NY∕T 1185-2018 马流行性感冒诊断技术(农业).pdf

ICS 11.220 B 41 NY 中华人民共和国农业行业标准NY/ T 1185-2018 代替NY/T1185-2006 马流行性感冒诊断技术Diagnostic techniques for equine influenza .1. 2018-03- 15发布2018-06-01实施中华人民共和国农业部发布NY/T 1185-2018 目次前言.n 引言.四1 范围.2 规范性引用文件.3 生物安全措施.1 4 临床诊断.5 实验室诊断.6 综合判定.5 附录A(规范性附录)溶液的配制.6 附录B(规范性附录)抗原和血清的处理.I NY/T 1185-2018 目。昌本标准按照GB/T1. 1一2009给出的规则起草。本标准代替NY/T1185- 2006 (马流行性感冒诊断技术。与NY/ T 1185-2006相比，除编辑性修改外主要技术变化如下:一引言部分更正马流行性感冒为三类动物疫病;一一病毒分离与鉴定部分增加收获尿囊液的过程描述(见5.2.5); 病原分离部分对血凝试验结果判定进行修正(见5.2.7.2);增加了对马流行性感冒病毒核酸鉴定的RT-PCR方法(见5.3); 一增加了马流行性感冒抗体单放射免疫扩散溶血试验(见5.5)。本标准由农业部兽医局提出。本标准由全国动物卫生标准化技术委员会CSAT/TC181)归口。本标准起草单位:中国农业科学院哈尔滨兽医研究所、北京市农林科学院畜牧兽医研究所、中国兽医药品监察所。本标准主要起草人:王晓钧、郭巍、戚亭、林健、毛娅卿、蒋桃珍、杨志远。H NY/T 1185-2018 引马流行性感冒CEquineinfluenza, EI)是由马l型CH7N7亚型)或马2型CH3N8亚型)流行性感冒病毒CEquineinfluenza virus, EIV)引起的传染性极强的急性呼吸系统疾病。自然条件下，只有马属动物易感，包括马、驴、骤，其中马最易感，11负届画革病突然，主要经含有病毒的气溶胶或飞沫传播，疫情发展迅速，可在短时目:3 d，主要症状为发热，流浆液性或版性鼻汁，眼部见泪痕或分温m:，发痛号习甲&显健康。本病死亡率较低，如果继发细菌感染，可引起画如醉班岛棋手阔啕隘国一、二、三类动物疫病病种名录)C中华人度业踹悖二&据理费留隘羁启明建为豆3庭病，是进出口马检疫温rr-H盟军军事垣理理且7rr/、-必检疫病。/、守二点;c/) E NY/T 1185-2018 马流行性感冒诊断技术范围本标准规定了马流行性感冒的临床诊断、病原分离、血凝试验(HA)、H3N8亚型马流感病毒核酸的RT-PCR、血凝抑制试验(HI)、单放射兔画画国也因技术要求。本标准适用于马流行性感冒红，一般5. 1 样品采集与运输5. 1. 1 样晶的采集5. 1. 1. 1 每个发病群至少选择5匹病司再采集样品。5. 1. 1. 2 应在临床症状出现后立即采集深部鼻拭子。取样时须将脱脂棉拭子经前侧鼻道伸入鼻腔深部蘸取呼吸道蒙古液，取出后立即放人盛有1mL2 mL运输培养液(见附录A中的A.l)的青霉素瓶或带盖塑料管中。5. 1. 1. 3 血清应采集双份，间隔10d14 d。5. 1.2 样品的运输与储存鼻拭子样品在20C80C时可保存1d2 d，若要长期保存，则应放置于一700C以下。运送样品时应加冰块或冰袋冷藏运输。血清储存应置于一200C以下。5. 2 病毒分离与鉴定4初增击。物3嗽泌留咳分稽烈日卧F流下列文件对于本件。凡是不注日期GB/ T 6682 GB 19489 规范性引用文件经1周后康复4. 2 重症型患马突然d，发热的同时出期为流浆液多。呼吸加快，有实验室诊断4. 1 2 3 4 5 it111116|ei-fH 1 NY/T 1185-2018 5.2. 1 仪器设备恒温培养箱、孵化器、恒温水浴锅、普通冰箱、超低温冰柜、台式离心机。5. 2. 2 试验材料96孔V型或U型微量反应板、微量移液器、1mL注射器和5mL注射器、长柄棉拭子(20cm以上)、青霉素瓶等。除另有规定外，试剂为分析纯或生化试剂。实验用水应符合GB/T6682的规定。甘油、青霉素、链霉素、丁胶卡那霉素、0.01mol/ L pH为7.2的磷酸盐缓冲液(PBS)(见A.2)、1%鸡红细胞悬液(见A.4)、马流感病毒参考阳性血清和阴性血清、10dll d SPF鸡胚。5.2.3 样晶处理一次仅处理l份样品，从鼻咽拭子中挤出的液体，加入青霉素1000 IU/mL2 000 IU/mL，链霉素1 mg/ mL 2 mg/ mL。以1500g 4.C离心10min，取上清液，经O.22m滤器过滤后用于SPF鸡胚接种。未用完的样品放回一70.C以下冰箱保存。5.2.4 样晶接种将孵化至10dll d的SPF鸡胚气室部位用腆町和酒精消毒后，在壳上打一个孔。每份样品接种3枚鸡胚，每胚尿囊腔接种0.2mL。用石蜡封孔，鸡胚放置34.C35.C孵化器内孵化，丢弃24h内死亡的死胚，继续孵化至72h。5.2.5 收获尿囊液接种后第3d，将鸡胚转到2.C8.C冰箱中放置4h或过夜。取出后，先将蛋壳表面消毒，用慑子敲碎并剥离气室蛋壳，然后挑破壳膜和绒尿膜，用注射器收获尿囊液，用1%的红细胞悬液检测尿囊液是否具有血凝活性(见5.2.7)。每胚收获的尿囊液要分开冷冻保存。5. 2. 6 种毒选择与保存为避免缺陷型的病毒粒子产生干扰，要将接种物先作10倍、100倍、1000倍稀释再接种，选择最高稀释度HA(见5.2. 7)呈阳性的样品培养物作为种毒，保存在一70.C以下的冰箱中。5. 2. 7 血凝试验(HA)5.2.7. 1 操作程序5.2.7. 1.1 在反应板每行各孔中加25LPBS。5. 2. 7. 1. 2 第一孔中加25L病毒分离液，按照1: 2稀释，最后一孔不加抗原作阴性对照。5.2. 7. 1. 3 每孔中再加25LPBS。5.2.7.1.4 每孔加50L1%红细胞液，(22:f:2).C条件下作用30min。5. 2. 7. 2 结果判定5. 2. 7. 2. 1 HA效价判定标准当红细胞发生凝集反应时，其均匀分布在反应板底部，将血凝板倾斜45。保持20s30 s，红细胞不下滑;红细胞未出现凝集时，反应板倾斜后，可见沉淀的红细胞向下滑动，形成流线或泪滴状。HA效价为全部红细胞出现凝集时的最高稀释倍数。5.2.7.2.2 样晶无血凝活性(HA阴性)红细胞没有出现凝集时，则需将各样品尿囊液收集在-起，再经鸡胚盲传，当传至第3代仍未出现血凝活性，判定为马流感病毒阴性。5.2.7.2.3 样品有血凝活性(HA阳性)将所有血凝试验HA阳性样品作小量等份(每份1mL)分装在5mL青霉素瓶内，并取其中1份测定HA效价，一70.C以下冰箱内保存。有血凝活性(HA阳性)，但效价较低时，要继续传代，共盲传3代。5.2.7.3 病原分离结果判定NY/T 1185一2018HA效价阴性，判定为马流感病毒分离阴性;HA效价阳性，判定为马流感病毒分离阳性，同时要用马流感病毒H3N8亚型和H7N7亚型作为参考阳性血清，通过HI试验(见5.的对病毒样品进行亚型鉴定。5.3 H3N8亚型马流感病毒RT-PCR5. 3. 1 仪器设备PCR仪、微量移液器、电泳仪、水平电泳槽、凝胶成像系统。5.3.2 试剂与材料市售病毒RNA提取试剂盒、反转录试剂盒和PCR试剂盒;TRlzol试剂、三氯甲烧、异丙醇、DEPC处理水、琼脂糖。可以采用引物HF/HR+M盯MR用于H3N8亚型马流感病毒核酸的检测，详见表1。表1用于H3N8亚型马流感病毒RT-PCR检测的引物引物目的靶基因序列(53) 产物，bpHF 正向引物HA基因AA T TCA TCA CCC GAG TTC AA 595 HR 反向引物HA基因1寸TCAT TAA TCT GGT CGA TGG C MF 正向引物M基因ACT GTG ACA ACC GAA GTG 227 MR 反向引物M基因TGCCTGGCC丁寸ACTAGC5.3.3 样晶处理将拭子充分捻动、挤干后，取100L样品液至一新的离心管中，进行RNA提取。5. 3. 4 病毒RNA的提取使用市售病毒RNA提取试剂盒提取病毒RNA。也可使用1mL TRlzol试剂处理的样品液，10000 g ,4 oC离心10min，取上清液，静置5min。加200L三氯甲烧，振荡混匀15s，静置2min3mino10000g，40C离心15min，取上层水相至新的离心管中，加400L异丙醇，混匀，静置10min,10 000 gAOC离心10min，弃上清液。加入75%乙醇1mL，混匀，10000gAOC离心5min，去上清液。再加人75%乙醇1mL，混匀，10 000 g, 40C离心5min，去上清液。干燥RNA沉淀后，加入100LDEPC处理过的水溶解。提取的RNA立即进行RT-PCR反应或一700C保存。5.3.5 RT-PCR反应使用市售合格反转录试剂盒进行反转录。使用市售合格PCR试剂盒进行PCR。将4种引物配制成10mol/L的使用液，按照PCR试剂盒的要求添加到反应体系中。PCR反应条件为940C预变性2min，之后940C变性30s,53. 60C退火40s, 720C延伸40s, 30个循环，720C延伸10min后，反应结束。取PCR产物5L，在1.5%琼脂糖凝胶中进行电泳，在凝胶成像系统中观察结果。5. 3. 6 结果判定参考阳性病毒扩增出595bp和227bp大小的两条片段，待检样品若得到相同条带，则判定为H3N8亚型马流感病毒核酸阳性，只有一条227bp片段则判定为疑似马流感病毒核酸阳性。在无法分离病毒的实验条件下，可以采用该方法直接检测鼻腔分泌物中的病毒核酸。该方法能快速提供诊断结果，但不能替代病毒分离鉴定。在样品数量较多时，有助于为病毒分离初步筛选样品。5. 4 血清学试验-血凝抑制试验(HI)5.4. 1 仪器设备离心机、水浴锅、微量移液器、振荡器等。5. 4. 2 试验材料96孔V型或U型微量反应板、吐温80、乙醋、过腆酸饵、甘油、O.01 mol/ L pH为7.2的磷酸盐缓冲液CPBS)C见A.2)、1%鸡红细胞悬液(见A.的、马流感灭活抗原(见附录B中的B.l)、马流感病毒参NY/T 1185-2018 考阳性血清和阴性血清o待检血清应进行预处理，稀释浓度为1: 4，处理方法见附录B.20 5. 4. 3 操作程序5.4.3. 1 在进行本试验前，先进行抗原(见旦1)的HA效价检测，方法见5.2. 7。5. 4. 3. 2 稀释抗原，使含量为4个HA单位(4XHA最小凝集量)。5.4.3.3 加25LPBS于96孔U型或V型微量反应板各孔中。5. 4. 3. 4 加25L经处理的血清于第I;fJ.d;i.温aJlil25L加到第2孔中，依次倍比稀释，从第2孔加至第11孔，第11孔混匀后5. 4. 3. 5 5.4.3.6 每孔加505. 4. 3. 7将抑制凝集1%琼脂糖(5.5. 1.2 马5.5. 1.3 绵羊红采集3只绵羊涤3次，每次洗涤后胞(V/V压积细胞)。5.5. 1.4 补体豚鼠新鲜血清或冻干血清。5.5. 1.5 血清马流感H3亚型阴、阳性参考血清，待检血清采自马属动物。5.5.1.6 SRH反应板5.5.2 操作程序5.5.2. 1 血清处理血清560C灭活30min，避免反复冻融。5.5.2.2 绵羊红细胞洗涤，记录为抗体阳性。完全，第二份血清在以上时，表明近A(见A.8)、，用盐水/HEPES洗盐水/HEPES配制成8%红细5.5.2.2. 1 用盐水/HEPES洗涤绵羊红细胞，至少3次。第1次500g，离心5min;第2次、第3次洗4 NY/T 1185-2018 涤后离心500g，离心10min 5. 5. 2. 2. 2 根据血清检测数量，计算需要反应板的数量。准备合适体F积、的8%红细胞(V/V压和积、细胞)，用盐y水-K/HEPES配制。每块免疫板需要0.3mL红细胞，另外余出1mL2mL。5. 5. 2. 3 病毒/抗原的预测定准备3块板，分别加0.6mL、1.2 mL、1.8 mL的病毒至2mL的红细胞中，分别加人1.3 mL、1. 6mL、1.9 mL的CrCb，用PBSA重悬至2mL。按步骤5.5. 2. 4、5.5.2.5进行。抗原的最适用量是与参考阳性血清作用出现最大、最清晰溶血圈的抗原量。5. 5. 2. 4 红细胞致敏5.5.2.4. 1 使用15mL离心管处理红细胞，根据红细胞用量，每管加人2mL 8%的红细胞，加人预先确定好的病毒抗原量，摇匀，40C孵育10min，应可以看到凝集。设置不致敏红细胞，即不加病毒的红细胞用于制备空白对照板(其余处理方法均相同)。5. 5. 2. 4. 2 缓慢加人病毒/红细胞悬液半数体积的crCb溶液，(22士2)OC条件下孵育5 IIn，不时摇动。5.5.2.4.3 1 500 r/min离心5min，沉淀致敏的红细胞，弃上清液。5.5.2.4.5 尽量吸干上清液体，注意不要吸出红细胞，重悬红细胞于2mL PBS A中，此时红细胞浓度为8%。5.5.2.5 制板及加样测定5.5.2.5. 1 致敏过程中，微波炉熔解琼脂糖，中高火加热至沸腾，反复沸腾2次充分熔解琼脂糖。放置于420C水浴锅中保持温度。用前检查琼脂的温度是否已经降到420C。此过程操作人员应仔细观察，防止沸腾后溢出。5.5.2.5.2 冻干补体用无菌0.85%NaCl复原。5.5.2.5.3 吸取7.8mL琼脂糖于合适容器中，加人0.9mL致敏的红细胞，0.3mL补体，迅速搅拌均匀。注意:动作要轻柔，不要产生气泡。快速倒人免疫板(置于水平桌上)，不加盖在空气中干燥降温5 min，至琼脂糖完全凝固。5.5.2.5.4 反应板加盖，置于湿盒中，40C存放，直至使用。准备的板可存放数周，但保存时间越长，溶血圈清晰度越差。5.5.2.5.5 空白对照板:使用不加病毒致敏的红细胞制备的反应板。5.5.2.5.6 在凝胶上打3mm直径的孔。5.5.2.5.7 吸取10L热灭活的待检血清和参考阳性、阴性血清加入到合适的孔中，每块反应板上均应有参考阳性血清和阴性血清，340C，湿盒中孵育20ho 5.5.2.5.8 测量溶血圈直径。5. 5. 3 结果判定5.5.3. 1 有效结果:参考阳性血清的结果和预期结果一致，即参考阳性血清的溶血圈清晰，直径参考值相差不超过5%。阴性对照血清元溶血圈，空白对照板上血清无溶血圈。空白对照板上呈现溶血圈的血清应该用绵羊红细胞吸附处理后重新检测。5.5.3.2 符合5.5.3.1时，可测量溶血圈直径，直径大于等于5mrn时判血清为阳性。5. 5. 3. 3 用于诊断目的时，急性发作期和恢复期的血清应在同一板上测定双份。恢复期血清的溶血圈直径与急性发作期相比有明显的升高，可判定马感染马流感病毒或有近期感染。6 综合判定符合4临床诊断所述，可初步判定为马流行性感冒。符合5.2. 7. 3或5.3. 6病原检测阳性，则判定为马流行性感冒;或符合5.4.4或5.5.3血清学阳性，也判定为马流行性感冒。5 NY/T 1185-2018 附录A(规范性附录)溶液的配制葡拧棱拧棱酸氯化铀(双蒸馆水将上列试剂4.C8.C备用。2，121.C高压灭PA 的油液f博mKM丁nuMmA哇,KMWO 固有用含备1存A保15 min，冷却后保存于无菌SPF公鸡血液与1使用前吸取红细胞悬液置于离心管中，加八T冒节惊:57X，每次约以3000r/min离心5min，将血浆、白细胞等充分洗去，沉积的红细胞用PBS稀释成1%的悬液，保存于4.C8.C冰箱中备用。A.5 盐水/HEPES氯化铀CNaCl)4-起乙基嗦乙磺酸CHEPES)4.25 g 5.95 g 叠氮化铀CNaN3)0.1 g 双蒸馆水加至500mL 将上列试剂按次序加人定量容器中，混匀后，充分溶解，用1mol/L NaOH调节pH至6.5，室温保存。NY/T 1185-2018 A.6 盐水/HEPES/BSA用盐水/HEPESCA. 5)制备含0.2%CW/V)牛血清白蛋白CBSA)的溶液。A.7 氯化锚母液(2.2moI/L) 6g氯化锚CCrCb)溶解于10mL蒸馆水中;每次使用时，用0.85%的NaC1C4.25 g/ 500 mL)配制成1/400的工作液，现用现配。A. 8 PBS A 氯化铀CNaCl)o. 25 g 磷酸二氢铀CNaHzP04 ) 1. 45 g 叠氮化铀CNaN3)o. 20 g 双蒸馆水加至1L将上列试剂按次序加人定量容器中，混匀后，充分溶解，室温保存。A.9 1%琼脂糖1 g琼脂糖加至100mL PBSACA.的中，加热溶解。7 NY/ T 1185-2018 B. 1 吐温-80/乙酷处理马流感病毒抗原附录B(规范性附录)抗原和血清的处理B. 1. 1 对于全病毒要进行灭活处理，向40mL病毒液中加0.5mL含10%(V/V)吐温-80的PBS，使吐温-80终浓度为O.125 % (V /V)。B. 1.2 室温下轻轻摇动混合5min后，加20mL乙酷使终浓度为33.3%(V/V) ，充分混匀后置于40C中作用15min。B. 1.3 静置分层，将液相层(含裂解的病毒粒子)移人玻璃瓶中，松开盖子，过夜，在通风橱中挥发残留乙酷。B. 2 待检血清样晶预处理B. 2. 1 在1体积050L)血清中加2体积(300L)新配制的0.016mol/L过腆酸梆(380mg/ 100 mL PBS，需加热溶解，出现沉淀则不能继续使用)，混匀，置于(22+2)OC中作用15min。B. 2. 2 再加1体积050L)的3%甘油PBS中和过剩的过腆酸饵液，混合后置于(22+2)OC中作用15 min B. 2. 3 在560C水浴中灭活30min。血清稀释度为1:4。8 goN|的=H问Z中华人民共和国农业行业标准马流行性感冒诊断技术/1l 1185-2018 * 中国农业出版社出版(北京市朝阳区麦子店街18号楼)(邮政编码:100125网址:.ccap. corn. cn) 北京印刷一厂印刷新华书店北京发行所发行各地新华书店经销争等争等长印张1字数20千字2018年5月北京第1次印刷关开本880rnrnX1230rnrn 1/16 2018年5月第1版书号16109 4499 定价24.00元争等版权专有侵权必究举报电话[phone]