颅脑损伤促进的坐骨神经再生.doc

www.CRTER.org

何新泽，等. 颅脑损伤促进的坐骨神经再生

颅脑损伤促进的坐骨神经再生

何新泽1，王 维2，马建军3，呼铁民4，于昌玉1，高云峰1，程兴龙4，王 培1(承德医学院附属医院，1手足外科，4神经外科，河北省承德市 067000；2秦皇岛市第一医院手足外科，河北省秦皇岛市 066308；3承德医学院研究生学院，河北省承德市 067000)

引用本文：何新泽，王维，马建军，呼铁民，于昌玉，高云峰，程兴龙，王培. 颅脑损伤促进的坐骨神经再生[J].中国组织工程研究，2016，20(27): 4061-4067.
DOI: 10.3969/j.issn.2095-4344.2016.27.016 ORCID: 0000-0001-9445-3745(何新泽)

文章快速阅读：
颅脑损伤促进坐骨神经再生的实验

何新泽，男，1985年生，山东省滨州市人，汉族，在读硕士，主治医师，主要从事骨外科、神经损伤与修复的研究。

通讯作者：王培，硕士，教授，硕士生导师，承德医学院附属医院手足外科，河北省承德市
067000

中图分类号:R318
文献标识码:B
文章编号:2095-4344
(2016)27-04061-07
稿件接受：2016-04-04

对照组30只

脑Feeney损伤+坐骨神经SunderlandV损伤模型

坐骨神经SunderlandV损伤模型

检测指标：
坐骨神经指数；
Masson染色结果；
NF200免疫荧光化学染色结果；
透射电镜观察
实验组30只
雄性SD大鼠60只，随机分为2组

文题释义：
周围神经：除中枢神经(脑和脊髓)以外的所有神经，包括神经节、神经干、神经丛及神经终末装置；周围神经可根据连于中枢的部位不同分为连于脑的12对脑神经和连于脊髓的31对脊神经。
Wallerian变性：损伤周围神经远端轴突24-48 h后从创伤部位到运动或感觉受体一段距离的区域，发生远端轴突和周围髓鞘崩解，许旺细胞肿胀聚集形成神经内膜管，近侧轴突也发生逆向变性至随后轴索再生长的部位的相邻一两个郎飞节点。

摘要
背景：研究表明大鼠颅脑损伤对坐骨神经损伤的修复有促进作用，然而其具体机制尚不明确。
目的：于形态学和组织学进一步探索颅脑损伤对坐骨神经损伤修复的作用机制。
方法：选用SPF级健康雄性SD大鼠60只，随机分为2组，颅脑损伤合并坐骨神经损伤模型为实验组，单纯坐骨神经损伤模型为对照组。采用经典Feeney法颅脑损伤模型和SunderlandV型坐骨神经损伤模型。于造模后8，12周检测大鼠坐骨神经指数；行坐骨神经吻合处神经组织Masson染色、NF200免疫荧光化学染色观察神经再生情况；采用透射电镜观察再生轴突数。
结果与结论：造模后8，12周，与对照组相比，实验组大鼠步态、坐骨神经指数恢复更好。实验组大鼠Masson染色显示神经外膜胶原纤维增生较少、轴突排列整齐。NF200免疫荧光染色显示实验组再生神经密度高、排列规律。透射电镜显示实验组再生轴突排列整齐、胶原瘢痕增生较少、髓鞘板层分布整齐、规则。结果提示大鼠颅脑损伤可能通过减少神经断端胶原瘢痕形成促进周围神经损伤的修复。
关键词：
实验动物；神经损伤与修复动物模型；颅脑损伤；周围神经；神经修复；神经再生；瘢痕
主题词：
脑损伤；周围神经；神经再生；瘢痕；组织工程
基金资助：
河北省卫生厅指令性课题(20130027)；河北省科技厅指令性课题(142777105D)；河北省承德市科技局课题(20123128)

3
P.O.Box 1200,Shenyang 110004 kf23385083@
Craniocerebral injury promotes sciatic nerve regeneration

He Xin-ze1, Wang Wei2, Ma Jian-jun3, Hu Tie-min4, Yu Chang-yu1, Gao Yun-feng1, Cheng Xing-long4, Wang Pei1 (1Department of Hand and Foot Surgery, 4Department of Neurosurgery, Affiliated Hospital of Chengde Medical University, Chengde 067000, Hebei Province, China; 2Department of Hand and Foot Surgery, First Hospital of Qinhuangdao, Qinhuangdao 066308, Hebei Province, China; 3Graduate School, Chengde Medical University, Chengde 067000, Hebei Province, China)

Abstract
BACKGROUND: Studies have shown that craniocerebral injury can promote the repair of sciatic nerve injury in rats, but its precise mechanism remains unclear.
OBJECTIVE: To further explore the action mechanism of craniocerebral injury on the repair of sciatic nerve injury using morphology and histology.
METHODS: Sixty specific-pathogen-free healthy male Sprague-Dawley rats were randomly divided into two groups. Rats with craniocerebral injury and sciatic nerve injury were considered as the experimental group. Rats with simple sciatic nerve injury were considered as the control group. Classical Feeney method was used in models of craniocerebral injury and SunderlandV sciatic nerve injury. At 8 and 12 weeks after modeling, sciatic nerve index was detected. Masson staining and NF200 immunofluorescence staining were used to observe the nerve regeneration at the anstomotic site. Transmission electron microscope was used to observe the number of regenerative axons.
RESULTS AND CONCLUSION: At 8 and 12 weeks after modeling, compared with the control group, gait and sciatic nerve index recovered better in the experimental group. In the experimental group, Masson staining showed fewer nerve membrane collagen fibers, and the axon arranged neatly. NF200 immunohistochemistry showed that in the experimental group, the density of regenerated nerves was high, and nerves were regularly distributed. Transmission electron microscopy showed that in the experimental group, regenerative axons were regularly arranged, collagen scar was less, and myelin layer arranged regularly. Results suggested that the craniocerebral injury in rats may promote the repair of peripheral nerve injury by reducing scar collagen in nerve endings.
Subject headings: Brain Injuries; Peripheral Nerves; Nerve Regeneration; Cicatrix; Tissue Engineering
Funding: the Mandatory Subject of Hebei Province Health Department, No. 20130027; the Mandatory Subject of Hebei Province Science and Technology Department, No. 142777105D; a grant from Chengde Municipal Science and Technology Bureau of Hebei Province, No. 20123128

Cite this article: He XZ, Wang W, Ma JJ, Hu TM, Yu CY, Gao YF, Cheng XL, Wang P. Craniocerebral injury promotes sciatic nerve regeneration. Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu. 2016;20(27): 4061-4067.
He Xin-ze, Studying for master’s degree, Attending physician, Department of Hand and Foot Surgery, Affiliated Hospital of Chengde Medical University, Chengde 067000, Hebei Province, China

Corresponding author: Wang Pei, Master, Professor, Master’s supervisor, Department of Hand and Foot Surgery, Affiliated Hospital of Chengde Medical University, Chengde 067000, Hebei Province, China

4065
ISSN 2095-4344 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAH
0 引言 Introduction
颅脑损伤对骨折愈合有促进作用，关于颅脑损伤与骨折愈合之间联系的研究也有50多年[1-3]。相关研究表明，颅脑损伤后体内的细胞因子、神经肽及神经营养因子、体液因素、机械因素发生改变[4-5]，促进了骨折的愈合。这些变化是否会影响其他组织的修复与再生，罕见相关报道。
周围神经损伤临床并不少见，虽然较少危及生命，但是致残率较高，导致生活水平降低。对于周围神经修复再生的机制以及影响因素，近年来有较多研究。有研究认为，神经营养因子能够促进神经的修复与再生[6-10]。那么颅脑损伤后变化的神经营养因子是否会对坐骨神经的修复与再生产生影响，本课题组在早期的研究中发现颅脑损伤后大鼠坐骨神经愈合较好，并于2014年将这一研究成果发表[11]，但是仅基于神经功能恢复的大体观察，此次实验旨在于形态学、组织学上作进一步补充，并试图探索其机制是否与减少断端纤维瘢痕形成有关。

1 材料和方法 Materials and methods
1.1 造模动物及材料 实验在2014年10月至2015年2月在承德医学院附属医院完成。
实验动物：选用SPF级健康雄性SD大鼠60只，鼠龄8周，体质量200-220 g，均购自北京维通利华实验动物技术有限公司(许可证号：SCXK(京)2012-0001)。饲养在12 h昼夜节律下，实验室温度维持在(23±2) ℃。将大鼠完全随机等分为实验组和对照组，每组30只。
主要试剂及设备：手外科显微镜(ZC-X-6A型，购于镇江市卓创医疗科技有限公司)，光学显微镜(BH-3型，购于日本Olympus公司)，透射电子显微镜(H-7500，购于日本日立公司)，显微外科手术器械(购于宁波市显微器械公司)，9-0无菌医用非吸收性缝合线无损伤缝合针(杭州富阳医用缝合针线厂)，Masson三色染色试剂盒(标准型，江苏KeyGEN生物技术有限公司购进)，NF200(购于Raybiotect公司)。
1.2 造模方法
1.2.1 制作颅脑损伤合并坐骨神经损伤模型 麻醉方式均采用腹腔注射麻醉(体积分数10%水合氯醛，3.5 mL/kg)；麻醉起效后，实验组大鼠用绳索固定头部、左下肢，备皮，消毒，铺盖无菌巾，沿头部矢状切开头皮，暴露顶骨，在冠状线后1.5 mm、中线偏右5 mm处用牙科钻钻取直径5 mm的骨窗，保持硬脑膜完整，根据Feeney法[12]：用20 g击锤沿外周导管从30 cm高处自由坠落冲击撞杆，造成中度脑挫裂伤，用骨蜡封闭骨窗，缝合头皮；同时于大鼠左侧臀部，纵行切开皮肤，钝性分离股二头肌，显露坐骨神经，选取梨状肌下孔下方 1 cm，于手外科显微镜下完全切断，应用9-0无损伤线采用外膜缝合法缝合坐骨神经，缝合肌膜、皮肤。对照组大鼠仅于手外科显微镜下完全切断左侧坐骨神经，应用9-0无损伤线采用外膜缝合法缝合坐骨神经。均预防性应用头孢唑啉钠100 mg/kg肌注1次，预防感染。2组大鼠同样环境中分笼饲养。
1.2.2 造模成功的检测标准 造模后所有动物均存活，无伤口感染情况。造模后大鼠左下肢均主动屈曲活动受限，左足屈趾、足畸形，行走时足跟着地。
1.3 主要观察指标
1.3.1 坐骨神经指数的测量 分别于造模后4，8，12周，每组每次随机取10只大鼠。根据Schiaveto等[13]的方法自制暗箱、测量参数，选实验侧足(S)、正常侧足(Z)，测量足印的3个参数：①足印长度(PL)：足印的最长距离，即从足跟到足尖；②足趾宽度(TS)：第1趾到第5趾的连线距离；③中间足趾距离(IT)：第2-4趾的连线距离。实验侧足3个参数分别为：实验侧足印长度(SPL)、实验侧足趾宽度(STS)、实验侧中间足趾距离(SIT)；正常侧足3个参数分别为正常侧足印长度(ZPL)、正常侧足趾宽度(ZTS)、正常侧中间足趾距离(ZIT)。
神经功能指数=-38.3×(SPL-ZPL)/ZPL+109.5× (STS-ZTS)/ZTS+13.2×(SIT-ZIT)/ZIT-8.8
以神经功能指数值0时为正常，-100时为神经完全断离。
1.3.2 Masson染色 分别于造模后8周和12周取材，每组每次随机取5只大鼠，过量麻醉处死后，取神经吻合口两端各0.5 cm，用体积分数10%甲醛固定24 h，乙醇梯度脱水，常规石蜡包埋，纵行切片厚度3-5 μm，染色方法参考说明书，封固，光学显微镜下观察神经外膜胶原纤维增生情况。
1.3.3 免疫荧光染色 分别于造模后8周和12周取材，进行坐骨神经吻合处神经免疫荧光染色，观察轴突再生相关神经丝蛋白200(NF200)的表达。NF200阳性标准为神经节细胞、神经纤维细胞胞质内见金黄色颗粒。
1.3.4 透射电镜观察 分别于造模后8周和12周取材，每组每次随机取5只大鼠，过量麻醉，灌注后取材以神经吻合口为中心修剪成2 mm×1 mm×1 mm组织块，浸入3%戊二醛中固定2 h，0.1 mol磷酸缓冲液冲洗3次，10 min/次。再经1%锇酸固定，丙酮梯度脱水，618环氧树脂包埋，超薄切片机切片，经醋酸铀和枸橼酸铅双染色后，透射电镜进行观察新生髓鞘超微结构，对比髓鞘厚度及层次，各细胞结构细胞器形态及轴突再生数量。
1.4 统计学分析 采用SPSS 17.0进行统计学分析，数据以x(_)±s表示，组间比较采用两样本t 检验，以P < 0.05为差异有显著性意义。

2 结果 Results
2.1 实验动物数量分析 实验选用大鼠60只，分为2组，实验过程无脱失，全部进入结果分析。
2.2 模型创新性/材料、方法的改进 根据Feeney法[12] 20 g击锤沿外周导管(导管隔5 mm开窗)从30 cm高处自由坠落冲击撞杆，造成中度脑挫裂伤；在10倍手外科显微镜下完全切断坐骨神经，造成SunderlandV型坐骨神经损伤。
2.3 模型的稳定性 脑损伤位置在冠状线后1.5 mm、中线偏右5 mm处，用20 g击锤沿外周导管从30 cm高处自由坠落的强度冲击撞杆，位置准确，打击强度相同；在10倍手外科显微镜下完全切断坐骨神经，应用9-0无损伤线采用外膜缝合法缝合坐骨神经，造成Sunderland V型坐骨神经损伤，损伤程度确切，神经吻合均有同一术者完成，模型稳定。
2.4 颅脑损伤对坐骨神经损伤大鼠大体状态的影响 造模后所有动物均存活，未发现切口感染情况。造模后实验组大鼠活动减少、食欲差，1周后逐渐恢复。两组大鼠左下肢均主动屈曲活动受限，左足屈趾、足畸形，行走时足跟着地，未见自食现象；造模后4周内，两组大鼠左足出现红肿、顽固性溃疡。造模后6周，实验组大鼠左足部溃疡面收缩，开始好转；对照组大鼠左足部溃疡未见明显好转；8周时，实验组大鼠左足部溃疡瘢

8周实验组
12周实验组
8周对照组
12周对照组

图1 两组大鼠造模后8，12周坐骨神经吻合处神经组织Masson染色(×200)
Figure 1 Masson staining of sciatic nerve at 8 and 12 weeks after modeling in rats of both groups at the anstomotic site (×200)
图注：造模后8周，实验组可见再生的神经纤维较多，胶原纤维少，排列欠整齐；对照组再生神经纤维较少，胶原纤维增生多。造模后12周，与对照组相比，可见实验组神经纤维与胶原纤维均匀增生，胶原纤维随神经纤维呈波浪状走形。

12周对照组
8周对照组
图2 两组大鼠造模后8，12周坐骨神经吻合处神经切片NF-200免疫荧光观察(×200)
Figure 2 NF-200 immunofluorescence of nerve sections at the anstomotic site at 8 and 12 weeks after modeling in rats of both groups (×200)
图注：造模后8周，实验组可见大量NF200阳性颗粒、再生的神经纤维密度较大、排列规整，对照组阳性颗粒少，再生纤维少、排列紊乱；造模后12周，与对照组相比，实验组NF200阳性颗粒密度均匀、再生神经纤维排列规整。

12周实验组
8周实验组

12周对照组
8周对照组
12周实验组

8周实验组

图3 两组大鼠造模后8，12周神经吻合口中段新生神经纤维透射电镜观察(×7 500)
Figure 3 Transmission electron microscope of newly born nerve fibers in the middle segment of the anstomotic site at 8 and 12 weeks after modeling in rats of both groups (×7 500)
图注：造模后8周，对照组再生纤维的髓板排列紊乱，可见明显髓鞘变形、脱髓鞘现象，轴突再生数量明显少于实验组，胶原纤维较多；造模后12周，与对照组相比，实验组再生纤维的髓鞘排列整齐，再生神经纤维数量较多，细胞器形态恢复较好，组织间胶原纤维含量少。

痕愈合，对照组大鼠左足部溃疡开始缩小。12周时，2组大鼠左足部溃疡均基本痊愈。取材前观察吻合口周围，缝线无脱落，未见明显神经瘤形成。
2.5 大鼠坐骨神经功能指数 暗箱测试结果显示，造模后第4周，2组大鼠神经功能指数接近(P > 0.05)；从第4周实验组大鼠神经功能指数开始降低，随时间的延长降低的幅度减缓，第8，12周时，实验组大鼠神经功能指数均低于对照组(P < 0.01，表1)。
2.6 Masson三色法染色 神经组织切片Masson胶原纤维特殊染色后，在光镜下胶原纤维染成绿色，神经纤维呈红色，细胞核呈蓝黑色。在正常神经组织中，胶原纤维均匀分布在神经外膜、束膜、内膜，并呈波浪形随神经纤维排列。周围神经损伤后，胶原纤维在吻合口处明显增生。造模后8周，镜下可见对照组在吻合口处胶原纤维增生明显多于实验组。神经纤维稀少，且排列紊乱，神经纤维走行失去波浪状结构(图1)。造模后12周实验组可见神将纤维增生明显，胶原纤维较少，对照组胶原纤维增生明显多于实验组，神将纤维增生较实验组少，且被大量胶原纤维阻隔；造模后12周实验组神经纤维与胶原纤维均匀再生，胶原纤维随神经纤维呈波浪状走形，对照组神经纤维与胶原纤维增生欠均匀，走形欠规整。
2.7 轴突再生相关神经丝蛋白200(NF200)表达 免疫组织化学NF200阳性标准为神经节细胞、神经纤维细胞胞质内见金黄色颗粒。坐骨神经冰冻切片免疫荧光观察 (图2)。结果显示，实验组与对照组造模后8，12周各组标本中均见NF200阳性颗粒。实验组术后8周NF200

表1 颅脑损伤对周围神经损伤大鼠坐骨神经功能指数的影响 (x(_)±s，n=10，%)
Table 1 Effects of craniocerebral injury on sciatic nerve index in rats with peripheral nerve injury
表2 两组大鼠造模后8，12周再生轴突数 (x(_)±s，n=5)
Table 2 Number of regenerative axons at 8 and 12 weeks after modeling in rats of both groups

组别
再生轴突数
8周
12周
实验组
19.00±0.45
59.00±0.45a
对照组
11.00±0.37
37.00±0.55

组别
4周
8周
12周
实验组
-70.21±1.45
-50.32±2.34a
-20.56±2.43a
对照组
-71.16±1.37
-60.42±1.88
-27.27±2.71

表注：与对照组比较，aP < 0.01。

表注：与对照组比，aP < 0.05。

阳性颗粒数目明显多于对照组、再生神经纤维排列规则；造模后12周，NF200阳性颗粒数目明显较对照组减少，阳性颗粒密度均匀，神经再生纤维排列整齐、规律。实验组在再生神经的密度、排列规整程度等方面均要优于对照组，表明实验组损伤的神经得到了更快、更好的修复和再生，神经纤维再生的质量较高。
2.8 透射电镜观察 周围神经损伤后，神经功能的恢复涉及神经元胞体、轴突及末梢效应器，轴突的再生能直接反映损伤处神经的修复程度，因此本研究直接计数再生轴突数目，评价神经纤维再生的情况(表2)。颅脑损伤后轴突再生数目明显多于对照组。
再生神经超微结构正常神经以有髓纤维为主，髓鞘及轴突多近似圆形；髓鞘厚度均匀，板层清晰；轴突充满整个髓鞘，微丝、微管丰富，线粒体无水肿；许旺细胞形态饱满，核清晰，细胞器丰富。造模后8，12周两组均有不同数量的有髓神经纤维再生，造模后12周有髓神经纤维数量较8周明显增多，结构更清晰，层次更分明，神经纤维排列整齐，髓鞘板层厚。造模后8周实验组神经纤维排列整齐，有髓神经纤维界限较清楚，细胞器形态正常，新生髓鞘板层均匀、整齐，组织间胶原纤维较少；对照组神经轴索杂乱排列，新生髓鞘板层薄，有髓鞘变形及脱髓鞘表现，胶原纤维含量较多。造模后12周实验组较对照组新生髓板板层排列均匀，组织间胶原纤维含量少，造模后8，12周实验组再生的有髓纤维数量、结构层次清晰度、髓鞘排列情况以及细胞器恢复情况均好于对照组，组织间胶原纤维含量少于对照组(图3)。

3 讨论 Discussion
实验中脑损伤模型的建立：根据经典的Feeney法20 g击锤沿外周导管(导管隔5 mm开窗)从30 cm高处自由坠落冲击撞杆，造成中度脑挫裂伤[12]；坐骨神经损伤模型的建立：在10倍手外科显微镜下完全切断坐骨神经，造成SunderlandV型坐骨神经损伤，造模方法规范，为国内外认证的经典方法。脑损伤位置在冠状线后1.5 mm、中线偏右5 mm处，用20 g击锤沿外周导管从30 cm高处自由坠落的强度冲击撞杆，位置准确，打击强度相同；在10倍手外科显微镜下完全切断坐骨神经，应用9-0无损伤线采用外膜缝合法缝合坐骨神经，造成SunderlandV型坐骨神经损伤，损伤程度确切，神经吻合均有同一术者完成，模型稳定。模型更接近人类疾病模式，具有转化医学意义。
近年来，随着对颅脑损伤后促进骨折愈合的研究不断深入，颅脑损伤后体液中的多种细胞因子的含量发生明显改变，其中脑源性神经生长因子、脑源性神经营养因子的表达增加，研究证实多种神经营养因子、神经生长因子等能够加速周围神经损伤后的功能恢复和结构再生修复[1-5]。2014年，Wang等[11]报道了通过建立实验颅脑损伤合并坐骨神经损伤动物模型，证实了大鼠颅脑损伤对损伤后坐骨神经功能及组织学恢复有明显促进作用。
周围神经损伤后，神经损伤处发生轴突的变性，远端轴突发生顺向变性，近端轴突逆向变性到临近的神经节点，同时神经血液屏障破坏，大量成纤维细胞、巨噬细胞到达神经损伤处。近端神经细胞形成的轴芽向远端延伸，在神经损伤处遇到成纤维细胞分泌形成的胶原纤维发生接触抑制，停止向远端继续生长，靶器官失去神经的营养作用，出现不同程度的萎缩、功能障碍，受压部位出现顽固性溃疡[14-15]。吴朝阳等[16]报道了观察大鼠大体形态学步态恢复可以作为评价损伤神经恢复情况的客观指标。本实验观察到造模后4周内由于损伤神经发生变性，靶器官丧失了神经的支配作用，两组大鼠左下肢屈曲程度无明显差异；随着损伤神经变形的完成，新生轴芽到达远端神经内膜管，逐渐延伸到靶器官，重新建立对靶器官的支配、营养作用，造模后6周实验组大鼠左下肢活动、步态开始恢复，对照组造模后8周才出现左下肢初步恢复，这也进一步说明了颅脑损伤后大鼠神经再生加速，通过重新建立对肢体靶器官的支配，恢复肢体的运动功能。董力强等[17]报告了通过实验证实促进神经肽P物质的分泌可促进失神经支配创面愈合。此次实验中观察到造模后实验组大鼠左足部溃疡开始愈合时间较对照组大鼠溃疡愈合时间显著提前，说明颅脑损伤可能通过促进神经肽P物质的分泌促进失神经支配溃疡的愈合，进而促进周围神经损伤的功能修复。
肌肉受神经-肌肉接头处神经递质的调控发挥肌肉的肌接运动，神经损伤后，肌肉失去神经的支配作用，丧失运动功能，随着神经再生，重新建立对肌肉的支配、营养作用，逐步恢复肢体功能[14]。坐骨神经功能指数测定被广泛应用反映下肢肌力恢复情况，以及反映下肢各肌肉间的协调功能，全面地反映神经修复的效果[13]。本实验中，造模后第4周，由于神经发生华勒变性原因，靶器官失去神经的协调、支配，各组神经功能指数接近，随着再生轴突通过神经损伤处，重新对靶肌肉进行再支配及营养作用，下肢肌肉功能逐渐恢复，神经功能指数逐渐降低；而造模后第8，12周实验组明显低于对照组，在某种程度上说明了颅脑损伤通过促使神经-肌肉接头的形成和成熟，促进下肢肌肉功能的恢复。
周围神经损伤后，再生轴突能否通过损伤神经的断端，与损伤神经远端神经内膜管的状态关系密切，神经损伤早期胶原瘢痕的形成影响再生轴突达到新形成的神经内膜管，不能重新建立神经联系[18-22]。Sunderland IR、Atkins等[23-24]提出了通过减少神经损伤修复部位胶原瘢痕的形成以达到更好的促进神经功能恢复的假设，并通过实验予以证明。Masson三色法染色在神经瘢痕研究方面被广泛应用，通过观察早期神经损伤处胶原瘢痕、神经纤维再生情况评价神经的修复情况。Que等[25]报道了通过Masson染色观察到通过减少神经吻合口处胶原瘢痕促进大鼠坐骨神经的修复。本实验通过Masson染色观察造模后8周实验组大鼠神经吻合口处胶原纤维较对照组少，神经纤维多于对照组，这可能与颅脑损伤后周围神经神经元再生轴芽提前增生、抑制成纤维细胞的分泌活动，在胶原瘢痕形成前与神经内膜管连接有关；造模后12周实验组与对照组相比神经纤维与胶原纤维均匀再生，胶原纤维随神经纤维呈波浪状走形，并且通过造模后12周与造模后8周两组组内比较再生神经纤维均匀，胶原纤维排列规整，这说明了颅脑损伤促进周围神经再生可能通过某种途径抑制早期成纤维细胞的活动减少胶原瘢痕的形成来实现的，但仍需要进一步的实验研究来证实。
周围神经损伤后，发生Wallerian变性，远、近端轴突溃变为碎片，被巨噬细胞吞噬，神经元重新形成新的轴芽以重新建立与靶器官的联系[25-27]。 近年来，轴突相关神经丝蛋白NF200是神经轴突的主要组成部分，NF200免疫组织化学方法在研究神经再生修复方面被广泛应用[16]。NF200染色表现为颗粒状染色，轴突再生后NF200呈细丝状连续染色。本实验观察到造模后8周实验组NF200阳性颗粒数目明显多于对照组、实验组再生轴突排列较对照组数目多且排列规则，造模后12周实验组阳性颗粒数目明显较对照组减少，密度均匀，神经再生纤维排列整齐、规律。这也充分证实了颅脑损伤后周围神经再生轴突的恢复加速，推测颅脑损伤可能通过加速大鼠坐骨神经损伤后的Wallerian变性实现促进周围神经损伤后轴突的再生修复，但是这还需要更加深入的研究来进一步证实。
周围神经损伤后，再生轴芽与远端的神经内膜管连续，许旺细胞包绕新生轴芽形成新的神经纤维，许旺细胞膜包绕轴突形成髓鞘，逐步恢复神经纤维的功能。透射电镜技术在神经损伤后再生修复的研究中被广泛应用[28]，通过计数通过神经吻合口远端再生轴突数量、观察髓鞘板层的厚度及髓板的排列、轴索内细胞器(线粒体、微丝、微管等)、胶原纤维增生等方面直观的观察神经结构恢复情况，客观反映周围神经损伤的修复程度。本实验通过透射电镜观察到造模后8周实验组轴突再生数目明显多于对照组，细胞器肿胀比对照组减轻，说明颅脑损伤促进神经再生可能与减轻轴突内细胞器肿胀、促进细胞器功能恢复有关。造模后12周实验组、对照组组内比较再生轴突数目较造模后8周时明显增多，并且造模后12周实验组再生轴突数目明显多于对照组 (P < 0.05)，说明了神经损伤后通过轴突再生实现神经的再生修复，颅脑损伤通过加速轴突的再生促进周围神经损伤的修复；由于轴突通过损伤处进入神经内膜管内、许旺细胞重新包绕新的轴突形成髓鞘，造模后8周与对照组相比，实验组髓鞘板层排列规整，髓鞘厚度较厚，胶原纤维少，造模后12周观察到实验组胶原纤维增生少于对照组，与对照组相比细胞器水肿不明显，从组织学方面说明颅脑损伤可能通过改变细胞器的某些变化减少吻合口处胶原瘢痕的形成促进周围神经的再生恢复。
近几年，关于促进周围神经损伤修复再生的研究一直是神经科学的研究热点，作者进行探索性实验研究，从不同的方面证实了大鼠颅脑损伤对周围神经损伤修复的促进作用，并发现其可能通过减少神经损伤断端胶原瘢痕促进周围神经损伤的修复，但具体机制和途径尚未被完全证实，还需进一步深入研究。
作者贡献：所有作者共同对实验进行设计实施及评估。
利益冲突：所有作者共同认可文章无相关利益冲突。
伦理问题：实验动物在水合氯醛麻醉下进行所有的手术，并尽一切努力最大限度地减少其疼痛、痛苦和死亡。
文章查重：文章出版前已经过CNKI反剽窃文献检测系统进行3次查重。
文章外审：文章经国内小同行外审专家双盲审核，符合本刊发稿宗旨。
作者声明：第一作者对研究和撰写的论文中出现的不端行为承担责任。论文中涉及的原始图片、数据(包括计算机数据库)记录及样本已按照有关规定保存、分享和销毁，可接受核查。
文章版权：文章出版前杂志已与全体作者授权人签署了版权相关协议。

4 参考文献 References
[1] Liu X,Zhou C, Li Y, et al.SDF-1 promotes endochondral bone repair during fracture healing at the traumatic brain injury condition. PLoS One.2013;8:e54077.
[2] Yang TY,Wang TC,Tsai YH,et al.The effects of an injury to the brain on bone healing and callus formation in young adults with fractures of the femoral shaft. J Bone Joint Surg Br.2012;94:227-230.
[3] 刘冠华,张柳,梁春雨,等.脑损伤合并骨折可加速骨折愈合及异位骨化[J].中国组织工程研究,2012,16(46):8721-8726.
[4] Zhuang YF, Li J.Serum EGF and NGF levels of patients with brain injury and limb fracture. Asian Pac J Trop Med.2013;6:383-386.
[5] 杨海林,董金波.血清素与NGF在脑外伤合并骨折患者血清中的表达及临床意义[J].中国现代医学杂志,2012,22 (13):44-47.
[6] 何新泽,王维,呼铁民,等.周围神经损伤的修复:理论研究与技术应用[J].中国组织工程研究,2016,20(7): 1044-1050.
[7] Liu HW, Wen WS, Hu M, et al. Chitosan conduits c