松阿扁叶蜂SSR.doc

松阿扁叶蜂SSR
摘要：以ｓｄｓ－蛋白酶ｋ法提取的松阿扁叶蜂（ａｃａｎｔｈｏｌｙｄａ ｐｏｓｔｉｃａｌｉｓ ｍａｔｓｕｍｕｒａ）基因组ｄｎａ为模板，利用ｌ１６（４５）正交设计对影响松阿扁叶蜂ｓｓｒ－ｐｃｒ反应的主要参数ｄｎａ模板、ｔａｑ ｄｎａ聚合酶、ｍｇ２＋、引物和ｄｎｔｐｓ进行优化。结果表明，松阿扁叶蜂ｓｓｒ－ｐｃｒ最优的反应体系为２５ μｌ体系中含１.00 ｕ ｔａｑ ｄｎａ聚合酶、３．００ ｍｍｏｌ／ｌ ｍｇ２＋、３．７５ ｍｍｏｌ／ｌ ｄｎｔｐｓ、２５．００ ｎｇ／μｌ dna模板和１０．００ μｍｏｌ／ｌ引物。
关键词：松阿扁叶蜂（ａｃａｎｔｈｏｌｙｄａ ｐｏｓｔｉｃａｌｉｓ ｍａｔｓｕｍｕｒａ）；ｓｓｒ－ｐｃｒ；正交设计
ａｂｓｔｒａｃｔ： ｉｎ ｏｒｄｅｒ ｔｏ ｅｓｔａｂｌｉｓｈ ｔｈｅ ｓｓｒ－ｐｃｒ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ ｕｓｉｎｇ ｇｅｎｏｍｉｃ ｄｎａ ｏｆ ａｃａｎｔｈｏｌｙｄａ ｐｏｓｔｉｃａｌｉｓ which was ｅｘｔｒａｃｔｅｄ ｂｙ ｓｄｓ－ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ ｋ ｍｅｔｈｏｄ ａｓ ｔｅｍｐｌａｔｅ， ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｄｅｓｉｇｎ ｗａｓ ｕｓｅｄ ｔｏ ｏｐｔｉｍｉｚｅ ｍａｉｎ ｐｃｒ ｆａｃｔｏｒｓ ｓｕｃｈ ａｓ ｔｅｍｐｌａｔｅ ｄｎａ， ｔａｑ ｄｎａ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ， ｍｇ２＋， ｐｒｉｍｅｒ ａｎｄ ｄｎｔｐｓ． ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ ｐｃｒ ｓｙｓｔｅｍ ｉｎｃｌｕｄｅｄ 1.00 ｕ ｔａｑ ｄｎａ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ， 3.00 ｍｍｏｌ／ｌ ｍｇ２＋， ３．７５ ｍｍｏｌ／ｌ ｄｎｔｐｓ， 25.00 ｎｇ／μｌ ｄｎａ ｔｅｍｐｌａｔｅ ａｎｄ ２０.00 μｍｏｌ／ｌ ｅａｃｈ ｐｒｉｍｅｒ ｉｎ ｔｈｅ ｔｏｔａｌ ｖｏｌｕｍｅ ２５ μｌ．
ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ａｃａｎｔｈｏｌｙｄａ ｐｏｓｔｉｃａｌｉｓ ｍａｔｓｕｍｕｒａ；ｓｓｒ－ｐｃｒ；ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｄｅｓｉｇｎ
松阿扁叶蜂（ａｃａｎｔｈｏｌｙｄａ ｐｏｓｔｉｃａｌｉｓ ｍａｔｓｕｍｕｒａ）是松树的重要食叶害虫之一，其１年发生ｌ代，主要为害油松、黑松、樟子松等，常将当年生和二年生针叶吃光，致使被害松林成橘褐色，严重时８０％以上的针叶被取食，从而严重影响树木生长［１，２］。中国关于松阿扁叶蜂的研究主要集中于其生物学特性［３，４］、发生原因［５，６］、寄主选择［７］、防治技术和预测预报［８，９］等方面，但关于该害虫种群遗传变异的研究至今未见报道。
微卫星（ｓｓｒ）分子标记具有分布广泛、多态性高、稳定性好、操作简便、检测技术简单及共显性遗传等优点，已被广泛应用于物种资源遗传多样性研究、基因分子标记以及昆虫遗传多样性研究等领域。但ｓｓｒ－ｐｃｒ反应结果易受反应体系中多种因素的影响，因此需要对其扩增体系进行优化，然后才能进行后续的试验分析；此外，不同物种所需的ｓｓｒ－ｐｃｒ反应的最佳反应体系一般也不尽相同。
在进行种群遗传多样性的研究中，运用正交设计方法［１０－１２］对影响松阿扁叶蜂ｓｓｒ－ｐｃｒ反应的各因素进行了优化试验，建立了一套适合松阿扁叶蜂ｓｓｒ－ｐｃｒ的反应体系，为应用该技术进行松阿扁叶蜂的种群遗传多样性分析打下基础。
１ 材料与方法
１．１ 材料
１．１．１ 原料 供试材料为２０１０年６月采自陕西省周至县楼观台国家森林公园为害油松的松阿扁叶蜂幼虫，样品保存于体积分数为９５％的乙醇中，带回西北农林科技大学林学院昆虫分子生物学实验室进行基因组ｄｎａ提取。
１．１．２ 试剂与仪器 １０×ｐｃｒ ｂｕｆｆｅｒ（无ｍｇ２＋）、１０ ｍｍｏｌ／ｌ ｄｎｔｐｓ、５ ｕ／μｌ ｔａｑ ｄｎａ聚合酶、２５ ｍｍｏｌ／ｌ ｍｇｃｌ２以及分子质量标准ｄｌ ２０００ ｄｎａ ｍａｒｋｅｒ均购自宝生物公司（大连）有限公司，引物序列由生工生物工程（上海）有限公司合成，稀释成２０ μｍｏｌ／ｌ。ｍａｓｔｅｒｃｙｃｌｅ ｐｒｏ ｓ型ｐｃｒ仪购自德国ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ公司，ｎｄ－１０００微量紫外可见分光光度计购自美国ｎａｎｏｄｒｏｐ公司。
１．２ 方法
１．２．１ 基因组ｄｎａ的提取和浓度测定 采用改良的ｓｄｓ－蛋白酶ｋ法［１３］提取松阿扁叶蜂幼虫基因组ｄｎａ，在１％琼脂糖凝胶上电泳检测提取产物的完整性。用ｎｄ－１０００微量紫外可见分光光度计检测ｄｎａ溶液的浓度和纯度，并将其稀释到２０ ｎｇ／μｌ，于－８０ ℃保存备用。
１．２．２ 退火温度的优化 根据预试验结果，选定引物ｌｉｓｔ２００１［１４］用于ｓｓｒ－ｐｃｒ反应体系的优化。首先在４５～６５ ℃设置４个退火温度即４８．９、５２．７、５７．６和６１．６ ℃进行试验，确定该引物最佳的退火温度。ｓｓｒ－ｐｃｒ基本反应体系为：２．５ μｌ １０×ｐｃｒ ｂｕｆｆｅｒ（无ｍｇ２＋），２ μｌ ２５ ｍｍｏｌ／ｌ ｍｇｃｌ２，１ μｌ ｄｎａ模板，２０ μｍｏｌ／ｌ上下游引物各１ μｌ，０．２５ μｌ ５ ｕ／μｌ ｔａｑ ｄｎａ聚合酶，２ μｌ １０ ｍｍｏｌ／ｌ ｄｎｔｐｓ，最后用无菌去离子水补足至２５ μｌ。ｓｓｒ－ｐｃｒ基本扩增程序为：９４ ℃预变性５ ｍｉｎ；９４ ℃变性４５ ｓ、４８．９ ℃／５２．７ ℃／５７．６ ℃／６１．６ ℃退火４５ ｓ、７２ ℃延伸４５ ｓ，３０个循环；最后７２ ℃延伸７ ｍｉｎ。扩增产物于１．５％琼脂糖凝胶上用１００ ｖ电泳４０ ｍｉｎ，用溴化乙锭染色１０ ｍｉｎ，用去离子水脱色１０ ｍｉｎ，然后于ｂｉｏ－ｒａｄ凝胶成像仪上照相保存。
１．２．３ ｓｓｒ－ｐｃｒ正交试验的设计 针对影响ｐｃｒ反应的５个因素（ｄｎａ模板、ｍｇ２＋、ｄｎｔｐｓ、引物和ｔａｑ ｄｎａ聚合酶），选用ｌ１６（４５）正交表在４个水平上进行正交试验。设计的因素与水平见表１，２次重复。ｐｃｒ反应程序为：９４ ℃预变性５ ｍｉｎ；９４ ℃变性３０ ｓ、６１．６ ℃退火３０ ｓ、７２ ℃延伸４５ ｓ，３０个循环；最后７２ ℃延伸７ ｍｉｎ，４ ℃保存。ｐｃｒ产物用１．５％琼脂糖凝胶电泳检测，经溴化乙锭染色后于ｂｉｏ－ｒａｄ凝胶成像仪上照相保存。
根据正交设计ｐｃｒ扩增图谱中ｄｎａ条带的清晰程度与特异性（即条带强弱及杂带多少），参照何正文等［１５］的方法从低到高依次对每个反应结果进行打分，分值从１分到１６分，分值越高，表示敏感性、特异性越好。所有数据分析均采用ｓｐｓｓ １２．０软件。
２ 结果与分析
２．１ 松阿扁叶蜂基因组ｄｎａ的提取结果
松阿扁叶蜂幼虫基因组ｄｎａ的提取结果表明（图１），松阿扁叶蜂基因组ｄｎａ大小约１５ ｋｂ，主带清晰，无拖尾现象，ｄｎａ浓度为５００～１ ０００ ｎｇ／μｌ，纯度为１．８～２．０。
２．２ 不同退火温度对ｓｓｒ－ｐｃｒ反应结果的影响
退火温度是引物和模板结合时的温度参数，是影响ｐｃｒ扩增特异性的重要因素。４个退火温度下的扩增结果（图２）表明，退火温度较低时（泳道１和泳道２的退火温度分别为４８．９和５２．７ ℃），引物与模板之间的错配几率增大，非特异性扩增条带多并且模糊；随着退火温度升高（泳道３和泳道４的退火温度分别为５７．６和６１．６ ℃），引物的特异性增加，条带也更加清晰，引物二聚体减少。但是，退火温度更高则会使ｔａｑ ｄｎａ聚合酶活性降低或丧失，从而导致无法扩增出条带。
２．３ ssr-ｐｃｒ反应体系的正交设计分析
依据正交设计ssr-ｐｃｒ的扩增结果（图３），对每个扩增反应进行评分（表２），由表２可知，根据极差分析结果可知，最优的方案为ａ２ｂ４ｃ３ｄ４ｅ２，即松阿扁叶蜂ｓｓｒ－ｐｃｒ最优的反应体系为２５ μｌ体系中含１.00 ｕ ｔａｑ ｄｎａ聚合酶、３．００ ｍｍｏｌ／ｌ ｍｇ２＋、３．７５ ｍｍｏｌ／ｌ ｄｎｔｐｓ、 ２５．００ ｎｇ／μｌ ｄｎａ模板和１０．００ μｍｏｌ／ｌ引物。
２．４ 正交设计中各个因素对ssr-ｐｃｒ反应的影响
２．４．１ ｔａｑ ｄｎａ聚合酶用量对试验结果的影响 方差分析结果表明，ｔａｑ ｄｎａ聚合酶的用量是ssr-ｐｃｒ反应中最为重要的因素，不同用量对扩增结果的影响达极显著水平（ｐ＜０．０１）。ｔａｑ ｄｎａ聚合酶用量高时不仅成本过高，而且容易产生非特异性扩增产物，用量过低则会导致ssr-ｐｃｒ产物的合成效率下降。
２．４．２ ｍｇ２＋浓度对试验结果的影响 ｍｇ２＋的作用主要是ｄｎｔｐ－ｍｇ２＋与核酸骨架相互作用，影响ｔａｑ ｄｎａ聚合酶的活性。ｍｇ２＋浓度对ssr-ｐｃｒ扩增效率影响很大，浓度过高可降低ssr-ｐｃｒ扩增的特异性，浓度过低则影响ssr-ｐｃｒ扩增产量甚至使ssr-ｐｃｒ扩增失败而扩增不出条带。一般的情况下ｍｇ２＋的浓度为０．５～５．０ ｍｍｏｌ／ｌ。
２．４．３ ｄｎｔｐｓ浓度对试验结果的影响 ｄｎｔｐｓ的质量和浓度与ｐｃｒ扩增效率有密切关系，方差分析结果显示ｄｎｔｐｓ对试验结果的影响达到显著水平（ｐ＜０．０５）。ｄｎｔｐｓ浓度过高会扩增出片状拖带或涂抹带，ｄｎｔｐｓ能与ｍｇ２＋结合，使游离的ｍｇ２＋浓度降低。ｄｎｔｐｓ浓度低时ｐｃｒ产率及特异性均增高。若ｄｎｔｐｓ浓度高至４～６ ｍｍｏｌ／ｌ时，ｔａｑ ｄｎａ聚合酶活力要降低２０％～３０％，即产生底物抑制现象。
２．４．４ dna模板浓度对试验结果的影响 dna模板浓度是制约扩增产物获得率及特异性的重要因素。dna模板浓度过低，分子碰撞的机率会降低，扩增产物少或不稳定；dna模板浓度过高，会产生大量非特异性扩增小片段，运用琼脂糖凝胶电泳检测时会有拖尾现象，有时候还可能会没有ｐｃｒ条带，特别是在dna模板不纯的时候，会对ssr-ｐｃｒ起抑制作用。
２．４．５ 引物浓度对试验结果的影响 引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且会增加引物之间形成二聚体的机会，降低引物及酶的浓度也可以减少错误引发；引物浓度过低会使扩增产物减少。
３ 小结与讨论
筛选微卫星（ｓｓｒ）引物和建立稳定的ｓｓｒ-ｐｃｒ反应体系是ｓｓｒ分子标记检测过程中的一个重要环节，也是ｓｓｒ多态性应用的基础。在利用ｓｓｒ分子标记开展松阿扁叶蜂的种群遗传多样性的初期研究试验中，曾对ｓｓｒ－ｐｃｒ反应体系中各因素分别进行了单独的梯度试验，但发现不能兼顾各因素间的交互作用，因此利用正交设计的均衡分散性和整齐可比性来解决理论上所需要的与实际可行的试验次数的矛盾。为了确定最佳的反应体系，本研究利用松阿扁叶蜂的基因组ｄｎａ为模板，对ｓｓｒ－ｐｃｒ反应体系中的几个重要组成因素如模板ｄｎａ、ｄｎｔｐｓ、ｍｇ２＋、引物以及ｔａｑ ｄｎａ聚合酶进行了多因素联合优化的正交试验，由于ｓｓｒ－ｐｃｒ反应体系中各组分均可能对扩增的特异性、敏感性和产量产生影响，针对每个因素进行分析时，都可以找到各自最适的浓度。但是采用多因素联合优化的正交试验设计，借助合适的正交表，可以充分考虑各因素间的交互作用，通过极差分析确定松阿扁叶蜂ｓｓｒ－ｐｃｒ最优的反应体系为２５ μｌ体系中含１.00 ｕ ｔａｑ ｄｎａ聚合酶、３．００ ｍｍｏｌ／ｌ ｍｇ２＋、３．７５ ｍｍｏｌ／ｌ ｄｎｔｐｓ、２５．００ ｎｇ／μｌ ｄｎａ模板和１０．００ μｍｏｌ／ｌ引物。此条件下获得的条带清晰，且重复率高。利用这个体系已成功地进行了松阿扁叶蜂几个种群的遗传多样性分析，希望该研究结果也能为其他昆虫包括叶蜂其他种类的ｓｓｒ－ｐｃｒ研究提供参考。
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