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淀粉酶菌株的选育、发酵工艺的研究和酶的纯化
摘要：淀粉酶是最早用于工业生产并且迄今仍是用途最广、产量最大的酶制剂产品之一，为了提高淀粉酶的生产水平，首先通过淀粉培养基从土壤中筛选出产淀粉酶的活性菌株，对菌株初步鉴定后进行紫外线诱变，筛选出产量高、性状优良的突变菌株，再用正交试验的方法对其发酵条件进行优化，实验最后采用硫酸铵沉淀法初步纯化发酵得到的淀粉酶并对酶活性进行了测定。
关键词：淀粉酶；分离筛选；紫外线诱变；优化；提纯
1、 引言
淀粉酶是能够分解淀粉糖苷键的一类酶的总称，包括α-淀粉酶、β-淀粉酶、糖化酶和异淀粉酶，是最早用于工业生产并且迄今仍是用途最广、产量最大的酶制剂产品之一。淀粉酶种类繁多，特点各异，在造纸、印染、酿造、果汁和食品加工、医药、洗涤剂、工业副产品及废料的处理、青贮饲料及微生态制剂等多种领域具有广阔的用途。
我国是传统的农业大国，发展淀粉深加工工业是解决当前淀粉生产积压的好出路，而几乎所有淀粉深加工工业的基础都是以淀粉质原料的水解作为第一步，因此淀粉质原料的液化情况直接关系到产品后期的加工工艺和产品的质量。所以，改进淀粉液化工艺也是降低生产成本，提高产品市场竞争能力的一种重要手段。
显然，改进淀粉液化工艺首要任务就是提高淀粉酶的生产水平。
那如何提高淀粉酶的生产水平呢？我们知道，现在淀粉酶主要来源于植物和微生物，并通过发酵完成生产，因此筛选出高产、稳定的淀粉酶产生菌是淀粉酶生产的头等大事。本文试图从土壤中分离出产淀粉酶的枯草杆菌，通过紫外线诱变育种及发酵条件优化来得到高产、稳定的淀粉酶产生菌株，并对发酵得到的淀粉酶进行初步提纯，以达到加深对发酵工程上游技术中菌种选育的认识、掌握紫外线诱变育种的原理和方法、了解发酵条件对产物形成的影响、熟悉发酵条件的优化方法、掌握分光光度法测液化型淀粉酶活力的基本原理和方法、掌握初步纯化淀粉酶的方法的实验目的。
2、 材料与方法
2. 1 实验材料
2．1．1 样品：贵师大综合楼附近的土壤
2．1．2 培养基和试剂：淀粉培养基、牛肉膏蛋白胨（斜面）、牛肉膏蛋白胨（液体）种子培养基、淀粉酶发酵培养基、生理盐水、碘液、2％可溶性淀粉、硫酸铵、乙酸溶液、磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液、标准糊精溶液
2．1．3 仪器设备：全自动高压灭菌锅、培养皿、恒温培养箱、超净工作台、恒温摇床、离心机、分光光度计、恒温水浴锅、移液管、PH试纸、吸耳球、玻璃棒、量筒、试管、试管架、酒精灯、电子天平、三角烧瓶、洗瓶、接种针、接种环、直尺、记号笔等。
2. 2 实验方法
2．2．1 细菌的分离与初步鉴定：将土壤系列稀释，把10-3 、 10-4、10-5分别涂布到淀粉培养基上，27℃倒置培养2天，将长出的菌落接入斜面。将细菌从斜面接种到淀粉培养基培养2天，用碘液染色，记录透明圈大小和菌落直径，计算D/d值。保菌供下次实验用。
2．2．2 紫外线诱变育种：取活化后的菌种配成菌悬液、稀释；倒淀粉培养基平板，将菌悬液涂布其表面；用紫外线处理平板0、2min、4min、6min、8min、10min，每个处理2次重复；放到黑暗中倒置培养，37℃培养48h，分别计数诱变组和对照组平板上的菌落数，并计算致死率；加入碘液，分别测量诱变组和对照组菌落的透明圈直径和菌落直径，计算D/d值；将D/d值最大的菌种保存到斜面培养基上。
2．2．3 生产菌株摇瓶发酵条件的优化
2．2．3．1 培养基初始pH值和装液量对产酶的影响：用1mol/L盐酸或1mol/L氢氧化钠调节培养基pH值，使培养基的pH值为5.0、7.0、9.0，分装至250mL三角瓶中，每瓶25mL，灭菌，冷却后编号1、2、3，再接种，37℃下恒温摇床培养48h（摇瓶装液量分别30％、40％、50％），最后测定发酵液酶活。

编号
处理项

1号
2号
3号
PH

5
7
9
装液量

30％
40％
50％
A660
10-1

10-2

2.2.3.2 培养基碳源对产酶的影响：在不含可溶性淀粉的培养基中，分别加入0.5％的各种碳源（可溶性淀粉、葡萄糖、蔗糖），以硝酸铵作为唯一氮源，进行碳源对产酶的影响的发酵试验。
处理
结果

可溶性淀粉
葡萄糖
蔗糖
A660
10-1

10-2

2.2.3.3 正交试验设计：通过三因素两水平的正交试验对高产菌的发酵条件进行优化，建立高产菌株的最佳摇瓶发酵条件。
因
素
处
理

接种量
淀粉含量
蛋白胨含量
处理一
3％
5g/L
5g/L
处理二
3％
10g/L
10g/L
处理三
5％
5g/L
10g/L
处理四
5％
10g/L
5g/L
2．2．4 淀粉酶的初步提纯及酶活性的测定
2.2.4.1 淀粉酶的初步提纯：收集发酵液，3000r/min离心10min，去除菌体，在上清液中加入65％饱和度的硫酸铵，待硫酸铵充分溶解后于4℃盐析2h，然后5000r/min离心20min，得到初步纯化的淀粉酶。
2.2.4.2 标准曲线的制作和酶活性的测定：将可溶性淀粉稀释成0.2％、0.5％、1％、1.5％和2％的稀释液，按下表进行标准曲线的制作和酶活性的测定。
管号
1
2
3
4
5
6
7．1
7．2
7．3
7．4
淀粉稀释液/mL
2（0％）
2（0.2％）
2（0.5％）
2（1％）
2（1.5％）
2（2％）
2（2％）
2（2％）
2（2％）
2（2％）
缓冲液/mL
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
40℃水浴保温5min
蒸馏水/mL
1
1
1
1
1
1
0
0
0
0
粗酶液/mL
0
0
0
0
0
0
1
1
1
1
40℃水浴保温30min，然后加入0.5mol/L乙酸10 mL，混均吸取反应液1 mL
碘液/mL
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
A660（平均值）

（7．1、7．2、7．3、7．4中加入的粗酶液，即为正交试验设计中处理一、处理二、处理三、处理四所得的淀粉酶液）
注：①前6组的数据用于标准曲线的制作：以淀粉浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，作标准曲线；②后4组的数据用于酶活性的测定：测得吸光度后，可从标准曲线中查出相应的淀粉浓度，求出被消耗的淀粉量，这里的酶活即为每毫升粗酶液于40℃，PH6.0的条件下，每小时液化可溶性淀粉的毫克数【mg可溶性淀粉/mL·h】。
3、 结果与分析
3. 1 菌落的形态特征
菌落在以淀粉为唯一碳源的分离培养基中生长，培养48 h形成白色圆形菌落，菌落背面乳白色，边缘不光滑，形态规则，质地较密，有透明圈，无沉淀。
3. 2 计算D/d值
3．2．1 分离筛选时，大部分菌落水解圈都粘连在一起，无法准确测得D/d值，只得到少部分数据:
单菌落
透明圈直径/mm(D)
菌落直径/mm(d)
D/d
①
4.0
3.0
1.3
②
14.0
7.1
2.0
表A 透明圈直径和菌落直径及比值

分析：无法准确测得D/d值，可能是所采土样中产淀粉酶的细菌含量较多，涂平板之前稀释倍数不够导致单菌落过于密集，水解圈粘连；也可能是实验操作不当所致。
3．2．2 紫外诱变后，得到单菌落的透明圈直径和菌落直径及比值：
单菌落
透明圈直径/mm(D)
菌落直径/mm(d)
D/d
①
4.8
3.0
1.6
②
6.4
5.5
1.2
③
14.8
7.4
2.0
④
16.0
4.9
3.3
⑤
11.8
4.5
2.6
⑥
9.8
4.0
2.5
⑦
25.0
5.0
5.0
⑧
8.8
4.0
2.2
⑨
14.0
7.8
1.8
分析：通过结果，可看出经过紫外诱变后，有的菌株产酶活能力有所提高，有的减小，筛选产酶活能力最高的菌株，保存供后续试验使用。我们挑⑦号菌，将其保存到斜面培养基上供后续试验使用。
3. 3 计算菌株紫外诱变的致死率
对菌株分别用紫外线处理，得到下表：
诱变时间/min
菌落数/个
致死率(平均值)
0
980
0
2
10-1
306
63.3％
10-2
414
4
10-1
124
82.3％
10-2
223
6
10-1
25
96.7％
10-2
40
8
10-1
5
99.3％
10-2
9
1 0
0
100％

由此数据，可作出紫外线诱变的致死曲线

分析：由图可知，淀粉酶菌株对紫外线比较敏感，而且致死率与诱变剂剂量存在正相关。当紫外线照射时间为6min时，致死率为96.7％，进一步提高照射
时间，则致死率随之上升，当照射10min时，致死率为100％ 。一般认为，进行紫外诱变时，致死率为95％左右时突变效果最好 。因此，紫外线诱变的最适剂量为6min。
3. 4 菌株发酵条件的优化
3．4．1 培养基初始pH值和装液量对产酶的影响：

编号
处理项

1号
2号
3号
PH

5
7
9
装液量

30％
40％
50％
A660
10-1
无
无
无
10-2
无
无
无
分析：未得到数据的原因有三点：①操作不当，可能是取液过程中加错体积，也可能是将试管序号弄混了；②将发酵液从摇床取出的过程中有少量溢出，导致浓度降低，影响实验结果；③发酵过程中有杂菌产生，发酵液被污染了。
3．4．2 培养基碳源对产酶的影响：
处理
结果

可溶性淀粉
葡萄糖
蔗糖
A660
10-1
0．011
0．969
0．645
10-2
0．164
1．268
1．204
分析：由上表数据可知，培养基的碳源为葡萄糖时酶活性最大。从而得出结论：三种碳源中最佳碳源是葡萄糖。

3．4．3 标准曲线的制作：

分析：标准曲线的精确度不高，原因主要有三点：①淀粉浓度为0.5%时，A660明显偏高，可能是稀释淀粉的时候操作不当所致；②在测酶活时，还未等到分光光度计稳定就开始读数，造成测量结果有误差；③由于操作失误，忘记每个试管做平行测量，造成测量结果不精确。
3．4．4 正交试验酶活力的测定
试管编号
1（对照）
7．1
7．2
7．3
7．4
A660
0
0.004
0.047
0.019
0.063
酶消耗的淀粉浓度（%）
0
1.999
1.930
1.953
1.975
酶活力（mg /mL·h）
0
39.98
38.60
39.06
39.50
表1

试验号
因素
酶活力（mg /mL·h）
A
B
C
1
1
1
1
39.98
2
1
2
2
38.60
3
2
1
2
39.06
4
2
2
1
39.50
表2 试验结果分析

分析：对正交试验结果进行方差分析，可知最佳培养基配方为A1B1C1，即接种量3%、淀粉含量5g/L、蛋白胨含量5g/L。
3. 5 淀粉酶的初步提纯
正交试验得到酶液分别加入65％饱和度的硫酸铵，待硫酸铵充分溶解后于4℃盐析2h，然后5000r/min离心20min，去除上清液，再加水稀释测酶活。
试管编号
1（对照）
7．1′
7．2′
7．3′
7．4′
A660
0
0.015
0.097
0.049
0.033
酶消耗的淀粉浓度（%）
0
1.981
1.849
1.926
1.952
酶活力（mg /mL·h）
0
39.62
36.98
38.52
39.04
表3

分析：实验的目的旨在掌握初步纯化淀粉酶的方法和进一步掌握分光光度法测液化型淀粉酶活力的基本原理和方法。表3 A660和表1相比，7．1′、7．2′、7．3′均比表1大，7．4′却比表1小，可能是加水稀释时混合不均匀所致。
4、 讨论
本实验的设计方案具有一定的理论依据，如果操作得当，各方面条件满足，会得到产淀粉酶的枯草杆菌高产菌株，及该菌株的最佳摇瓶发酵条件。但操作过程存在很多缺陷，主要问题有：①分离筛选淀粉酶菌株时，稀释度不够导致水解圈粘连；②在进行pH值和装液量对产酶影响的实验过程中，取液操作不当，将试管序号都弄混了；③发酵过程中有杂菌产生，发酵液被污染；④制作标准曲线时，由于操作失误，忘记每个试管做平行测量，造成测量结果不精确；⑤在测酶活时，还未等到分光光度计稳定就开始读数，造成测量结果有误差；⑥由于考虑到时间的限制，实验过程中分离时的复筛及突变后的复筛都没做，若要得到精确可靠的实验数据，应该操作完善。

此外，紫外线诱变育种简便易行、对条件和设备要求较低并能较好地提高代谢产物的产量，故在微生物育种中仍广泛应用 。但实验中发现紫外线诱变存在很大的不确定性，为使诱变效率提高，运用分子生物学技术对菌株进行基因操作和定向改造，会使菌株选育朝着快捷、高效的方向发展。
以上几点可以作为今后该实验改进的几点建议，及操作过程中应注意的问题。
附录
（一）、培养基的配制
1、淀粉培养基：蛋白胨10g，氯化钠5g，牛肉膏5g，可溶性淀粉2g，蒸馏水1000mL，琼脂20g，pH 7.2
2、牛肉膏蛋白胨培养基：蛋白胨10g，氯化钠5g，牛肉膏3g，蒸馏水1000mL，琼脂15~20g，pH7.0~7.2
（二）、试剂
1、碘液：碘0.022g，碘化钾10g，先用少量蒸馏水使碘完全溶解后定容至250 mL，置于棕色瓶中待用。
2、2%淀粉溶液：称取2g淀粉，在少量水中调匀后倾入沸水中，加热煮沸至透明为止，冷却后定容至100ml。
3、磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液：称取磷酸氢二钠4.52g和柠檬酸0.807g，用蒸馏水溶解并定容至100mL，配好后应以酸度计校正pH。
4、标准糊精溶液：称取糊精0.06g，在少量水中调匀后倾入90 mL沸水中，冷却后定容至100ml。