土霉素发酵工艺.docx

1 引言
生物工程产品工艺学课程设计，一方面要求综合应用生物、发酵工程、代谢控制发酵工程和CAD制图等课程的理论知识，以掌握微生物发酵中常见的代谢控制方法、产品工艺的设计方法以及设计步骤，另一方面又要根据设计对象的具体特征，凭借设计者的经验（或者借鉴前人的经验），了解设计的诀窍，对设计参数等做合理的选择和优化，这往往成为设计能否成功的关键所在，也是设计区别于习题的重要方面。
1.1 土霉素发展现状
在上世纪60～70年代，土霉素曾经在我国抗菌药市场上占据着重要位置，但自80年代中后期起，土霉素的市场就开始逐渐下滑，大批企业先后放弃了生产。21世纪初，全国土霉素产量已从20世纪80年代的2万吨下降到12000吨，目前的产量已不到1万吨，生产企业从几十个减少到只有几个。目前主要生产企业为石家庄华曙制药、内蒙古赤峰制药、山西星火制药等。其中石家庄华曙制药的规模和产量最大，达6000吨左右，约占世界总产量的1/4。
随着土霉素产量的不断下降，出口量也逐年减少，出口价格一路走低。1995年，我国土霉素出口价格为11.5美元/公斤，1998年为10美元/公斤，2000年已降到7美元/公斤。近年来，出口量和出口价格还在下滑。在国内市场上，土霉素除了作为生产强力霉素等的原料外，主要用于畜禽药物以及饲料添加剂，临床用药微乎其微。在发达国家，土霉素已基本不再使用，发达国家畜牧业中用的也是纯度高的无菌土霉素。我国生产的土霉素大部分为低档产品，未来几年出口形势将十分严峻。
1.2 土霉素的应用
（1）土霉素为四环类抗生素，生产工艺简单、生产成本较低，可作为生产其它新型抗生素的原料。
（2）土霉素价格低廉，可以作为饲料添加剂用于养殖业。实践表明：土霉素用于饲料添加剂，可以改善饲料转化效率，促进畜禽生长，提高畜禽抗疾病能力。
（3）土霉素是广谱抗生素，对多数革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均有抗菌作用。临床上主要用于肺炎，败血症，斑疹，伤寒了，淋巴肉芽肿，砂岩及其他细菌性感染等，对伤寒有效，也可用于阿米巴痢疾和阴道滴虫病患者。此外还能抑制立克次体和砂岩病毒及淋巴肉芽肿病毒 。
2 土霉素及发酵微生物介绍
2.1 土霉素化学式及性状
土霉素又名氧四环素，化学名是：(4s,4аR，5S，5аR，6S，12аS）-N-4-二甲胺基-1，4，4а，5，5а，6，11，12а-八氢，5, 6，10，12，12а- 六羟基-6-甲基-1，11-二氧代并四苯-2-甲酰胺，为灰白色至黄色的结晶粉末，无臭，味苦，熔点是180℃，在空气中性质稳定，在日光下颜色变暗在碱性溶液中易破坏失效。土霉素的盐酸盐为黄色结晶，味苦，熔点190～194℃，有吸湿性，但水分和光线不影响其效价，在室温下长期保存不变质，不失效。盐酸盐易溶于水，溶于甲醇，微溶于无水乙醇，不溶于三氯甲烷和乙醚，在酸性条件下不稳定。添加到饲料中，在室温下保存四个月，效价下降4%～9%，制粒时效价下降5%～7%[1]。
土霉素化学式：C22H24N3O9，R=H，R'=CH3，R''=OH，齐结构示意图如图1-1所示：

图1-1
2.2 作用机理
（1） 改变致病微生物的结构和干扰其代谢过程，如阻碍细胞壁的合成，影响细胞黏膜的通透性，阻碍蛋白质的合成，改变核酸代谢。
（2） 能抑制动物肠道内的有害微生物，激活大肠中有利于营养物质合成的微生物。
（3） 土霉素可使动物肠壁变薄，更有利于营养物质的吸收和利用，从而提高肠道吸收效率。
2.3 发酵微生物
土霉素是由龟裂链霉菌产生的，属于放线菌中的链霉菌属，他们具有良好的菌丝体，菌丝体分支，无隔膜，直径约0.4～1.0米，长短不一，多核。菌丝体有营养菌丝、气生菌丝之分，孢子丝再形成分生孢子。
而龟裂链霉菌的菌落呈灰白色，后期生褶皱，成龟裂状。菌丝成树枝分支，白色，孢子灰白色，柱形。
3 土霉素生物合成的代谢调控
土霉素属于四环素类抗生素，是一大类广谱抗生素，他们的化学结构中都含有二甲氨基，酰胺基，酚羟基和两个含有酮基和烯醇基的共轭双键系统，即都含有氢化直骈四苯的基本结构，具有共同的碳架。四环素类抗生素生物和成及调控过程中，起始的化合物是丙二酰胺辅酶A，它同8个丙二酰辅酶A分子重复缩合脱羧，形成一个直链化合物—β-多酮次甲基链，然后经过重复闭环等反应，形成四环素类抗生素。土霉素代谢调控机制的控制主要有磷酸盐的调节作用、ATP的调节的调节等[2]。
3.1 抗生素的生物合成与糖代谢途径的关系
在某些抗生素发酵过程中，不同时期的糖代谢途径是不同的。从菌体生长期转变为抗生素分泌期，糖代谢途径也发生变化，可见，抗生素的生物合成与糖代谢途径有着一定关系。
四环类抗生素这类聚酮体衍生物的合成，需要还原型辅酶Ⅱ（NADPH），而且NADPH还可能是限制因素，它的浓度大小决定体外醋酸盐进入聚酮体或脂肪酸的数量。但是，NADPH又只是来自戊糖循环，该循环的酶活性的强弱直接影响NADPH的产量，因此，过量的磷酸盐或通气会严重干扰土霉素的合成，使产生NADPH的戊糖循环受阻。
3.2 抗生素的生物合成与三羧酸循环、脂肪酸代谢的关系
已知四环类抗生素的碳架，是由乙酰辅酶A、丙二酰辅酶A合成的。这些前体物质是糖代谢的中间体或衍生物，凡是影响合成抗生素的前体物质形成的反应，都会影响抗生素的生物合成。有些前体物质，不仅可供合成抗生素之用，还可进入三羧酸循环等初级代谢途径而被消耗。乙酰辅酶A既可与草酰乙酸反应形成柠檬酸，然后进入三羧酸循环而被氧化，又可以形成脂肪酸和聚酮体，因此成为代谢途径中的三岔路口，随着菌体代谢机能的差异而调节它的代谢途径。
还原型辅酶Ⅱ（NADPH）的不足可能是产生菌选择合成四环素的途径和停止合成脂肪酸的主要原因。因此，从能量的观点来看，利用丙二酸单位来合成土霉素，对产生菌是有利的。
3.3 抗生素生物合成与生物能量的关系
目前认为，细胞的ATP（或EC）很可能是控制抗生素合成基因表达的一种效应剂，低水平的ATP可能是发酵单位的标志，高水平的ATP可能抑制抗生素的形成。
3.4 抗生素发酵的代谢调控图（见附图1）
4 土霉素发酵工艺
4.1 菌种的选育与制备
用微生物发酵方法生产抗生素，首先要有一个性能良好的菌种，从自然分离的野生菌种由于生产能力低，往往不能满足工业上的需求。所以工业上常用的菌种都是经过人工选育，具备工业生产要求，性能优良的菌种。本设计中，土霉素发酵生产菌株为龟裂链霉菌，属放线菌。
4.1.1 标本采集
土壤是微生物聚集最丰富的场所，菜园和农田耗作层土壤含有丰富的有机物常以细菌和放线菌居多。采土时先用小铲除去表土，取5～15cm深处的土样，选好3～5点，每点取土10g混在一起装入灭过菌的牛皮纸袋，并记录时间、地点、植被等情况，以备考察[3]。
4.1.2 标本的预处理
由于土霉素产生菌龟裂链霉菌属放线菌中的链霉菌属，又由于放线菌的孢子（如链霉菌）更加耐热，所以常采用热处理方法减少材料中的细菌数。
取到的菌样在用土壤、根土组成的培养基中富集培养。要求：9cm直径平皿培养，加入35～45ml培养基，培养基温度在100℃培养1h或40℃培养2～6h。待培养基上长出菌落后，依据龟裂链霉菌菌落外观标准判断。
龟裂链霉菌菌落外观：菌落较小而致密，不易挑取，菌落呈皱状裂纹。孢子丝初旋至螺旋形。孢子长圆形至柱形，表面光滑。 由此可断定为龟裂链霉菌。
4.1.3 所需菌种的分离
筛选抗生素生产菌的方法包括抑菌圈法、稀释法、扩散法、生物自显影法等。
本设计采用稀释法，稀释法又可分为液体稀释法和固体稀释平板倾注法。这里采用后者。先将待分离的材料作一系列的稀释(如1:10、1:100、1:1000、1: 10000……)，然后分别取不同稀释度的溶液少许，与已熔化并冷却至45℃的琼脂培养基相混合摇匀后，倒入灭过菌的培养皿中，待琼脂凝固后，保温培养一定时间即可出现菌落。如果稀释得当，平皿上可出现分散的单个菌落，这个菌落可能就是由一个细菌或微生物繁殖而成的，随后挑取该单个菌落，或重复以上操作数次，便可得到纯培养。
4.1.4 菌种的培养
以麸皮、琼脂作为天然培养基，在37℃保温箱中培养，至培养基中部分出现成熟颜色即可进行保藏。
4.2 诱变育种
从自然环境中分离的菌种的生产能力有限，一般不能满足生产的实际需要。诱变育种是提高菌种的生产能力，使所需要的某一特性的代谢产物过量积累的有效方法之一。
诱变育种的理论基础是基因突变，一般包括诱变和筛选两个部分，诱变育种是诱变和筛选过程的不断重复，直到获得高产菌株。
4.2.1 出发菌株的选择
用来进行诱变的出发菌株的性能对提高诱变效果和效率十分重要，诱变出发菌株要有一定的目标产物的生产能力。由于野生型菌株生产性能较差，通常采用经历过生产条件考验的菌株，这样的菌株队诱变剂的敏感性会有所提高。
4.2.2 菌悬液的制备
在诱变育种中，所处理的细胞必须是均匀状态的单细胞悬液。分散状态的细胞可以均匀地接触诱变剂，又可避免长出不纯菌落。由于在许多微生物的细胞内同时含有几个核，所以即使用单细胞悬浮液处理，还是容易出现不纯的菌落。有时，虽然处理的是 单核的细胞或孢子，但由于诱变剂一般只作用于DNA双链中的某一条单链，故某一突变无法反映在当代的表型上。由于上述原因，故在诱变霉菌或放线菌时，应处理它们的孢子。
在实际工作中，要得到均匀分散的细胞悬液，通常可用无菌的玻璃珠震荡5min，来打散成团的细胞，然后再用脱脂棉过滤，得到分散菌株。菌悬液介质一般用生理盐水。
4.2.3 诱变剂处理
诱变包括物理、化学、生物诱变，本设计利用物理诱变，方法及步骤如下：
紫外线诱变处理：将制备好的菌悬液于无菌培养皿中，置波长为253.7nm，15W的紫外灯下60cm处开盖，进行振荡照射。
4.2.4 突变菌株的筛选
诱变处理后，正向突变的菌株通常为少数，需进行大量的筛选才能获得高产菌株。在抗生素生产菌的选育中，应筛选抗生素抗性突变株。
初筛：选用适合于抗生素产生菌的抑制圈法进行初筛。待筛选的菌株能分泌产生某些能抑制工具菌生长的物质，或能分泌某种酶并将无毒的物质水解成对工具菌有毒的物质，从而在该菌落周围形成工具菌不能生长的抑菌圈。方法：将培养后的单菌落连同周围的小块琼脂用穿孔器取出，以避免其它因素干扰，移入无培养基平皿，继续培养4～5天，使抑制物积累，此时的抑制物难以渗透到其它地方，再将其移入涂布有工具菌的平板，每个琼脂块中心间隔距离为2厘米，培养过夜后，即会出现抑菌圈。抑菌圈的大小反映了琼脂块中积累的抑制物的浓度高低。选择抑制圈大的菌落接入斜面备用。
复筛：将经过初筛后的少数菌株接种于增殖培养基中培养13小时后，接种于锥形瓶发酵培养基中进行往复式摇床震荡培养，即得到药瓶种子。
4.3 菌种保藏
菌种的保藏方法有：斜面菌种低温保藏法、沙土管干燥保藏法、甘油封藏法、真空冷冻干燥法等[4]。本设计采用砂土管干燥保藏法，这种保藏法适用于产生孢子的真丝状真菌和放线菌，或形成芽孢的细菌。
4.3.1 保藏原理及沙土管制备方法
沙土管干燥保藏法的原理是造成干燥的寡营养条的保藏条件。
制备方法：首先将沙和土分别洗净烘干并过筛（一般沙用80目过筛，土用100目过筛），按沙与土比例1～2：1混合均匀，分装于小试管中，分装高度约为1cm左右，121℃高压间歇灭菌2~3次，无菌实验合格后烘干备用。
4.3.2 保藏方法和操作步骤
方法：将需保藏的菌种经斜面培养后用无菌水制成孢子悬液，加入经灭菌处理的沙和土的混合物（或纯沙亦可）作为载体，减压抽去水分，这些吸附有孢子的干燥沙土载体，在低温下保存。
操作步骤：斜面孢子先加灭菌蒸馏水2～2.5ml，沿斜面轻刮孢子后，再吸0.2～0.3 ml到灭菌备用的沙土管中，在真空度100 Pa以下进行干燥，直至沙土管外貌呈松散状态，然后低温（4℃）保存。经真空干燥后的沙土管，最好放在密闭容器内，一般保存期为两年左右[5]。
4.4 培养基的配置
微生物生长、繁殖、代谢和产物合成都需要营养，人工配置的培养基可以为微生物提供所必须的营养，除此之外，培养基还为微生物的生长提供必要的生长环境。
培养基按照用途可以分成孢子培养基、种子培养基和发酵培养基。
4.4.1 孢子培养基
孢子培养基配置的目的是供菌种繁殖孢子的，常采用的是固体培养基。对这类培养基的要求是能使菌体生长迅速,产生数量多而且优质的孢子,并且不会引起菌体变异。①培养基的营养不要太丰富，特别是有机氮源要低一些，否则孢子不易形成。②无机盐的浓度要适当,否则会影响孢子的颜色和数量。③应注意培养基的pH值和湿度。
4.4.2 种子培养基
种子培养基时供孢子发芽、生长和菌体繁殖的。这类培养基碳源应该提供速效碳源如葡萄糖等；氮源也要提供一些易于利用的；磷酸盐的浓度可以适当高一些；总之要相对丰富、完全、并要考虑能够维持稳定的pH值。最后一级种子培养基的成分应该较接近发酵培养基，以便种子进入发酵培养基后，能迅速适应发酵环境。
4.4.3 发酵培养基
发酵培养基既要有利于生长繁殖，防止菌体过早衰老，又要有利于产物的大量合成。要求培养基的组成应丰富、完全，碳、氮源要注意速效和迟效的互相搭配，少用速效营养，多加迟效营养，还要考虑适当的碳氮比，加缓冲剂稳定pH值；并且还要有菌体生长所需的生长因子和产物合成所需的元素、前体和促进剂等。
4.5 培养基的营养要求
4.6.1 水
水是一切生物生存的基本条件，是所有培养基的主要成分，也是微生物机体的重要组成成分。水是良好的溶剂，又是活细胞中一切代谢反应的媒介物，还可以维持细胞中的渗透压，同时，水的比热高，又是热的良导体，能有效地吸收代谢过程中产生的热量，使细胞温度不致于骤然升高，能有效调节细胞内的温度。
4.5.2 碳源
凡能提供微生物营养所需碳元素(碳架)的营养物质称为碳源。碳素是构成菌体成分的主要元素，又是产生各种代谢产物和细胞内贮藏物质的重要原料。抗生素发酵中可选用葡萄糖做为碳源。
4.5.3 氮源
氮源是组成蛋白质和核酸的主要元素，酶自身即为蛋白质。因此，氮源是必不可少的重要原料。常用的有机氮源油花生饼粉、豆饼粉、棉籽饼粉、玉米浆、玉米蛋白粉、蛋白胨、酵母粉等。常用的无机氮源有铵盐、硝酸盐和氨水等。抗生素发酵中多选用玉米浆和黄豆饼粉作为氮源，其中含有的磷酸肌醇对土霉素的生产有积极的促进作用。发酵补料过程中选择用于辅助氮源的氨水。
4.5.4 无机盐类及微量元素
各种微生物在生长繁殖和生产代谢产物中，需要磷、镁、硫、铁、钾等无机盐和微量元素作为酶的激活剂、生理活性物质的组成或生理活性作用的调节剂。
在土霉素发酵中，很容易受到磷浓度的影响，很多此生代谢产物的产生多受磷酸盐浓度的影响，必须严格控制。土霉素发酵中，选用碳酸钙为原料来提供无机盐和微量元素。
4.5.5生长因子和促进剂
酶的生产中所需的生长因子大多由天然原料提供。玉米浆、麦芽汁、豆芽汁和酵母等，含有丰富的生长因子。促进剂是一类刺激因子，它们并不是前体或营养，这类物质加入或可以影响微生物的正常代谢，或促进中间代谢产物的积累，或提高次级代谢产物的产量[6]。
4.6 龟裂链霉菌培养基及其培养条件
斜面孢子培养基：麸皮85%，琼脂15%，水100%
种子培养基(g/L)：KH2PO40.592，黄豆饼粉16.5，葡萄糖4.93，碳酸钙0.15，硝酸钾0.15，玉米油0.236，油酸甘油酯4.02，豆油9.045，硅油0.021。
发酵培养基(g/L)：KH2PO41.63，黄豆饼粉45.30，葡萄糖16.42，碳酸钙0.15，硝酸钾0.15，玉米油0.79，油酸甘油酯3.42，豆油7.53，硅油0.056。
发酵培养基补料(g/L)：油酸甘油酯16.571，豆油19.333，氨水（26%）12.264[6]。
所有培养基都在121℃，0.1MPa灭菌30min。
酸性蛋白酶生产中，种子培养初始温度控制在30ºC左右；发酵全程31-30ºC分段培养。发酵周期为190h。
4.7 种子扩大培养及孢子制备
4.7.1 种子扩大培养
种子扩大培养是指将保存在砂土管、冷冻干燥管处于休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化后，再经过扁瓶或摇瓶及种子罐逐级扩大培养而获得一定数量和质量的纯种的过程。
本发酵属于二级种子罐扩大培养，三级发酵。设计流程如下：
孢子→种子斜面孢子→种子摇瓶→一级种子罐→二级种子罐→发酵罐
4.7.2 制备母液斜面孢子
将保存在冷冻干燥管中的土霉素生产菌，在无菌室超净工作台上接种于已灭菌的斜面培养基上，于 35～36℃培养，取出放入冰箱（2～6℃）保存备用。
4.7.3 制备子瓶斜面孢子
将生长好且在冰箱存放一周以上的母瓶取出，制成菌悬液接种于子瓶斜面上，于 35～36℃恒温室培养，培养好的子斜面，测摇瓶效价合格后保存在2～6℃冰箱中备用。
4.7.4 种子摇瓶
一段时间后，将孢子用无菌水移接到装有种子培养基的三角瓶中，在34～37℃下静置培养40h，待长出大量孢子后，将其孢悬液接入一级种子罐内进行扩大培养[7]。
4.8 发酵工艺控制
微生物发酵生产中，必须研究生产菌种的最佳发酵工艺，如营养要求、培养温度、pH条件、对氧的需求等，据此设计合理的发酵工艺，使生产菌种处于最佳的产物合成条件下，才能取得优质高产的效果。
4.8.1 发酵过程中温度的影响及控制
对微生物发酵来说，温度的影响是多方面的，可以影响各种发酵条件，最终影响微生物的生长和产物形成。
在抗生素发酵中，细胞生长和代谢产物积累的最适温度往往不同。在生长初期，抗生素还未开始合成，菌丝体浓度很低时，以促进菌丝体迅速生长繁殖为目的时，应该选择适于菌丝体生长的温度当菌丝体浓度达到一定程度，到了抗生素分泌期时，此时生物合成成为主要方面，就应该满足生物合成的最适温度，这样才能促进 抗生素的大量合成。
在土霉素发酵中，采用变温控制，种子培养初始温度控制在35±1ºC，发酵阶段发酵温度控制在32～34ºC，在中后期保持较低的温度，以延长抗生素的分泌期，放罐前24h提高2～3ºC培养，能使发酵单位提高[8]。
4.8.2 发酵过程中pH的影响及控制
微生物生长和生物合成都有其最适和能够耐受的pH范围，放线菌生长的最适pH范围是7～8，土霉素发酵用菌种龟裂链霉菌的生长繁殖阶段的最适pH范围与产物形成阶段的最适pH范围是不一致的。其菌体生长最适pH范围：6.0～6.6，产物形成最适pH范围：5.8～6.1。当接种后发酵pH低于6.4时就可以开始通氨，通氨量的多少参考pH值，要求100小时前pH在6.3-6.5，100小时候pH在6.2-6.3，放罐前8小时停止通氨。
一般情况下，培养基成分中(C/N)高，发酵液倾于酸性，pH低；(C/N)低，发酵液倾向于碱性，pH高。pH与通气量的关系是：通气量大，糖、脂得到完全氧化，最后产物为CO2和H2O；如果通气量不足，糖、脂不完全氧化，则产物为中间产物有机酸，这些使培养基pH会不同程度的降低。不同盐的利用对pH也会产生影响，如（NH4）2SO4的被利用则pH下降；而一些生理碱性盐（如NaNO3）的酸根被利用则导致发酵液pH上升；在碳源严重不足，微生物被迫利用氨基酸的碳架，留下NH3，pH亦可能上升。pH的这些变化情况，常常引起细胞生长和生产环境的变化，对生产带来不利影响。因此生产中常采用一些pH的控制方法，通常有：添加缓冲液维持一定的pH；调节通风量维持发酵液的氧化还原电位于一定范围；调节培养基的原始pH，保持一定的(C/N)；当发酵液pH过高时用糖或淀粉来调节，pH过低时，通过氮调节。
4.8.3 发酵过程中CO2的影响及控制
CO2是微生物的代谢产物，同时也是某些合成代谢的一种基质，它是细胞代谢的重要指示。溶解在发酵液中CO2的对氨基酸、抗生素等微生物发酵具有刺激或抑制作用。土霉素发酵中，需要控制一个最佳的CO2分压，才能获得最高产量。可以通过提高通气量和搅拌速率，在调节溶解氧的同时，还可以调节CO2的浓度，通气使溶解氧保持在临界值以上，CO2又可随着废弃排出，使其维持在引起抑制作用的浓度之下；降低通气量和搅拌速率，有利于提高CO2在发酵液中的浓度。
4.8.4 发酵过程中溶氧的影响及控制
发酵中可以改变通风量和搅拌速率，来实现对溶氧的控制。
（1）通风量的影响：发酵过程中，通风量的多少应根据培养基中的溶解氧而定。一般来说，在发酵初期，虽然年轻细胞呼吸强度大，耗氧多，但由于菌体少，相对通气量可以少些；菌体生长繁殖旺盛时期，耗氧多，要求通风量大些；生产旺盛时的通风量因菌种和酶种而定，一般需要强烈通风；但也有例外，通风量的过多反而抑制酶的生成。因此，菌种、酶种、培养时期、培养基和设备性能都能影响通风量，从而影响酶的产量。用于土霉素生产的微生物龟裂链霉菌为好气性微生物，生产上普遍采用自动测定和记录溶解氧的仪表进行控制。土霉素发酵生产过程中，通气比应控制在1:0.8-1.0vvm。
（2）搅拌的影响：对于好气性微生物的深层发酵，除了需要通气外，还需要搅拌。搅拌有利于热交换、营养物质与菌体均匀接触，降低细胞周围的代谢产物，从而有利于新陈代谢。同时可打破空气气泡，使发酵液形成湍流，增加湍流速度，从而提高溶解氧，增加空气用量。当搅拌速度主要因菌体大小而异，由于搅拌产生切应力，易使细胞受损。同时搅拌也带来一定机械热，容易使发酵温度发生变化。搅拌速度还与发酵液粘度有关。土霉素发酵生产过程中，搅拌转速可根据发酵不同阶段的需要进行调整，使溶解氧不低于饱和溶解氧浓度的30%。
4.8.5 发酵过程中泡沫的影响及控制
在微生物好气培养中，发酵液为往往产生许多泡沫，这是正常现象。泡沫的存在阻碍了CO2的排除，影响溶氧量，同时泡沫过多影响添料，也容易使发酵液溢出罐外。因此，生产上必须采取消泡措施。消除可控制泡沫的方法主要包括机械消沫和消沫剂消沫两大类。机械消沫是利用物理作用，靠机械的强烈振动或压力的变化促使泡沫破碎；消泡剂主要是一些天然的矿物油类、醇类、脂肪酸类、胺类、酰胺类、醚类、硫酸酯类、金属皂类、聚硅氧烷和聚硅酮，其中聚甲基硅氧烷最好。我国常用聚氧丙烯甘油醚或泡敌（聚环氧丙环氧乙烷甘有醚）。理想的消泡剂，其表面相互作用力应低，而且应难容于水，还不能影响氧的传递速率和微生物的正常代谢。土霉素发酵中，一般随着菌体生长繁殖旺盛和抗生素的积累而泡沫上升，因此消泡应视具体情况而定。
4.8.6 发酵过程中染菌的控制
在工业发酵中，染菌轻则影响产品的质和量，重则倒罐或停产，影响工厂效益。因此要严格无菌操作，种子灭菌要彻底，净化空气设备，操作要慎重，设备灭菌要彻底。若在前期染菌，应重新灭菌；中期染菌，应偏离杂菌生长条件；后期染菌，可提前或及时放罐。
4.9 发酵工艺流程图（见附图2）
5 土霉素提取工艺
5.1 发酵液的预处理与固液分离
预处理目的是将难溶于水的高价金属离子螯合物溶解，使土霉素以盐的形式溶解到发酵液中。
5.1.1 酸化
（1） 酸化过程：酸化过程常采用草酸酸化，使菌丝中的土霉素释放出来并生成溶于水的盐，并且能析出草酸钙沉淀，从而除去发酵液中的钙离子，同时草酸钙能促进蛋白质的凝结，从而提高滤液的质量。另外，草酸属于弱酸，其对设备的腐蚀性要比硫酸、盐酸好。
（2） pH的控制：加入草酸的目的是释放菌丝中的单位，同时要保证土霉素的稳定性、成品的质量和提炼成本。目前，工业提炼的pH控制在1.6～2.0范围内，pH过高对单位的释放不利，pH过低会影响产品的质量，同时增加产品的成本[9]。
（3） 发酵液的去杂：发酵中存在着许多有机和无机的物质，加入净化剂除去铁离子和蛋白质。去杂过程采用的净化剂是黄血盐和硫酸锌，利用二者的协同效应除去蛋白质，同时除去铁离子。
5.1.2 稀释
将发酵液进行适当的稀释，一般稀释2～3倍，有利于过滤和脱色过程。
5.1.3 过滤
发酵液经过预处理后可以通过板框过滤机进行过滤，实现固-液分离。工业上采用低单位滤液和草酸水洗滤饼以提高收率。
5.2 脱色与结晶
采用122-2树脂对滤液进行脱色，其原理是利用122-2树脂为阳离子交换树脂，处理为氢型树脂后，所带的氢离子与色素蛋白中的氮、氧形成氢键，对过滤液中的色素有吸附作用，可进行脱色。
土霉素脱色液加入碱化剂15%的氨水后，调pH到等电点附近，使土霉素从脱色液中直接沉淀出来。
5.3 分离洗涤与气流干燥
将上述结晶液甩滤后用水淋洗，再甩干，可得到湿晶体。
将的到的湿晶体进行气流干燥，采用进风140～170℃，出风70～80℃的气流进行湿晶体的干燥，便得到土霉素碱成品。
5.4 提取工艺流程图（见附图3）
总结
课程论文设计是培养学生综合运用所学知识,发现、提出、分析和解决实际问题,锻炼实践能力的重要环节,是对学生实际工作能力的具体训练和考察过程。我们必须认真对待，好好把握每一个环节，以一个工程师的要求要求自己，让自己在这种难得的机会中好好历练自己，让自己在学习和思考中充实。
通过这次课程设计使我懂得了理论与实际相结合是很重要的，只有理论知识是远远不够的，只有把所学的理论知识与实践相结合起来，从理论中得出结论，才能真正为社会服务，从而提高自己的实际动手能力和独立思考的能力。在设计过程中遇到的问题，可以说得是困难重重，这毕竟是专业课程的设计，不能有一丝的马虎和不小心。所以，难免会遇到过各种各样的问题，同时在设计的过程中发现了自己的不足之处，对以前所学过的知识理解得不够深刻，掌握得不够牢固。通过这次课程设计之后，一定要把以前所学过的知识重新温故。
这次课程设计终于顺利完成了，在设计过程中遇到了很多问题，最后在贾万利老师的辛勤指导下，还有和做同种设计题目的同学的探讨下终于游刃而解了。这是我们意志、耐力和心灵上的胜利，相信这些都必将成为我们人生的宝贵财富。
在这次课程设计中我学了很多知识，不只是书本上的知识，还有一些生活中的道理，比如做什么事情都要有始有终，要坚持到底。还要加强自己的动手能力，使自己知识更加充实，比如要熟悉掌握Word的操作和AutoCAD绘图的各种技巧。
最后真挚的感谢史楠老师的指导！谢谢！
参考文献
[1] 微生物工程 曹军卫，马辉文编著 北京：科学出版社，2002.8
[2] 代谢控制发酵 张克旭等编著 北京：中国轻工业出版社，2008.5
[3] 《新编生物工艺学上册》 俞俊堂，唐孝宣 北京化学工业出版社 2005
[4] 微生物工程 曹军卫，马辉文编著 北京：科学出版社，2002.8
[5] 《新编生物工艺学上册》 俞俊堂，唐孝宣 北京化学工业出版社 2005
[6] 生物工程工厂设计概论 吴思芳主编 北京：中国轻工业出版社，2008.6
[7] 生物工艺原理 贺小贤 北京：化学工业出版社，2003
[8] 微生物工程 曹军卫，马辉文编著 北京：科学出版社，2002.8
[9] 《新编生物工艺学下册》 俞俊堂，唐孝宣 北京化学工业出版2005