THUMPD3⁃AS1靶向miR⁃877对肝癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响.pdf

靶向 对肝癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响 基金项目：海南省卫生健康行业科研项目（）海南西部中心医院肿瘤内科 海南医学院第二附属医院肿瘤内科 海南儋州 海南西部中心医院肿瘤内科卢宏全，黄国定，林 影，张诚胜【摘 要】目的 探讨 反义 （）通过靶向微小（）调控肝细胞癌（）细胞增殖、迁移和侵袭的潜在机制。方法采用实时荧光定量 检测 在正常肝细胞 和 细胞（、）的表达情况。培养 细胞并分为 组（转染阴性对照序列）、组（转染 干扰序列）、组（转染 干扰序列无关序列）和 组（转染 干扰序列 抑制物）。在线预测结合双荧光素酶报告基因实验验证 和 的靶向关系。采用 法、划痕实验和 小室实验分别评估细胞的增殖、迁移和侵袭能力。检测磷酸化 激酶（）和磷酸化信号传导及转录激活因子（）的表达。结果与 细胞相比，细胞的 表达升高而 表达降低（）。能够结合并负调控 表达。与 组相比，组细胞增殖、迁移和侵袭能力受到抑制（）。与 组相比，组细胞增殖、迁移和侵袭能力增强（）。组的 和 水平低于 组，而 组的 和 水平高于 组（）。结论 通过海绵化 促进 细胞增殖、迁移和侵袭并激活 信号，成为 治疗的潜在靶点。【关键词】肝细胞癌；反义 ；微小；侵袭迁移；激酶 信号传导及转录激活因子（）信号中图分类号：文献标识码：文章编号：（），【】（），（）（），（），（），（）（），（）（）临床肿瘤学杂志 年 月第 卷第 期 ，（），（），（），（），【】；（）肝细胞癌（，）是世界上癌症相关死亡的主要原因之一，每年全球因肝癌死亡人数达 万，世界卫生组织估计 年将超 万。虽然 的治疗方式多样，如经导管动脉化疗栓塞、肝移植、消融、手术切除、分子靶向治疗等，但由于肝内转移加之复发频繁，患者的 年生存率仍然较低。因此，阐明 的发生发展机制，寻找新的治疗靶点，对于改善患者的预后意义重大。作为一种序列超过 个核苷酸的非编码，长链非编码（，）具有染色质修饰、转录、翻译、剪接和表观遗传调控等多种生物学功能，与癌症的发生密切相关。反义（，）也可称为，最早在肺腺癌中被鉴别出来充当肿瘤预后标志物。之后有学者发现 可以与 和 相互作用加速非小细胞肺癌（，）的自我更新；还能够作为致癌因子促进结直肠癌细胞生长。然而尚不清楚 是否能够在 进展中发挥生物学作用。已被 证 明 可 以 通 过 竞 争 性 结 合 微 小（，）调控靶 表达，以竞争性内源性（，）的方式参与癌症发展。我们通过初步在线预测显示 与 存在互补结合位点，作为肿瘤抑制 在 中表达异常。因此，本研究主要探讨 靶向 对 细胞增殖、迁移和侵袭的影响，以期为 的诊断与治疗应用提供新思路，现将研究结果报道如下。材料与方法 细胞和主要试剂正常肝上皮细胞 和 细胞购自中国科学院上海生物化学与细胞生物学研究所，购自美国 公司，培养基、胎牛血清和胰蛋白酶购自美国 公司，、和实时荧光定量 （）试剂盒 购自日本 公司，试剂盒购 自 南 京 曼 夫 特 生 物 科 技 有 限 公 司，兔 源、磷酸化 激酶（）和磷酸化信号转导和转录激活因子（）一抗及 标记二抗购自美国 公司，条靶向 的小干扰序列（正 义 链：，反义链：；正义链：，反义链：）、序列（正义链：，反义链：）、抑制剂（）、模拟物（）和 引物均购自通用生物系统（安徽）有限公司。细胞培养和分组 待复苏细胞生长至 汇合时用胰蛋白酶消化传代，达 汇合度更换成无血清培养基进行转染。或 和 或 经 稀释后，与 混合转染细胞。根据转染情况分组为 组、组、组和 组。检测细胞增殖将细胞接种至 孔板，分别在转染后、加入 溶液，培养 后终止反应，波长下用酶标仪测定吸光度值（），根据各孔 值评估细胞的增殖活力。划痕实验 转染后的细胞继续培养，待长满后垂直培养板划一条直线，倒置显微镜下观察并拍 临床肿瘤学杂志 年 月第 卷第 期 ，照；随后加入无血清的培养基，继续培养 后冲洗脱落细胞碎片，倒置显微镜下观察并拍照，分析细胞划痕愈合情况。小室实验待 包被的小室水化后，将 血清重悬后的细胞接种至小室内，小室外腔加入含 血清的培养液 ，后经多聚甲醛固定和结晶紫染色，显微镜下观察并拍照，随机选取 个视野进行计数，评估侵袭情况。总 提取和 提取总，随后反转录合成 并行，反应条件：；，共 个循环。上游引物：，下游引物：；上游引物：，下游引物：；上 游引物：，下游引物：；上游引物：，下 游 引 物：。蛋白裂解缓冲液充分裂解后提取细胞总蛋白。将蛋白样本沸水浴变性后进行，转膜、封闭后孵育一抗（稀释度）过夜，次日孵育二抗（稀释度 ），避光环境中用 显影液显影并在化学发光系统中曝光和拍照，结果表示为目标条带与内参 的光密度比值。双荧光素酶报告基因实验 软件预测 与 存在互补结合位点（种子序列），克隆种子序列及其突变体并插入双荧光蛋白报告基因质粒 构建野生型和突变型报告质粒，与 或 共转染细胞后采用试剂盒检测荧光素酶活性。统计学分析采用 版软件进行统计学处理。数据以均数标准差表示，两组间比较采用 检验，多组间比较采用单因素方差分析。以 为差异有统计学意义。结 果 组织和细胞的 表达情况 数据库（：）分析显示，在 组织中的表达水平中位值为 ，高于正常组织中位值 （）。与 细胞（）相比，在 细胞（）、（）、（）和（）中的相对表达量升高（），选取 表达上调程度最高的 细胞进行后续功能验证实验。见图。：细胞（与 细胞比较，）；：组织（与正常组织比较，）图 组织和细胞的 表达情况 验证 结果显示，组和 组 细胞 相 对 表 达 量 的 差 异 无 统 计 学 意 义（，）；组和 组的 相对表达量分别为 和 ，低于 组和 组，差异有统计学意义（）。见图。临床肿瘤学杂志 年 月第 卷第 期 ，与 组比较，图 细胞不同转染处理后的 水平 细胞的 表达情况与正常肝细胞（）相比，在 细胞（）、（）、（）和（）中的的相对表达量降低，差异均有统计学意义（）。见图。与 细胞比较，图 细胞的 表达情况 与 的靶向关系 降低了野生型 细胞的荧光素酶活性（），而对突变型细胞荧光素酶活性无显著影响（）。组和 组 的相对表达量差异无统计学意义（，），而 组中 相对表达量较 组升高至 （）。见图。：互 补 结 合 位 点；：相 对 荧 光 强 度（与 组 比 较，）；：表达水平（与 组比较，）图 靶向调控 的验证 靶向 对细胞增殖和迁移侵袭的影响相较于 组，组 细胞的增殖活力降低，且划痕愈合率（）（）和穿膜数量 （）个 （）个 减少（）；组的增殖活力、划痕愈合率（）和穿膜数量（）个与 组的差异无统计学意义（）；与 组 比 较，组的增殖活力增强，且划痕愈合率和穿膜 数 量 分 别 增 高 至（）和（）个，差 异 有 统 计 学 意 义（）。见图。靶向 对 表达的影响 组 和 水平低于 组（）；组和 组 和 水平的差异无统计学意义（）；组 和 水平高于 组（）。见图。临床肿瘤学杂志 年 月第 卷第 期 ，：增殖曲线；：划痕愈合率；：穿膜细胞数；：划痕实验记录图（）；：小室实验记录图（）；与 组比较，；与 组比较，图 组 细胞的增殖和迁移侵袭能力评估结果 讨 论 是一种表型和遗传异质性的肿瘤，其发生受多种分子机制驱动。通过多种机制参与调控基因表达，已被证实对 的启动和进展至关重要，可能成为 的潜在治疗靶点。例如，等研究发现 诱导 转录参与肝癌转移灶的形成。中 表达的异常降低与患者侵袭性临床表型以及不良预后相关，同 时 增 强 表 达 可 以 通 过 促 进 泛素化介导的降解引起 信号通路失活，抑制 的上皮间充质转化过程。等研究发现 在有淋巴结转移的 患者中过度表达，其表达与患者 分期显著正相关，同时高表达的 预示 患者更差的预后生存情况。本研究中，我们首先检测了 在 细胞和正常肝上皮细胞 中的表达差异情况，结果显示除了 细胞，在 细胞中均明显高表达，这与 等发现的 在 组织高表达的趋势一致。细胞实验结果显示在 细胞中干扰 则抑制了细胞的增殖、迁移和侵袭能力，提示 对 细 胞 行 为 的 恶 性 发 展 有 促 进 作 用。位于染色体 ，长度为 个核苷酸，是一种新鉴别出来的。目前关于 临床肿瘤学杂志 年 月第 卷第 期 ，：记录图；：蛋白水平；与 组比较，；与 组比较，图 组 细胞的 和 水平 在肿瘤生物学中作用的研究十分缺乏。有学者发现 可以促进肿瘤细胞的增殖，加速 和结直肠癌的发展，还可能在肉桂醛的抑癌过程中发挥作用，。近期的一项研究表明 是膀胱癌自噬相关的具有预后价值的。越来越多的证据指出 可海绵化进而调影响肿瘤进程。目前已有、等 已被证实通过 机制调控 细胞的增殖、转移和耐药等。本研究中我们预测发现 与 存在靶向结合的可能，荧光素酶基因报告实验结果显示 和野生型 转染后细胞荧光素酶活性明显降低；另外，沉默 增加了 的表达。提示 是 的下游靶基因，且受到 的负调控。位于 ，积极参与多种类型肿瘤的生物学过程。已被报道能够与 海绵结合促进 表 达，加 速 血 管 生成。在 进展过程中发挥肿瘤抑制因子功效，最近的研究显示，通过 和 轴 参 与 的肿瘤进展。为进一步探究 是否参与 调控 表型，我们在沉默 的同时抑制 的表达，检测结果显示下调 表达明显缓和了 表达沉默对 细胞增殖、迁移和侵袭的抑制效果。另外，我们还发现下调 表达抑制了 细胞中 和 的磷酸化水平，沉默 并抑制 表达后 和 的磷酸化水平上升，说明干扰 通过增强 表达、抑制 信号通路从而抑制 细胞的恶性表型维持。综上所述，在 细胞中异常过表达，能够通过 机制靶向抑制 并影响 通路活性，调控 细胞的增殖、迁移和侵袭过程，发挥肿瘤促进因子作用。参考文献 ，（）：，：，（）：，（）：，：，：，：，（）：，（）：，：，临床肿瘤学杂志 年 月第 卷第 期 ，（）：，（）：，（）：，（）：，：，：，：，：，（）：，（）：，（）：，：，（）：，：收稿日期：；修回日期：临床肿瘤学杂志 年 月第 卷第 期 ，