高效液相色谱.doc

高效液相色谱-荧光法测定人尿液中氧氟沙星的浓度
【实验目的】
1． 掌握氧氟沙星尿液样品的收集、处理方法和尿药累积排泄率的计算方法。
2． 熟悉氧氟沙星尿液样品的预处理方法好测定步骤。
【实验原理】
氧氟沙星为喹诺酮类抗菌药，化学名(+/-)-9-氟-2,3-二氢-3-甲基-10-(4-甲基-1-哌嗪基)-7-氧代-7H-吡啶并[1,2,3-de]-[1,4]苯并恶嗪-6-羧酸。本品为白色或微黄色结晶性粉末；无臭、味苦；遇光渐变色；在三氯甲烷中略溶，在水或甲醇中微溶或极微溶解，在冰醋酸或氢氧化钠试液中易溶，在0.1mol/L盐酸溶液中溶解。

（C18H20FN3O4 361.38）
环丙沙星（内标），化学名1-环丙基-6-氟-4-氧代-1，4-二氢-7-（1-哌嗪基）-3-喹啉甲酸。

（ C17H18FN3O3 331.35）
1． 尿液中药物浓度的测定可以计算药物的排泄量及排泄率，在某些缺乏严密医护条件不便于对给药对象多次采血情况下，尿药排泄数据可以用来求算药动学参数；一般抗菌药物很容易通过尿液以原形药物形式排出体外，可以表征当时体内的药量。
2． 氧氟沙星具有长共轭刚性结构，可以采用荧光检测器检测，由于体内内源性物质能够产生荧光的可能性很小，因此，荧光检测可以有效地减小内源性物质的干扰，同时增加检测灵敏度，满足了体内药物分析干扰多、含量低的特点。
3． 氧氟沙星具有酸碱两性，在水溶液中发生解离，因此选择偏酸性的色谱条件可以有效地抑制其拖尾或者色谱峰对称性差的缺点，获得较好的色谱分离效果；由于尿液中浓度较大，可以采用直接稀释后离心的前处理手段，以获得适合于色谱分析的样品。
【仪器与试药】
高效液相色谱仪-荧光检测器，分析天平，离心机，超声波清洗器，恒温水浴锅，涡旋混合器，微量注射器；离心管，微量移液器，容量瓶，量筒；氧氟沙星片（每片0.1克），氧氟沙星对照品，环丙沙星对照品，甲酸，三氯乙酸，乙腈，甲醇，二次蒸馏水。
【实验步骤】
1． 生物样品采集与保存 给药与收集尿液：健康志愿受试者隔夜、禁食10小时，收集给药前的尿液作为空白对照；于实验当日晨单次空腹口服氧氟沙星片1片（每片0.1克），200ml温开水送服。实验2小时后可适量饮水，4小时后进统一清淡午餐，分段收集给药后0-2、2-4、4-8、8-12和12-24小时尿液，准确测量体积，滤过，于-20℃冷冻保存、待测。
2． 对照品溶液制备
（1） 氧氟沙星标准溶液：精密称取氧氟沙星对照品10mg，置100ml量瓶中，用乙腈溶解，并稀释制成每1ml含100ug的标准储备液，精密量取氧氟沙星标准储备液适量，用水稀释制成浓度分别为100、200、500、1000、2000、3000和4000ng/ml的氧氟沙星标准系列溶液。
（2） 环丙沙星内标溶液：精密称取环丙沙星对照品10mg，置100ml量瓶中，用水溶解，并定量稀释成每1ml含100ug的储备溶液；精密量取该溶液1ml置100ml量瓶中，用水稀释至刻度配成1.0ug/ml的标准溶液。
以上溶液均在4℃条件下冷藏。
3. 尿液样品前处理 取冷冻的尿液样品，在37℃水浴下解冻，经适当稀释后，精密吸取500ul，置2ml具塞离心管中，精密加入环丙沙星内标溶液50ul，再加入200ul10%三氯乙酸混匀后高速离心，取上清液20ul进样分析。
4. 方法学确证
（1） 特异性评价：对6份不同志愿者空白尿液进行上述样品预处理，分别进样液相色谱分析，在氧氟沙星与内标保留时间位置未有内源性物质干扰出现，则证明本方法可以很好地排除尿液对氧氟沙星测定的干扰。
（2） 尿液标准曲线制备：取空白尿液450ul,分别置10ml具塞离心管中，精密加入上述配制的氧氟沙星标准溶液50ul，得氧氟沙星浓度分别为10、20、50、100、200和400ng/ml标准尿液样品。按“尿液样品前处理”步骤操作，自“精密加入环丙沙星内标溶液50ul”起，同法处理，进样20ul，记录色谱图。以氧氟沙星浓度为横坐标，氧氟沙星与内标的峰面积笔直为纵坐标，求得的直线回归方程即为标准曲线。
（3） 准确度、精密度和最低定量限：取空白尿液450ul，按“标准曲线”项下的方法分别制成含有氧氟沙星浓度为10、20、100、和300ng/ml的最低定量限及低、中、高三个浓度的质量控制尿液样品，每一浓度进行5个样本分析，根据标准曲线，计算质控样品中氧氟沙星的实测浓度。根据质控样品中氧氟沙星的实测浓度，计算本法的精密度与准确度。
（4） 绝对回收率：按照“准确度、精密度和最低定量限”项下低、中、高三个浓度的质控样品，每一浓度进行5个样本分析。同时，另取空白尿液500ul，除不加氧氟沙星标准溶液和内标溶液外，其他按“尿液样品前处理”项下的方法操作，向获得的下层水相中加入相应浓度的氧氟沙星标准溶液适量和内标溶液50ul，制成氧氟沙星的浓度分别为20、100和300ng/ml的低、中、高浓度的对照样品各2份，20ul进样分析，获得相应峰面积（3次测定的平均值）。以每一浓度两种处理方法的峰面积比值计算绝对回收率。
（5） 稀释效应：取空白尿液450ul，按“标准曲线”项下的方法，分别制成含有氧氟沙星浓度为600、1500和3000ng/ml的高浓度尿液样品，分别为高浓度质控样品的2、5、10倍。将上述溶液分别用空白尿液稀释2、5和10倍，其中稀释10倍采用先2倍再5倍的逐级稀释方式，所得稀释尿液样品按照“尿液样品前处理”项下方法操作，进样分析获得峰面积，代入标准曲线求得稀释后浓度，再乘以相应的稀释倍数得到实测浓度。此浓度与配制浓度相比，以回收率形式表示稀释对准确度的影响，每个浓度进行3个样本分析，准确度应在85%-115%之间，RSD小于15%。
5. 氧氟沙星尿药浓度测定
色谱条件与系统适用性试验 用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相乙腈-甲醇-甲酸-水（6:12:0.5:81.5）；流速1.0ml/min；检测波长：激发波长（Ｅx）＝２７８ｎｍ，发射波长（Ｅm）=445nm。取空白尿液样品，按“标准曲线”项下标准尿液样100ng/ml分别测定，氧氟沙星与环丙沙星的分离度应符合规定，理论板数按氧氟沙星峰计算应不低于3000；空白尿液样品色谱中，在氧氟沙星与内标位置应没有干扰峰。
测定法 取得含药尿液样品，按照“尿液样品前处理”步骤操作后进样分析，记录色谱图，按内标法，用标准曲线计算即得。
尿药累积排泄率的计算：排泄率（%）=C×V×D／S×100%
式中，C为测得的一段时间内的尿药浓度（ng/ml）；V为收集的尿液体积（ml），D为尿样的稀释倍数；S为口服氧氟沙星的量（ng）。
【注意事项】
1． 尿液样品中细菌较多，收集的尿液样品若不立即测定，应放置在-20℃冷冻保存，测定前解冻。
2. 抗菌药肾排泄较多，因此尿液中的氧氟沙星浓度较大，为了适应色谱分析需要，将尿液进行逐级稀释，因此需要考察尿液稀释对定量准确度的影响，进行稀释效应的评价。凡是测定样品高出标准曲线上限，均应用相同的生物基质进行稀释，并考察稀释效应。
3. 所用玻璃仪器均应以洗液洗涤，不得用肥皂或洗衣粉，以防带入荧光干扰物。
【思考题】
1. 荧光检测器测定氧氟沙星的原理是什么？荧光检测器的特点是什么？
2. 尿样是如何收集和保存的？如何评价氧氟沙星在尿中的排泄情况？
3. 尿中药物浓度的测定主要用于哪些方面的研究？
4. 荧光检测器与紫外检测器相比有何优点？在测定时应注意哪些条件？
【附录】
荧光检测器简介
荧光检测器是高效液相色谱仪常用的一种检测器之一。用紫外线照射色谱馏分，当试样组分具有荧光性能时，即可检出。其特点是选择性高，只对荧光物质有响应；灵敏度也高，最低检出限比紫外检测器通常高一个数量级，适合于多环芳径及各种荧光物质的痕量分析，也可用于检测不发荧光但经化学反应后可发荧光的物质。如在酚类分析中，多数酚类不发荧光，为此先经处理，使其变为荧光物质，而后进行分析。
从电子跃迁的角度来讲，荧光是指某些物质吸收了与它本身特征频率相同的光线以后，原子中的某些电子从基态中的最低振动能级跃迁到较高的某些振动能级。电子在同类分子或其他分子中撞击，消耗了相当的能量，从而下降到第一电子激发态中的最低振动能级，能量的这种转移形式称为无辐射跃迁。由最低振动能级下降到基态中的某些不同能级，同时发出比原来吸收的频率低、波长长的一种光，就是荧光。被化合物吸收的光称为激发光，产生的荧光称为发射光，发射光波长总要长于激发光波长。
对于稀溶液，荧光强度与荧光物质溶液浓度、摩尔吸光系数、吸收池厚度、入射光强度、荧光的量子效率及荧光的收集效率等成正相关。在其他因素保持不变的条件下，物质的荧光强度与该物质溶液浓度成正比，这是荧光检测器的定量基础。荧光检测器属于溶质型检测器，可直接用于定量分析。激发波长和发射波长是荧光检测的必要参数。选择合适的激发波长和发射波长，对检测的灵敏度和选择性都很重要，尤其是可以较大程度地提高检测灵敏度。

血浆中5-单硝酸异山梨酯的气相色谱法测定
【实验目的】
1． 掌握5-单硝酸异山梨酯血浆样品的处理过程和分析测定方法。
2． 熟悉气相色谱法用于血浆样品分析测定的方法学验证内容。
3． 了解气相色谱仪-电子捕获检测器分析的特点。
【实验原理】
5-单硝酸异山梨酯为血管扩张药，化学名1，4：3，6-二脱水-D-山梨糖醇-5-单硝酸酯。白色针状结晶或结晶性粉末，无臭，在甲醇或丙酮中易溶，在三氯甲烷或水中溶解，在己烷中几乎不溶。选择结构类似物硝酸异山梨酯为内标，化学名1,4:3,6-二脱水-D-山梨醇二硝酸酯。

（C6H9NO6 191.14）
选择结构类似物硝酸异山梨酯为内标，化学名1,4:3,6-二脱水-D-山梨醇二硝酸酯。

（C6H8N2O8 236.14）
【实验材料】
气相色谱仪-电子捕获检测器，分析天平，离心机，超声波清洗器，涡旋混合器，氮吹仪，微量注射器；离心管，微量移液器，量筒；5-单硝酸异山梨酯片（每片40mg）5-单硝酸异山梨酯对照品，硝酸异山梨酯对照品，磷酸二氢钾，氢氧化钠，乙酸乙酯，甲醇。
【实验内容】
1． 生物样品采集与保存
（1） 准备肝素抗凝管：将12500U的肝素用生理盐水稀释至10ml（1→10）。取稀释后的肝素溶液0.1ml置于5ml或10ml试管中，转动试管，使肝素溶液均匀涂布在试管内壁，80-100℃干燥。
（2） 给药与采血：受试者隔夜、禁食10小时，于实验当日晨单次空腹口服单硝酸异山梨酯普通片，剂量为40mg，200ml温开水送服。试验2小时后可适量饮水，4小时后进统一清淡（低脂）午餐。在给药前（0小时）及给药后0.5、1.0、1.5、2.0、3.0、5.0、8.0、12、16和24小时分别抽取肘静脉血3ml，置肝素化试管中，混匀，离心（3500r/min）10分钟，分离血浆，于-20℃冷冻保存、待测。】
2． 对照品溶液制备
（1） 5-单硝酸异山梨酯标准溶液：精密称取5-单硝酸异山梨酯对照品适量，用无水乙醇溶解，并定量稀释制成每1ml含100ug的标准储备液，精密量取5-单硝酸异山梨酯标准储备液适量，用无水乙醇稀释制成浓度分别为0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、4.0、5.0和6.0ug/ml的5-单硝酸异山梨酯标准系列溶液。以上溶液均在4℃条件下冷藏。
（2） 硝酸异山梨酯内标溶液：精密称取硝酸异山梨酯对照品适量，用甲醇溶解，并定量稀释制成每1ml含100ug的内标储备液。精密量取内标储备液0.1ml，置100ml量瓶中，加乙酸乙酯稀释制成浓度为0.1ug/ml的内标溶液。
3.血浆样品前处理 取冷冻的血浆样品，在37℃水浴中解冻，精密吸取0.5ml，置10ml具塞离心管中，精密加入硝酸异山梨酯内标标准溶液10ul，加PH10的磷酸盐缓冲液0.1ml，混合均匀后，加乙酸乙酯5.0ml，涡旋3分钟，3500r/min离心10分钟，分取乙酸乙酯溶液4.0ml，于37℃水浴中氮气流吹干，残留物用50ul乙酸乙酯涡旋溶解，离心，取上清液3ul进样。
4.方法学确证
（1）特异性评价：对6份空白血浆进行上述样品预处理，配制一定浓度的5-单硝酸异山梨酯标准溶液，进样，如果空白血浆峰不干扰5-单硝酸异山梨酯的峰，则证明空白血浆经过提取后对5-单硝酸异山梨酯测定不造成干扰；如果干扰，则需重新摸索色谱条件。
（2）血浆标准曲线的制备：取空白血浆0.5ml，分别置10ml具塞离心管中，5-单硝酸异山梨酯标准溶液适量，配制成相当于5-单硝酸异山梨酯浓度10.0、50.0、100、200、400和600ng/ml标准系列血浆样品。按“血浆样品处理”项下，自“精密加入硝酸异山梨酯内标溶液10ul”起，同法处理，进样1ul，记录色谱图。以5-单硝酸异山梨酯血浆浓度为横坐标，5-单硝酸异山梨酯与内标的峰面积比值为纵坐标，用加权（w=1/x2）最小二乘法进行回归运算，求得的直线回归方程即为标准曲线。
（3）精密度、准确度和最低定量限：取空白血浆0.5ml，按“标准曲线”项下的方法制成高、中、低三个浓度（5-单硝酸异山梨酯浓度分别20、100和500ng/ml）的质量控制样品，每一浓度进行5个样本分析，根据标准曲线，计算质控样品中5-单硝酸异山梨酯的实测浓度。以实测浓度和添加浓度的相对回收率表征准确度；计算每个浓度5次样本分析的实测浓度的相对标准偏差表征精密度。
（4）绝对回收率：精密吸取空白血浆0.5ml，按“标准曲线”项下方法制备低、中、高三个浓度（5-单硝酸异山梨酯浓度分别20、100和500ng/ml）的质控样品，每一浓度进行5个样本分析。同时，另取空白血浆0.5ml，除不加5-单硝酸异山梨酯标准溶液和内标溶液外，其他按“血浆样品的处理”项下的方法操作，向获得的上清液中加入相应浓度的5-单硝酸异山梨酯标准溶液50ul和内标溶液10ul，漩涡混合，40℃水浴氮气流下吹干，残留物加50ul乙酸乙酯溶解后进样分析，获得相应峰面积（3次测定的平均值）。以每一浓度两种处理方法的峰面积比值计算绝对回收率。
5. 5-单硝酸异山梨酯血药浓度测定
色谱条件与系统适用性试验 用交联聚甲基硅氧烷为固定相的熔融石英毛细管柱；高纯氮气为载气，电子捕获检测器；柱前压力9psi，载气线流速1.5ml/min；分流进样，分流比为40；气化室温度为200℃；柱温程序升温：155℃（10min） 240℃（3min）；电子捕获检测器温度为250℃；尾吹流速20ml/min。取空白血浆样品和“标准曲线”项下的标准血浆样品（200ng/ml）分别测定，5-单硝酸异山梨酯与硝酸异山梨酯的分离度应符合规定，理论板数按5-单硝酸异山梨酯峰计算应不低于5000；空白血浆样品色谱中，在5-单硝酸异山梨酯与硝酸异山梨酯位置应没有干扰峰。
测定法 取含药血浆样品处理后的供试液1ul，注入气相色谱仪，记录色谱图，按内标法，用标准曲线计算即得。
【注意事项】
PH10的磷酸盐缓冲液配制方法：分别配制0.2ml/L的磷酸氢二钠和0.2ml/L的磷酸二氢钠溶液，然后按体积比9:1混合均匀，磷酸二氢钠溶液调PH至10.0.
【思考题】
1.为何选用气相色谱-电子捕获检测的方法对血浆样品中5-单硝酸异山梨酯进行测定？有哪些特点？
2.文献报道5-单硝酸异山梨酯血浆样品处理及测定还有哪些方法？各有什么特点？
【附录】
气相色谱-电子捕获检测器简介
气相色谱-电子捕获检测器是一种放射源Ni63或氚放射源的离子化检测器，当载气（如N2）通过检测器时，受放射源发射出β射线的激发与电离，产生出一定数量的电子和正离子，在一定强度的电场作用下形成一个背景电流，在此情况下，如载气中含有电负性强的化合物（如四氯化碳），这种电负性强的物质就会捕捉电子，产生如下反应：
ＡＢ＋ｅ→（ＡＢ）－或ＡＢ＋ｅ→Ａ－＋Ｂ
反应结果使检测室中的背景电流（基流）减小，减小的程度与样品在载气中的浓度成正比关系。ECD只对具有电负性的物质，如含有卤素、硫、磷、氮的物质有响应，且电负性越强，检测器灵敏度越高。电子捕获检测器是浓度型检测器，其线性范围较窄，因此在定量分析时应特别注意。
5-单硝酸异山梨酯属于极性较大的化合物，进行检测时应选择强极性的石英毛细管色谱柱，如DB-35型色谱柱。
5-单硝酸异山梨酯和内标硝酸异山梨酯在高温下不稳定，因此在血浆样品提取时，应控制水浴温度并尽量缩短加热时间。