SN∕T 5108-2019 国境口岸轮状病毒、星状病毒、诺如病毒、札如病毒四联HRMA检测方法.pdf

书 书 书犐 犆犛 犆 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖犜 国境口岸轮状病毒、星状病毒、诺如病毒、札如病毒四联犎犚犕犃检测方法犇犲 狋 犲 犮 狋 犻 狅 狀狅 犳狉 狅 狋 犪 狏 犻 狉 狌 狊，犪 狊 狋 狉 狅 狏 犻 狉 狌 狊，狀 狅 狉 狅 狏 犻 狉 狌 狊犪 狀 犱狊 犪狆 狅 狏 犻 狉 狌 狊犫 狔狇 狌 犪 犱 狉 犻 狆 犾 犲 狓犎犚犕犃犪 狋犳 狉 狅 狀 狋 犻 犲 狉狆 狅 狉 狋 狊 发布 实施中华人民共和国海关总署发 布书 书 书前言本标准按照 给出的规则起草。本标准由中华人民共和国海关总署提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国拱北海关，深圳市计量质量检测研究院。本标准主要起草人：汪海波、莫秋华、杨泽、兰全学、杨国武、史咏梅、涂承宁、林继灿。犛犖犜 国境口岸轮状病毒、星状病毒、诺如病毒、札如病毒四联犎犚犕犃检测方法范围本标准规定了国境口岸轮状病毒、星状病毒、诺如病毒和札如病毒这四种病毒的检验对象、方法、结果报告、生物安全要求及阳性结果判定。本标准适用于入出境人员携带轮状病毒、星状病毒、诺如病毒、札如病毒的实验室检测。规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 实验室生物安全通用要求 临床诊断中聚合酶链反应（）技术的应用 基因检验实验室技术要求 出入境口岸轮状病毒感染监测规程人间传染的病原微生物名录（中华人民共和国卫生部 年制定）术语和定义下列术语和定义适用于本文件。 轮状病毒犚狅 狋 犪 狏 犻 狉 狌 狊属于呼肠孤病毒科（犚犲 狅 狏 犻 狉 犻 犱犪 犲）轮状病毒属（犚狅 狋 犪 狏 犻 狉 狌 狊） ，其基因组由 个不连续的双链基因片段组成，分别编码种结构蛋白（ ， 、 ）和种非结构蛋（ ） 。轮状病毒有个血清组（） ，其中、组能引起人和动物腹泻。 星状病毒犃 狊 狋 狉 狅 狏 犻 狉 狌 狊属于星状病毒科（犃狊 狋 狉 狅 狏 犻 狉 犻 犱犪 犲）哺乳类星状病毒属（犕犪犿犪 狊 狋 狉 狅 狏 犻 狉 狌 狊） ，为单股正链病毒，基因组长约 ，从端到端包括一个约 个核苷酸的非编码区（ ，） ，三个开放读码框架 、 和 ，一个约 个核苷酸的非编码区和一个大约 个核苷酸的多聚腺苷酸尾。星状病毒是引起婴幼儿、老年人、免疫功能低下或缺失者急性腹泻的重要病原体。 诺如病毒犖狅 狉 狅 狏 犻 狉 狌 狊诺瓦克样病毒犖狅 狉 狑犪 犾 犽 犾 犻 犽 犲狏 犻 狉 狌 狊 犲 狊诺沃克样病毒犖狅 狉 狑犪 犾 犽 犾 犻 犽 犲狏 犻 狉 狌 狊 犲 狊属于杯状病毒科（犆犪 犾 犻 犮 犻 狏 犻 狉 犻 犱犪 犲）诺如病毒属（犖狅 狉 狅 狏 犻 狉 狌 狊） ，为单股正链病毒，基因组长约 ，包括个开放阅读框（ ， ） 、 和 。诺如病毒可分为个型，分别为、 、 、和，其中、 和感染人，是引起成人和婴幼儿急性非细菌犛犖犜 性胃肠炎的重要病原体，全世界范围内均有流行，全年均可发生感染。 扎如病毒犛 犪狆 狅 狏 犻 狉 狌 狊属于杯状病毒科（犆犪 犾 犻 犮 犻 狏 犻 狉 犻 犱犪 犲） ，为单股正链病毒，核酸序列长约 ，包括个开放读码框， 和 。可分为个遗传型，即、 、 、和，除 型感染猪外，其他四型均感染人。 高分辨率熔解曲线分析技术犺 犻 犵 犺狉 犲 狊 狅 犾 狌 狋 犻 狅 狀犿犲 犾 狋 犻 狀 犵犪 狀 犪 犾 狔 狊 犻 狊；犎犚犕犃利用最新一代饱和荧光染料，实现分辨率高达 的熔解曲线精确分析的技术。相对于传统的技术或实时荧光技术而言，操作步骤大大简化，而且无需使用昂贵的探针，时间和成本也降低了不少，并且样品经扩增后直接进行分析，无需转移，真正实现了闭管操作，降低了污染的风险。缩略语下列缩略语适用于本文件： ： ，碱基对； ： ，焦碳酸乙二酯； ： ，高分辨率熔解曲线分析； ： ，聚丙烯酰胺凝胶电泳。检测对象 出入境口岸发现的有呕吐、腹泻和发热等症状疑似腹泻病毒感染的急性肠胃炎病人。 其他申请检验的人员。生物安全和犘犆犚防污染要求实验室生物安全应符合 的规定。按照人间传染的病原微生物名录 ，这四种病毒的危害程度均为第三类，可在生物安全二级实验室进行相关操作。防污染措施按 和 的规定执行。主要仪器本方法所用的主要仪器如下： 二级生物安全柜； 台式高速冷冻离心机（最高离心力 以上） ； 旋涡振荡器； 冰箱：、 和 ； 超净工作台； 微型离心机； 热循环仪（带高分辨率熔解曲线分析模块） ；注：给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可和推荐。如果其他等效产品具有相同的犛犖犜 效果，则可使用这些等效产品。 电子天平（犱） ； 微波炉； 高压灭菌锅； 超纯水器或双蒸水器； 微量可调移液器一套（含以下种规格： 、 、 、 、） 。主要试剂 无酶的水。 引物应为以上级别纯化，引物序列见 。 基础试剂：宝生物工程（大连）有限公司 。注：给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可和推荐。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。 荧光染料。检验程序 样品采集粪便标本和呕吐物标本的采集按照 执行。 实验室检验 样品预处理取黄豆大小约 的粪便标本或呕吐物，或 水样便，加入 的生理盐水，剧烈振荡混匀，制成 的悬液；然后， 离心 ；转移上清至灭菌的干净离心管。不能立即进行检测时，样本冻存于 超低温冰箱备用。 病毒核酸提取 犜 狉 犻 狕 狅 犾法取 预处理好的样本 ，加入 液，振荡混匀后室温静置 ，然后加入 氯仿，盖紧离心管，用手剧烈振荡混匀 后室温静置 ， 离心 ，取上层水相至另一离心管中，加入 异丙醇沉淀，充分混匀后室温放置 ， 离心 ，弃上清液，再加入的 乙醇洗涤一次， 离心 ，弃上清液，室温放置 后加入 水（或其他核酸溶解液）溶解核酸沉淀，分装后于 条件下保存，备用。 试剂盒提取核酸法按适用于病毒基因组提取的商品试剂盒说明书操作。 四重高分辨率熔解曲线检测 引物引物序列分别见表。犛犖犜 表引物序列轮状病毒 正向反向星状病毒 正向反向诺如病毒 正向反向扎如病毒 正向反向注：简并碱基中为或；为或；为或；为或或；为或；为或或。 标准品、阳性对照、阴性对照和空白对照设置检测过程中分别设标准品、阳性对照、阴性对照和空白对照。标准品为克隆的轮状病毒、星状病毒、诺如病毒和札如病毒部分核苷酸序列（必须包含扩增区域在内）在体外转录合成的；阳性对照为留存的这种病毒的阳性样本的核酸或体外转录合成的；阴性对照为正常人大便提取的核酸；空白对照为无菌水。 反应体系组成反应体系组成见表。表反应体系组成组分体积 轮状病毒正反向引物（ ）各 星状病毒正反向引物（ ）各 诺如病毒正反向引物（ ）各 扎如病毒正反向引物（ ）各 模板水 总体积 注：如果其他商品化试剂盒具有相同的效果，亦可使用。 反应条件反应条件为： 反转录 ； 预变性 ； 变性 ， 退火延伸 ， 个循环；设置温度从 逐渐上升至 ，上升速率为 。因不同仪器的性能差异，犛犖犜 可根据条件优化适当调整反应条件。 高分辨率熔解曲线分析用仪器自带的软件对生成的熔解曲线进行分析，将阳性对照阴性对照空白对照样本的熔解曲线同标准品的熔解曲线进行对比。阳性样本的曲线为典型的单一尖峰，而阴性样本的曲线为均一直线，无熔解峰。 检验结果判断及报告当阳性对照的熔解曲线同各标准品的一致，而阴性对照空白对照的为均一直线时才可对样本进行结果判断及报告，否则视为实验失败，需重新实验。本标准检验结果判断及报告如下：）检验样品的熔解曲线同轮状病毒标准品的一致，报告“检出轮状病毒特异性基因（法） ” ；）检验样品的熔解曲线同星状病毒标准品的一致，报告“检出星状病毒特异性基因（法） ” ；）检验样品的熔解曲线同诺如病毒标准品的一致，报告“检出诺如病毒特异性基因（法） ” ；）检验样品的熔解曲线同扎如病毒标准品的一致，报告“检出扎如病毒特异性基因（法） ” ；）检验样本的熔解曲线同空白对照的一致，即为均一直线时，报告“未检出轮状病毒、星状病毒、诺如病毒、札如病毒特异性基因（法） ” 。犛犖犜