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中药添加剂对高温中猪血清抗氧化功能的影响
宋小珍　毛帅　刘凤华　王恬
（1.南京农业大学动物科学院 南京210095　2.江西农业大学动物科学技术学院 南昌330045
3.北京农学院动物科技系 北京102206）
随着全球气候的逐步变暖，夏季高温高湿气候给规模化养猪生产带来的负面影响相当严重。热应激是畜禽在外界高温环境刺激下所出现的全身性非特异反应。在热应激状态下，猪体内自由基大量产生，细胞膜流动性下降，膜功能受损，对营养物质的吸收转运能力下降(Gerald Karp,2005)。目前国内外关于应激的调控，大都使用化学添加剂如电解质、镇静剂、抗生素、维生素、微量元素等，多数是治标不治本，且容易出现毒副作用和药残（李英哲等，2001；徐荷等，1997）。中药添加剂是以中医药理论为指导， “以调为本，以平为期”，在组方时注重从平衡阴阳、全面调节畜禽机体免疫力入手；且其具有独特的天然性，毒副作用小，在调控畜禽热应激综合症上应用前景广阔。但目前有关中药添加剂抗应激的研究大多集中在对畜禽生产性能的影响上，有关中药添加剂对热应激中机体抗氧化能力的调控作用鲜见报道。
　　超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase, GSH-Px)是机体的两大抗氧化酶系统，对清除体内过量的自由基，维持氧自由基代谢的平衡起着重要的作用；丙二醛（malondialdehyde,MDA）是脂质过氧化反应链式终止阶段产生的小分子产物，其含量可以间接反映自由基的产生情况和机体组织细胞的脂质过氧化程度（李继红等，2003）。本试验试图通过观察高温下添加抗应激中药饲料添加剂，对高温环境下猪血液中SOD、GSH-Px、MDA等一些与自由基有关的生化指标的动态影响，研究并探讨中药添加剂对猪的抗应激效果及机理。
1．材料与方法
1.1试验材料
1.1.1实验地点：中国农业科学院畜牧研究所动物营养重点实验室人工气候室。
1.1.2实验动物：64只35日龄、体重6.50±1.05Kg的中国试验用小型猪（CEMP，农大I系）, 常规免疫。购自中国农业大学昌平试验猪场。
1.1.3中药添加剂： 方1：由石膏、藿香、苍术、黄柏按等比例组成。方2：由石膏、藿香、苍术、黄柏按0.5：1：1：1比例组成。
1.1.4试验基础日粮组成及营养水平见表1。

表1　基础日粮组成及营养水平

原料（Ingredients）　组成/%（Comp osition）
营养成分（Nutrient levels）　　　　含量(Content)
玉米（Corn ）　　　　　52.0
消化能DE/(MJ·kg-1)　　　　　　　　13.89
豆粕（Soybean meal）　13.0
粗蛋白CP/%　　　　　　　　　　　　　20.00
鱼粉（Fish meal）　　　6.0
钙Calcium/%　　　　　　　　　　　　0.95
乳清粉（Whey）　　　　6.0
总磷(Total Phosphorus)/%　　　　　　0.70
膨化大豆（Expanded soybean）16.0
有效磷(Available Phosphorus)/%　　　0.49
小麦麸（Wheat bran）　　　3.0
赖氨酸(L-L ys)/%　　　　　　　　　　1.35
预混料（Premix）　　　　4.0
蛋+胱氨酸(Met + Cys)/%　　　　　　　0.66

　　注：4% 预混料为每千克全价料提供Cu 200mg、Fe 120mg、Zn 120mg、Mn 50mg、Co 2.0mg、Se 0.3mg、I 0.45mg、维生素A 800IU、维生素D31 800IU、维生素E 30IU、维生素B11.8mg、维生素B2 6mg、维生素B12 0.024mg、叶酸0.3mg、生物素0.44mg、烟酸3.2mg、胆碱800mg。
1.1.5主要试剂、实验仪器：SOD、GSH-Px、MDA测试试剂盒，南京建成有限公司。紫外－可见分光光度计UV-2000。
1.2 试验动物分组
本试验采用农大小型实验猪64头，按窝别、体重相近原则分成4组，分别为常温对照组（简称对照组）、高温应激组（简称应激组）、中药添加剂1组（简称方1组）和中药添加剂2组（简称方2组）。每组4个重复，每重复4头猪。
1.3 饲养管理
预饲期，各处理组猪的饲养水平、环境完全相同，试猪自由采食和饮水。正式试验期间，各组实验猪均饲养于人工气候室中（对照组的饲养环境温度设为23℃恒温，应激组和两个中药方剂组的饲养环境温度根据前期试验得出的热应激模型设温为26℃~40℃循环变温，见图1），各处理组的环境湿度、设置完全一致（详见表2试验设计）。各处理基础日粮完全相同，自由饮水。其中，中药添加剂1组和2组在基础日粮上按0.5%添加中药添加剂方1和方2。
表2　试验设计

处理(treat)
日粮(diet)
环境温度（environmental temperature）
对照组(NTC)
基础日粮(basal diet)
温度(T)：23℃；湿度(H)：60%；光照度(L)：100LX
应激组(HTS)
基础日粮(basal diet)
温度(T)：26~40℃；湿度(H)：60%；光照度(L)：100LX
方1组
(CMAΙ)
基础日粮(basal diet)+0.5％中药添加剂1(Chinese medicine additives Ι)
温度(T)：26~40℃；湿度(H)：60%；光照度(L)：100LX
方2组
(CMAⅡ)
基础日粮(basal diet)+0.5％中药添加剂2(Chinese medicine additivesⅡ)
温度(T)：26~40℃；湿度(H)：60%；光照度(L)：100LX

人工气候舱温度曲线如图1：
图1　人工气候室温度曲线
（X轴为时间0：00－22：00，Y轴为温度0－45℃）

1.4 样品采集与制备
在热应激正式试验第1、2、4、6、10天从每重复中选1只小猪（每组4只），颈静脉采血10ml，静置（离心）析出血清，于-20℃箱中保存备用。
1.5测试指标与方法
SOD : 羟胺法；GSH-PX：DTNB 直接法； MDA: TBA(硫代巴比妥酸)法。采用分光光度计检测。
1.6 统计分析
采用SAS软件分析平均数、标准差，多重比较方差分析。
2 结果与分析
2.1中药添加剂对热应激猪血清SOD活性的影响
表3中药添加剂对热应激猪血清SOD活性的影响　　　单位：活力单位/毫升（U/ ml）

天数（d）
处理(treat)
1
2
4
6
10
对照组(NTC)
50.91±0.98b
51.51±8.19
52.88±5.51
50.48±5.18
50.06±5.19
应激组(HST)
65.06±4.57a
44.14±3.13
48.98±4.58
53.06±2.61
53.83±8.07
方1组(CMAΙ)
56.35±13.48ab
44.82±5.04
49.46±3.62
44.78±5.08
54.79±6.95
方2组(CMAⅡ)
62.76±2.96a
51.17±5.88
51.69±4.41
50.31±4.41
51.74±4.67
注：同一列中相同字母表示差异不显著（p>0.05）；不同字母表示差异显著（p<0.05）。以下表均同。
由表3可知，各组试猪血清中SOD活性变化主要表现在应激后第1天。与对照组相比，应激组在第1天显著升高，而后逐渐下降，到第10天又有所回升，但不出现显著差异（p>0.05）。方1组的SOD活性与对照组和应激组间均无显著差异（p>0.05）。方2组的SOD活性显著高于对照组（p<0.05），与应激组之间无显著差异（p>0.05）。
2.2中药添加剂对热应激猪血清MDA含量的影响
表4? 中药添加剂对热应激猪血清MDA含量的影响
单位： n mol/ ml

天数（d）
处理(treat)
1
2
4
6
10
对照组(NTC)
3.18±0.95
2.99±0.83
2.59±1.01
3.62±0.07b
3.58±0.33b
应激组(HST)
3.15±1.41
3.55±1.02
3.42±0.25
4.85±1.29a
5.19±1.15a
方1组(CMAΙ)
3.33±0.97
2.19±1.18
3.09±0.87
4.92±0.37a
4.28±0.41b
方2组(CMAⅡ)
2.93±0.66
3.46±0.48
3.15±0.95
4.13±0.10ab
4.10±1.16b
表4的结果得出，各组猪血清中MDA含量的差异主要表现为试验后第6、10天。与对照组相比，应激组血清中 MDA值在第6、10天时表现出显著升高（p<0.05）。方1组在第6天显著高于对照组，第10天显著低于应激组（p<0.05）。方2组在第6天MDA含量介于对照组和应激组之间，与两者差异均不显著（p>0.05）；第10天显著低于应激组（p<0.05），其余时间不呈现显著差异（p>0.05）。
2.3中药添加剂对热应激猪血清GSH-PX活性的影响
表5? 中药添加剂对热应激猪血清GSH-PX活性的影响
单位：酶活力单位/毫升（U/ ml）

天数（d）
处理(treat)
1
2
4
6
10
对照组(NTC)
1259±46
1271±156b
1283±411
1195±238b
1151±314b
应激组(HST)
1262±129
1239±96b
1221±100
1681±183a
1559±268a
方1组(CMAΙ)
1282±154
1616±187ab
1406±190
1565±28a
1572±255a
方2组(CMAⅡ)
1225±232
1799±381a
1306±221
1480±177ab
1402±82ab
　　表5的结果表明，应激组血清中GSH-PX活性在第6和10天显著高于对照组（p<0.05）；方1组在第6、10天显著高于对照组（p<0.05）。方2组在第2天GSH-PX活性显著高于应激组（p<0.05），在第6、10天介于对照组和应激组之间，与两者差异均不显著（p>0.05）。
3. 讨论
3.1 高温应激对猪血清中SOD、GSH-PX活力及MDA含量的影响
　　本实验结果显示，高温应激后猪血清中MDA含量显著高于常温组，这表明高温应激加速了机体组织的脂质过氧化过程，产生了较多的有害物质丙二醛（MDA）。同时，研究也发现试猪血清中SOD、GSH-PX活力在应激后出现明显增高，这可能是机体氧自由基大量产生刺激了体内的自由基清除系统，一定程度上激活了机体的抗氧化酶系统功能。徐荷等（1997）研究热应激对ＳＤ大鼠 SOD 活性的影响发现，热应激后SOD活性升高，持续热应激后SOD活性下降。Balázs Borsiczky（2003）报道，受热初期，随着机体应激反应，脂质过氧化活动的增强，自由基诱发了抗氧化酶的表达，SOD活性也随之升高，这是机体的一种代偿保护作用，但持续受热后，SOD活性则受到抑制。本试验也发现，应激后期血清中SOD活性出现下降趋势，但差异不显著。许燕等（2000）也报道，应激过程中，机体产生的自由基大量增加，同时机体自由基清除系统的活性也增高，随着应激时间的延长，尽管清除系统活性增加，但仍不足以及时将大量的自由基清除织造成了机体氧化和抗氧化的失平衡，从而使细胞破坏，造成组织损伤。但本研究对血清中SOD和GSH-PX两种抗氧化酶活性动态分析发现，两种酶的变化规律并不一致，SOD活性在前期显著上升，后期下降；但GSH-PX活性却在应激后期出现明显增高，其原因是否与两者的作用机制有关，尚需要进一步研究。
3.2 中药添加剂对应激状态下猪血液抗氧化功能的影响
　　本研究结果显示，与应激组相比，添加中药添加剂2后，猪血液中MDA含量出现显著下降；同时，SOD、GSH-Px活性在应激后期有下降趋势，其活力值介于常温组和高温组之间。这说明中药添加剂2能增强机体清除自由基的能力，调控机体抗氧化酶系统功能，使其保持正常水平。方1组对以上指标也有一定调控作用，但效果低于方2。这表明在调控热应激状态下猪血清抗氧化功能上，中药添加剂2的效果优于中药添加剂1。
　　本试验中两个中药添加剂组成均为石膏、苍术、黄柏和藿香等，其主要功效为清热泻火、燥湿健脾，解表和中，主要用于缓解动物在夏季高温高湿环境中出现的热应激病症。中药药理研究证明，石膏属清热泻火药，善清气分实热，常用于肺胃大热，高热不退等实热亢盛证。研究表明，生石膏可抑制发热中枢而起解热作用。藿香重在化湿，和中止痛，解暑。苍术属燥湿药（朴世浩，1996）；黄柏具有清湿热，泻火毒，退虚热的作用，以除下焦湿热最佳（王衡奇，2001）。黄柏对应激性胃溃疡有抑制作用且对水浸捆束小鼠SOD活性的降低有明显的抑制作用（吕燕宁，2006）。四药合用可通过促进肠道分泌，抑制有害肠道菌群，清除肠道有害自由基等途径加强对高温环境下机体膜结构和功能的保护。但方1中石膏比例较方2高。石膏的变化主要在于剂量变化导致君药不同。方1以石膏为君药，主要针对北方高温干燥气候，变化急骤，发自阳明，重在清气；方2针对南方湿热气候，藿香、苍术为主，重在健脾化湿、祛湿。本试验结果发现方2效果优于方1，分析可能人工气候室各参数设置与南方夏季高温高湿的气候接近有关。
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