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,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,本幻灯片资料仅供参考，不能作为科学依据，如有不当之处，请参考专业资料。谢谢,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,本幻灯片资料仅供参考，不能作为科学依据，如有不当之处，请参考专业资料。谢谢,试验八 微生物生理生化试验,1,菌种,大肠杆菌，普通变形杆菌，金黄色葡萄球菌，,产气肠杆菌,2,培养基,尿素琼脂试管，,蛋白胨水培养基，葡萄糖蛋白胨水培养基，葡萄糖发酵管和乳糖发酵管各,3,支。,3,溶液和试剂,甲基红指示剂，,5,萘酚，,乙醚和吲哚试剂,4,仪器和其它用具,接种针,一 试验器材,第1页,二 目标要求,1,大分子物质水解试验,（,1,）证实不一样微生物对各种有机大分子物质水解能力不一样，从而说明不一样微生物有着不一样酶系统；,（,2,）掌握微生物大分子物质水解试验原理和方法。,2,IMViC,试验,了解,IMViC,与硫化氢反应原理及其在肠道细菌判定中意义和方法。,3,糖发酵试验,（,1,）了解糖发酵原理和在肠细菌判定中主要作用。,（,2,）掌握经过糖发酵判别不一样微生物方法。,第2页,三 基本原理,1,大分子物质水解试验,微生物对大分子物质如淀粉、蛋白质和脂肪不能直接利用，必须依靠产生胞外酶将大分子物质分解后，才能被微生物吸收利用。胞外酶主要是水解酶，经过加水裂解大分子物质为较小化合物，使其能被运输至细胞内。,水解过程可经过底物改变来证实，如,细菌对大分子淀粉不能直接利用，产生胞外酶,(,淀粉酶,),将淀粉水解为小分子糊精或深入水解为葡萄糖,(,或麦芽糖,),，再被细菌吸收利用，这一过程能够,用碘测定不再产生蓝色来证实；水解明胶可观察到明胶被液化；脂肪水解后产生脂肪酸改变培养基,pH,，其中中性红指示剂使培养基从淡红色变为深红色。,明胶是由胶原蛋白水解产生蛋白质，在,25,以下可维持凝胶状态，以固体形式存在，而,在,25,以上明胶会液化。有些微生物能产生明胶酶，水解明胶蛋白，而使明胶液化，甚至在,4,仍能保持液化状态。,第3页,有些微生物能水解牛奶中蛋白质酪素，石蕊牛奶培养基由脱脂牛奶和石蕊配制而成，是昏浊蓝色，酪素水解成氨基酸和肽后，培养基会变成透明。石蕊牛奶也用于检测,乳糖发酵,，在酸存在下，石蕊会转变成,粉红色,，过量酸可引发牛奶固化（凝乳形成），氨基酸分解会引发,碱性反应,，石蕊变为,紫色,。一些细菌能还原石蕊，使试管底部变为白色。,尿素酶能分解尿素释放氨。尿素琼脂含有尿素、葡萄糖和酚红，酚红在,pH6.8,时为黄色，在培养过程中，产尿素酶细菌将分解尿素产生氨，培养基,pH,升高，在,pH8.4,时，指示剂转变为深粉红色。尽管许多微生物都能够产生尿素酶，不过利用尿素速度比变形杆菌属细菌要慢，所以尿素酶试验被用于从其它,非发酵乳糖肠道微生物中快速区分这个属组员。,第4页,2,IMViC,（吲哚、甲基红、伏普和柠檬酸盐）试验,这四个试验主要是用来快速判别大肠杆菌和产气杆菌，多用于水细菌检验。,吲哚试验,是用来检测吲哚产生，有些细菌产生色氨酸酶，分解蛋白胨中色氨酸，产生吲哚和丙酮酸。吲哚与对二甲基氨基苯甲醛结合，形成红色玫瑰吲哚（红色化合物）。但并非全部微生物都含有分解色氨酸产生吲哚能力，所以吲哚试验可作为一个生物化学检测指标。,大肠杆菌吲哚反应阳性，产气肠杆菌为阴性。,第5页,甲基红试验,是用来检测有葡萄糖产生有机酸，如甲酸、乙酸、乳酸等。当细菌代谢糖产酸时，培养基就会变酸，使加入培养基中甲基红由橙黄色（,pH6.3,）转变为红色（,pH4.2,），即甲基红反应。利用该试验可区分大肠杆菌和产气肠杆菌。这两个细菌在培养早期均产生有机酸，但大肠杆菌在培养后期仍能维持酸性,pH4,，而产气肠杆菌则转化有机酸为非酸性末端产物，如乙醇、丙酮酸等，使,pH,大约升至,6,。所以，,此时加入甲基红指示剂，展现黄色。,大肠杆菌为阳性（红色），产气肠杆菌为阴性（黄色）。,第6页,伏普试验,用于测定一些细菌利用葡萄糖产生非酸性或中性末端产物能力，如丙酮酸。丙酮酸进行缩合、脱羧生成乙酰甲基甲醇，此化合物在碱性条件下能被空气中氧气氧化成二乙酰。二乙酰与蛋白胨中精氨酸呱基作用，生成红色化合物，即伏普试验阳性，不产生红色化合物为反应阴性。,产气肠杆菌为阳性，大肠杆菌为阴性。,硫化氢试验,也是检验肠道细菌生化试验。硫化氢试验是检测硫化氢产生，也是用于肠道细菌检验惯用生化试验。有些细菌能分解含硫有机物如胱氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸等产生硫化氢，硫化氢与培养基中铅盐或铁盐等形成黑色硫化铅或硫化亚铁沉淀物，为硫化氢试验阳性，可用于判别细菌。,产气肠杆菌为阳性，大肠杆菌为阴性。,第7页,3,糖发酵试验,糖发酵试验是惯用判别微生物生化反应，在肠道细菌判定上尤为主要，,不一样细菌含有发酵不一样糖,(,醇,),酶，所以,不一样细菌在分解糖类物质能力上有很大差异，有些细菌能分解某种糖产生有机酸（如乳酸、醋酸、丙酸等）和气体（如氢气、甲烷、二氧化碳等），有些细菌只产酸不产气。比如，大肠杆菌能分解乳糖和葡萄糖产酸产气，普通变形杆菌能分解葡萄糖产酸产气，不能分解乳糖。糖发酵管含有蛋白胨、指示剂（溴甲酚紫）和不一样糖类。当发酵产酸时，溴甲酚紫指示剂可由紫色（,pH6.8,）转变为黄色（,pH5.2,）。气体产生可由发酵管中有没有气泡来证实。,第8页,四、操作步骤,（一）大分子物质水解试验,1,明胶水解试验,（,1,）取,3,支明胶培养基试管，用记号笔表面各管欲接种菌名。,（,2,）用接种针分别穿刺接种枯草芽孢杆菌、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌。,（,3,）将接种后试管置,20,培养,2,5 d,。,（,4,）观察明胶液化情况。,第9页,2,石蕊牛奶试验,（,1,）取,2,支石蕊牛奶培养基试管，用记号笔表面各管欲接种菌名。,（,2,）用接种针分别穿刺接种普通变形杆菌和金黄色葡萄球菌。,（,3,）将接种后试管置,35,培养,24,48h,。,（,4,）观察培养基颜色改变。,石蕊在酸性条件下为粉红色，碱性条件下为紫色，而被还原时为白色。,3,尿素试验,（,1,）取,2,支尿素培养基试管，用记号笔表面各管欲接种菌名。,（,2,）分别接种普通变形杆菌和金黄色葡萄球菌,（两种细菌对尿素分解速度不一样），需要观察,2,次。,（,3,）将接种后试管置,35,培养,24,48h,。,（,4,）观察培养基颜色改变。,尿素酶存在时为红色，无尿素酶时为黄色。,第10页,（二）,IMViC,试验,1,接种与培养,（,1,）用接种针将大肠杆菌和产气肠杆菌分别穿刺接入,2,支醋酸铅培养基中（硫化氢试验），置,37,培养,48 h,。,（,2,）将大肠杆菌和产气肠杆菌分别接入,2,支葡萄糖蛋白胨水培养基（甲基红和伏普试验），置,37,培养,48 h,。,2,结果观察,（,1,）硫化氢试验：培养,48 h,后，观察,黑色硫化铅,产生。,（,2,）甲基红试验：培养,48 h,后，葡萄糖蛋白胨水培养物内加入甲基红试剂,2,滴，培养基变为,红色为阳性，变为黄色为阴性,。,（,3,）伏普试验：葡萄糖蛋白胨水培养物内加入甲液，然后加入等量乙液，用力振荡，置,3715,30 min,加紧反应速度，培养物,呈红色者，为伏普试验阳性。,第11页,（三）,糖发酵试验,1,在发酵管上标明所接种细菌名称。,2,取葡萄糖发酵管,3,支，分别接入大肠杆菌、普通变形杆菌，第三支不接 种，作为对照，另取乳糖发酵管,3,支，一样操作。,3,将接种和对照发酵管置,37,培养,24,48h,。,4,观察发酵管颜色和有没有气泡。,第12页,各试验需接种菌种,:,（,1,）明胶水解试验：枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌,20 2,5 d,（,2,）石蕊牛奶试验：普通变形杆菌和金黄色葡萄球菌,35 24,48 h,（,3,）尿素试验：普通变形杆菌和金黄色葡萄球菌,35 24,48 h,（,4,）糖发酵试验：葡萄糖发酵管和乳糖发酵管：,大肠杆菌、,普通变形杆菌,37 24,48 h,（,5,）硫化氢、甲基红（,葡萄糖蛋白胨水,）和伏普试验,（葡萄糖蛋白胨水）,：,大肠杆菌、产气肠杆菌,37 48 h,第13页,各试验结果判定：,（,1,）明胶水解试验：,明胶液化（），明胶不液化（）,（,2,）石蕊牛奶试验：,酸性条件下粉红色，碱性条件下紫色，被还原时白色,。,（,3,）尿素试验：,红色为尿素酶阳性，黄色为尿素酶阴性,葡萄球菌分解较慢，普通变形杆菌分解较快,（,4,）糖发酵试验：,产酸为黄色,（）,普通变形杆菌，分解葡糖产酸产气，不分解乳糖；大肠杆菌分解乳糖和葡糖产,酸产气,（,5,）硫化氢：,培养基黑色为,H,2,S,阳性,大肠杆菌阴性，产气肠杆菌阳性,（,6,）甲基红,:,加入甲基红试剂，,红色为阳性，黄色为阴性,大肠杆菌阳性，产气肠杆菌阴性,（,7,）伏普试验：先加甲液，再加等量乙液，用力振荡，,37,温箱中保,温,15,30 min,。,红色为阳性，,大肠杆菌阴性，产气肠杆菌阳性,第14页,思索题,1.,为何尿素试验可用于判定变性杆菌属,细菌？,2.,加入一些微生物能够有氧代谢葡萄糖，发酵试验应该出现什么结果？,3.,为何大肠杆菌是甲基红反应阳性，儿产气肠杆菌为阴性？这个试验与伏,-,普试验最初底物和最终产物有何异同？为何会出现不一样？,4.,说明在硫化氢试验中醋酸铅作用，能够用哪些化合物代替醋酸铅？,第15页,
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