816-2827.17 ARIYOSHI W,OKINAGA 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