重组门冬酰胺酶制备表达纯化.pptx

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,#,酶的分类,门冬酰胺酶,L,-,天门冬酰胺酶,AnsB,能催化天门冬酰胺水解生成天冬氨酸和氨。淋巴瘤和白血病细胞通常不能合成天门冬酸胺，,L,-,天门冬酸胺酶将阻止癌细胞蛋白质合成而导致癌细胞死亡。在临床上，,L,-,天门冬酰胺酶已广泛用于治疗白血病和淋巴瘤。但目前国内尚不能生产，国外也仅有低产酶能力的大肠杆菌野生株产品，生产成本高，药价昂贵。基因工程菌产品既能填补国内空白，又能大幅度降低生产成本。,参考文献,1-,重组与表达,刘景晶，李晶，吴梧桐，胡梅清,.,大肠杆菌,L-,天门冬酰胺酶,基因的高效表达,中国药科大学生物化学教研室,南京,210009,南京铁道医学院生物化学教研室,南京,210009,2-,提取与纯化,刘景晶,金健勤,戴海滨,吴梧桐,.,大肠杆菌,L,门冬酸胺酶的提取和纯化,中国药科大学生化教研室,南京,210009,重组与表达,材料,限制酶,Ncol,、,Hind,III,及,T 4 DNA,连接酶，购自,Promega,公司；,Taq,酶、,dNTP,、,IPTG,购自华美公司；丙烯酰胺、,N,N,-,甲叉双丙烯酰胺、,SDS,购自,sigma,公司。,pKK 233,-2,购自,clonetech,公司；,pKK 233,-ansB,是将代,PCR,扩增得到的,AnsB,基因,DNA,用,Ncol,和,Hind,III,消化后，定向插入,pKK 233,-2,的多克隆位点而得到的重组质粒。,实验方法,PCR,扩增,AnsB,基因,重组质粒,PKK233-ansB,的构建,阳性转化子的筛选,PCR,扩增,AnsB,基因,模板的制备：用接种环挑取,CPU 210009,菌体少许，在裂解液,(1TritonX-100,2mmol/LTris-HCl pH8.5,2mmol/L EDTA)1ml,中振散，,95C,加热处理液,10min,吸取处理液,5ul,用于,PCR,。,引物：,E1:,5,-GGCCATGGAGTTTTTCAAAAAGACGGCACITGC,一,3,E2:,5-GGAAGCTTGAGAATGCCGTGATAC,一,3,11,：,5-GGCCATGGAGT111TCAAAAAGACGCACTTGC,一,3,12:5-GGAAGCTTAGACTGATTGAAGATCTGCTGG,一,3,扩增条件：,84C,变性,1 min;60C,复性,2 min;72C,延伸,1 min,；循环,28,次。,重组质粒,PKK233-ansB,的构建,PcR,扩增后的,DNA,片段及质粒,pKK 233,-2,同时分别用限制酶,Ncol,和,Hindl,消化并用琼脂搪凝胶电泳分离和回收质粒大片段；将消化后的,DNA,片段和电泳回收的质粒大片段用,T 4.DNA,连接酶连接，连接产物经琼脂糖凝胶电泳回收后转化,HB 1 01,、,71/15,、,ATCc 9637,、,JM107,、,cPU 210009,，筛选获得相应的阳性转化子。,阳性转化子的筛选,将涂布在含氨节青霉素的,LB,平板上生长出的单菌落用牙签逐个挑入方格化的新鲜,LB,平板上，为每个克隆编号。平板置,37C,温箱中过夜，待菌落形成后，用灭菌牙签逐个挑取少量菌体，移入预先加有,0.1 mol/L,硼酸缓冲液（,pH 8.4)50ul,的酶标板反应孔内，待菌体分散后，每孔各加入,0.04 mol/L,天门冬酞胺底物溶液,50,ul,37C,保温,15 min,，加奈氏试剂,50,ul,，呈深棕红色孔内对应的单菌落即为阳性转化子。,条件选择,酶的纯度,酶的浓度,金属离子,pH,温度、时间,晶种,酶的分离纯化工作中的注意事项,1.,防止酶蛋白变性,2.,防止复因子丢失,3.,防止酶被蛋白,水解酶降解,提取纯化,蔗糖溶液提取法,L-,天冬酰胺酶的鉴定（肽图分析）,酶活力的测定,酶分子量测定,提取,纯化,L-,天门冬酰胺的提取（蔗糖溶液提取法）,向菌体细胞中加入,5,倍体积的蔗糖抽提液（蔗糖,40,，溶菌酶,200mg/L,EDTA 10mmol/L,pH7.5.,）在,30C,震,2,小时，,8000r/min,离心,30min,收集上清酶液。,L-,天冬氨酸酶的纯化,蔗糖溶液提取法获得的酶液,加入硫酸铵至,55,饱和度，调,pH,至,7.0,室温搅拌,1,小时,离心除去沉淀。上清液中加入硫酸铵到,90,饱和度，离心收集沉淀。沉淀物用,50mmol/L,、,pH7.0,磷酸缓冲液溶解并透析。透析后的酶液通过预先用,10mmol/L,、,pH7.6,的磷酸缓冲液平衡的,DEAE-,纤维素,DE52,层析柱（,1.030cm,）。用,30mmol/L,磷酸缓冲液洗脱,流速为,40ml/h,。每分钟收集一定的洗脱液并于,280,处测定紫外吸收值，绘制洗脱曲线（,如图,1,）,Ph4.8,通过预先用,50mmol/L,pH4.9,磷酸缓冲液平衡的,CM-,纤维素 层析柱（,1.08.0cm,）,用,50mmol/L,、,pH5.2,磷酸缓冲液洗脱,收集显示天门冬酞胺酶活力的组分,冻干后得天门冬酰胺冻干粉。再进行称量计算产量。,L-,天冬酰胺酶的鉴定（肽图分析）,取适量样品加入,1%NH4HCO3,溶解至,1.0 mg/ml,，按,130(W/W),加入胰蛋白酶，,370.5,保温,16 h,，,50%,冰醋酸终止反应备用。色谱条件流动相：,A,为,0.1%TFA,水，,B,为,0.1%TFA,，乙腈水,(8020),。梯度：,0,60 min,，,B,：,0,30%,；,60,120 min,，,B,：,30%,38%,；,120,175,，,B,：,38%,80%,。流速：,0.2 ml/min,；上样量：自动进样,50 l,；检测波长：,210 nm,。,酶活力的测定,取,0,04mol/L L-,天门冬酰胺,1 ml,0.1 mol/L pH8.4,硼酸一硼酸钠缓冲液,lml,，取酶液,0.2ml,于试管中，于,37C,水浴保温,10min,，加,15,三氯乙酸,0.5ml,终止反应，经,4000r/min,离心，取上清液,1ml,奈氏试剂,2 ml,和蒸馏水,7 ml,，放置,15 min,后于,500nm,波长比色测定生成的氨。在上述条件下，每分钟催化,L,一天门冬酰胺水解释放,1umol,氨所需的酶量定义为一个酶活力单位,U,。,1.3.7,酶分子量测定,SDS-PAGE,小组成员,演讲人,-,曹磊（,0843613,）,文献查阅,-,洪旭鹭（,0843614,）,徐淑雅（,0843616,）,PPT,制作,-,方旭（,0843615,）,谢谢大家！,