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THUMPD3⁃AS1靶向miR⁃877对肝癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响.pdf

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资源描述

1、 靶向 对肝癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响 基金项目:海南省卫生健康行业科研项目()海南西部中心医院肿瘤内科 海南医学院第二附属医院肿瘤内科 海南儋州 海南西部中心医院肿瘤内科卢宏全,黄国定,林 影,张诚胜【摘 要】目的 探讨 反义 ()通过靶向微小()调控肝细胞癌()细胞增殖、迁移和侵袭的潜在机制。方法采用实时荧光定量 检测 在正常肝细胞 和 细胞(、)的表达情况。培养 细胞并分为 组(转染阴性对照序列)、组(转染 干扰序列)、组(转染 干扰序列无关序列)和 组(转染 干扰序列 抑制物)。在线预测结合双荧光素酶报告基因实验验证 和 的靶向关系。采用 法、划痕实验和 小室实验分别评估细胞的增殖、

2、迁移和侵袭能力。检测磷酸化 激酶()和磷酸化信号传导及转录激活因子()的表达。结果与 细胞相比,细胞的 表达升高而 表达降低()。能够结合并负调控 表达。与 组相比,组细胞增殖、迁移和侵袭能力受到抑制()。与 组相比,组细胞增殖、迁移和侵袭能力增强()。组的 和 水平低于 组,而 组的 和 水平高于 组()。结论 通过海绵化 促进 细胞增殖、迁移和侵袭并激活 信号,成为 治疗的潜在靶点。【关键词】肝细胞癌;反义 ;微小;侵袭迁移;激酶 信号传导及转录激活因子()信号中图分类号:文献标识码:文章编号:(),【】(),()(),(),(),()(),()()临床肿瘤学杂志 年 月第 卷第 期 ,(

3、),(),(),(),【】;()肝细胞癌(,)是世界上癌症相关死亡的主要原因之一,每年全球因肝癌死亡人数达 万,世界卫生组织估计 年将超 万。虽然 的治疗方式多样,如经导管动脉化疗栓塞、肝移植、消融、手术切除、分子靶向治疗等,但由于肝内转移加之复发频繁,患者的 年生存率仍然较低。因此,阐明 的发生发展机制,寻找新的治疗靶点,对于改善患者的预后意义重大。作为一种序列超过 个核苷酸的非编码,长链非编码(,)具有染色质修饰、转录、翻译、剪接和表观遗传调控等多种生物学功能,与癌症的发生密切相关。反义(,)也可称为,最早在肺腺癌中被鉴别出来充当肿瘤预后标志物。之后有学者发现 可以与 和 相互作用加速非小

4、细胞肺癌(,)的自我更新;还能够作为致癌因子促进结直肠癌细胞生长。然而尚不清楚 是否能够在 进展中发挥生物学作用。已被 证 明 可 以 通 过 竞 争 性 结 合 微 小(,)调控靶 表达,以竞争性内源性(,)的方式参与癌症发展。我们通过初步在线预测显示 与 存在互补结合位点,作为肿瘤抑制 在 中表达异常。因此,本研究主要探讨 靶向 对 细胞增殖、迁移和侵袭的影响,以期为 的诊断与治疗应用提供新思路,现将研究结果报道如下。材料与方法 细胞和主要试剂正常肝上皮细胞 和 细胞购自中国科学院上海生物化学与细胞生物学研究所,购自美国 公司,培养基、胎牛血清和胰蛋白酶购自美国 公司,、和实时荧光定量 (

5、)试剂盒 购自日本 公司,试剂盒购 自 南 京 曼 夫 特 生 物 科 技 有 限 公 司,兔 源、磷酸化 激酶()和磷酸化信号转导和转录激活因子()一抗及 标记二抗购自美国 公司,条靶向 的小干扰序列(正 义 链:,反义链:;正义链:,反义链:)、序列(正义链:,反义链:)、抑制剂()、模拟物()和 引物均购自通用生物系统(安徽)有限公司。细胞培养和分组 待复苏细胞生长至 汇合时用胰蛋白酶消化传代,达 汇合度更换成无血清培养基进行转染。或 和 或 经 稀释后,与 混合转染细胞。根据转染情况分组为 组、组、组和 组。检测细胞增殖将细胞接种至 孔板,分别在转染后、加入 溶液,培养 后终止反应,波

6、长下用酶标仪测定吸光度值(),根据各孔 值评估细胞的增殖活力。划痕实验 转染后的细胞继续培养,待长满后垂直培养板划一条直线,倒置显微镜下观察并拍 临床肿瘤学杂志 年 月第 卷第 期 ,照;随后加入无血清的培养基,继续培养 后冲洗脱落细胞碎片,倒置显微镜下观察并拍照,分析细胞划痕愈合情况。小室实验待 包被的小室水化后,将 血清重悬后的细胞接种至小室内,小室外腔加入含 血清的培养液 ,后经多聚甲醛固定和结晶紫染色,显微镜下观察并拍照,随机选取 个视野进行计数,评估侵袭情况。总 提取和 提取总,随后反转录合成 并行,反应条件:;,共 个循环。上游引物:,下游引物:;上游引物:,下游引物:;上 游引物

7、:,下游引物:;上游引物:,下 游 引 物:。蛋白裂解缓冲液充分裂解后提取细胞总蛋白。将蛋白样本沸水浴变性后进行,转膜、封闭后孵育一抗(稀释度)过夜,次日孵育二抗(稀释度 ),避光环境中用 显影液显影并在化学发光系统中曝光和拍照,结果表示为目标条带与内参 的光密度比值。双荧光素酶报告基因实验 软件预测 与 存在互补结合位点(种子序列),克隆种子序列及其突变体并插入双荧光蛋白报告基因质粒 构建野生型和突变型报告质粒,与 或 共转染细胞后采用试剂盒检测荧光素酶活性。统计学分析采用 版软件进行统计学处理。数据以均数标准差表示,两组间比较采用 检验,多组间比较采用单因素方差分析。以 为差异有统计学意义

8、。结 果 组织和细胞的 表达情况 数据库(:)分析显示,在 组织中的表达水平中位值为 ,高于正常组织中位值 ()。与 细胞()相比,在 细胞()、()、()和()中的相对表达量升高(),选取 表达上调程度最高的 细胞进行后续功能验证实验。见图。:细胞(与 细胞比较,);:组织(与正常组织比较,)图 组织和细胞的 表达情况 验证 结果显示,组和 组 细胞 相 对 表 达 量 的 差 异 无 统 计 学 意 义(,);组和 组的 相对表达量分别为 和 ,低于 组和 组,差异有统计学意义()。见图。临床肿瘤学杂志 年 月第 卷第 期 ,与 组比较,图 细胞不同转染处理后的 水平 细胞的 表达情况与正

9、常肝细胞()相比,在 细胞()、()、()和()中的的相对表达量降低,差异均有统计学意义()。见图。与 细胞比较,图 细胞的 表达情况 与 的靶向关系 降低了野生型 细胞的荧光素酶活性(),而对突变型细胞荧光素酶活性无显著影响()。组和 组 的相对表达量差异无统计学意义(,),而 组中 相对表达量较 组升高至 ()。见图。:互 补 结 合 位 点;:相 对 荧 光 强 度(与 组 比 较,);:表达水平(与 组比较,)图 靶向调控 的验证 靶向 对细胞增殖和迁移侵袭的影响相较于 组,组 细胞的增殖活力降低,且划痕愈合率()()和穿膜数量 ()个 ()个 减少();组的增殖活力、划痕愈合率()和

10、穿膜数量()个与 组的差异无统计学意义();与 组 比 较,组的增殖活力增强,且划痕愈合率和穿膜 数 量 分 别 增 高 至()和()个,差 异 有 统 计 学 意 义()。见图。靶向 对 表达的影响 组 和 水平低于 组();组和 组 和 水平的差异无统计学意义();组 和 水平高于 组()。见图。临床肿瘤学杂志 年 月第 卷第 期 ,:增殖曲线;:划痕愈合率;:穿膜细胞数;:划痕实验记录图();:小室实验记录图();与 组比较,;与 组比较,图 组 细胞的增殖和迁移侵袭能力评估结果 讨 论 是一种表型和遗传异质性的肿瘤,其发生受多种分子机制驱动。通过多种机制参与调控基因表达,已被证实对 的

11、启动和进展至关重要,可能成为 的潜在治疗靶点。例如,等研究发现 诱导 转录参与肝癌转移灶的形成。中 表达的异常降低与患者侵袭性临床表型以及不良预后相关,同 时 增 强 表 达 可 以 通 过 促 进 泛素化介导的降解引起 信号通路失活,抑制 的上皮间充质转化过程。等研究发现 在有淋巴结转移的 患者中过度表达,其表达与患者 分期显著正相关,同时高表达的 预示 患者更差的预后生存情况。本研究中,我们首先检测了 在 细胞和正常肝上皮细胞 中的表达差异情况,结果显示除了 细胞,在 细胞中均明显高表达,这与 等发现的 在 组织高表达的趋势一致。细胞实验结果显示在 细胞中干扰 则抑制了细胞的增殖、迁移和侵

12、袭能力,提示 对 细 胞 行 为 的 恶 性 发 展 有 促 进 作 用。位于染色体 ,长度为 个核苷酸,是一种新鉴别出来的。目前关于 临床肿瘤学杂志 年 月第 卷第 期 ,:记录图;:蛋白水平;与 组比较,;与 组比较,图 组 细胞的 和 水平 在肿瘤生物学中作用的研究十分缺乏。有学者发现 可以促进肿瘤细胞的增殖,加速 和结直肠癌的发展,还可能在肉桂醛的抑癌过程中发挥作用,。近期的一项研究表明 是膀胱癌自噬相关的具有预后价值的。越来越多的证据指出 可海绵化进而调影响肿瘤进程。目前已有、等 已被证实通过 机制调控 细胞的增殖、转移和耐药等。本研究中我们预测发现 与 存在靶向结合的可能,荧光素酶

13、基因报告实验结果显示 和野生型 转染后细胞荧光素酶活性明显降低;另外,沉默 增加了 的表达。提示 是 的下游靶基因,且受到 的负调控。位于 ,积极参与多种类型肿瘤的生物学过程。已被报道能够与 海绵结合促进 表 达,加 速 血 管 生成。在 进展过程中发挥肿瘤抑制因子功效,最近的研究显示,通过 和 轴 参 与 的肿瘤进展。为进一步探究 是否参与 调控 表型,我们在沉默 的同时抑制 的表达,检测结果显示下调 表达明显缓和了 表达沉默对 细胞增殖、迁移和侵袭的抑制效果。另外,我们还发现下调 表达抑制了 细胞中 和 的磷酸化水平,沉默 并抑制 表达后 和 的磷酸化水平上升,说明干扰 通过增强 表达、抑制 信号通路从而抑制 细胞的恶性表型维持。综上所述,在 细胞中异常过表达,能够通过 机制靶向抑制 并影响 通路活性,调控 细胞的增殖、迁移和侵袭过程,发挥肿瘤促进因子作用。参考文献 ,():,:,():,():,:,:,:,():,():,:,临床肿瘤学杂志 年 月第 卷第 期 ,():,():,():,():,:,:,:,:,():,():,():,:,():,:收稿日期:;修回日期:临床肿瘤学杂志 年 月第 卷第 期 ,

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